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1、第四章 微生物的营养与培养基,教学内容：微生物的六种营养要素微生物的营养类型营养物质进入细胞的方式培养基,微生物同其他生物一样，需要不断从外界环境中吸收生命活动所需的物质，以合成自身的细胞结构物质和提供机体生理活动所需的能量。营养物质(nutrient)能够满足机体生长繁殖和完成各种生理活动所需要的物质。作用：参与细胞组成；构成酶的活性成分及物质运输系统；提供能量。,第一节 微生物的6种营养要素,C,H,O,N,P,S占细胞干重的97%主要以有机物、水和无机盐形式存在；组成微生物细胞的化学元素来自于微生物生长所需营养，供给营养物质中应包括这些元素；一般地说，细胞含有某种元素的量越高，需求量就越
2、大。6大营养要素：碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子、水,一、碳源,凡能提供微生物营养所需的碳元素的营养源。碳源物质用来构成细胞结构物质或为机体提供生理活动所需的能量。包括无机碳源（CO2、碳酸盐等）和有机碳源（通常也是能源）。,微生物的碳源,二、氮源,合成细胞结构物质及代谢产物中含氮物质的营养源。包括 有机氮源：蛋白质及降解产物（胨、肽、氨基酸）、尿素 无机氮源：铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、分子氮等。氨基酸异养型：需要从外界吸收现成的氨基酸作为氮源；氨基酸自养型：可以自行合成所需要的一切氨基酸。常用玉米浆、豆饼、花生饼及人工制取的蛋白胨、牛肉膏、铵盐、硝酸盐。,三、能源,为微生物生命活动提供最初
3、能量来源的营养物质或辐射能。氧化有机物（碳源）化能异养型微生物 氧化无机物化能自养型微生物 辐射能光能营养型微生物,四、无机盐,为微生物提供除C,N以外的各种重要元素。包括磷酸盐、硫酸盐、氯化物及含金属元素的化合物。大量元素：生长所需浓度为10-310-4 M，如:P,S,K,Mg,Ca,Na,Fe；微量元素：生长所需浓度为10-610-8 M，如:Cu,Zn,Mn,Mo,Co微量元素的生理功能主要是参与酶的组成或活性。需量微小，通常不需要另行添加。,五、生长因子,某些微生物不能从普通的碳源、氮源物质合成，必须另行加入少量才能进行正常代谢的有机物质。包括维生素、氨基酸、碱基、甾醇等。需量很小，
4、可向培养基添加酵母膏、牛肉膏、玉米浆、麦芽汁等。,六、水,在活细胞中水含量高达细胞总量的6095（芽孢占40），对维持细胞形态具有重要作用；细胞内外的物质须溶解在水中才可吸收和分泌；参与生化反应：许多酶促反应必须在水溶液中进行；在许多生化反应中作为反应物或产物；作为热的良导体，有效吸收细胞代谢中放出的热量并将热散发出去。,第二节 微生物的营养类型,微生物根据生长所需要的碳源可分为：自养型生物 异养型生物 根据能量来源分为：光能营养型生物（如：微藻、蓝细菌、光合细菌）化能营养型生物,微生物的四种营养类型,光能异养型,例如：红螺菌利用异丙醇为供氢体2(CH3)2CHOH+CO2 2CH3COCH3
5、+CH2O+H2O,化能异养型微生物根据所利用的有机物的特性，分为腐生型和寄生型。四种营养类型的划分并不是绝对的，在一定条件下可以转变。,细胞壁简单排阻细胞膜选择透性不需要载体蛋白参与：单纯扩散 不耗能量：协助扩散（促进扩散）需要载体蛋白参与 被运输物质分子不发生化学变化：主动运输 耗能 被运输物质分子发生化学变化：基团转位,第三节 营养物质进入细胞的方式,一、单纯扩散,物质由高浓度的胞外环境向低浓度的胞内扩散。物质扩散的动力是该物质在膜内外的浓度差，运输的速率随膜内外浓度差的降低而减少，最终达到动态平衡。运输速率取决于浓度差、物质的极性及分子大小；一般分子量小、脂溶性、极性小的营养物质易吸收
6、；温度高时易运输。运输的物质主要有水、O2、CO2、某些氨基酸分子、甘油等亲水性分子、某些离子等少数物质。不能进行逆浓度运输不是物质运输的主要方式。,二、促进扩散,与单纯扩散的区别：溶质的运输须借助于膜上的特异性载体蛋白的参与，对被运输物质具有高度的专一性【透性酶】。通过载体蛋白，将营养物质由高浓度的胞外环境向胞内运输，最终达到动态平衡。通过载体蛋白分子的构型变化来完成。不能逆浓度运输。,促进扩散,三、主动运输,与促进扩散的区别：物质的运输需耗费代谢能，可以进行逆浓度运输；运输的速率不依赖于膜内外的浓度差。载体蛋白分子的构型变化需耗能，能量来自于ATP水解等。微生物生长繁殖所需的各种营养物质运
7、输的主要方式。,3种运输方式的比较：各自对应？,四、基团转位,与主动运输的区别：物质在运输过程中发生了化学变化【一种特殊的主动运输】。主要是厌氧和兼性厌氧微生物用于单糖、双糖、核苷、脂肪酸的运输。如大肠杆菌对葡萄糖的吸收磷酸烯醇式丙酮酸己糖磷酸转移酶系统（PTS）：由四种蛋白质组成（酶I、酶II、酶III、HPr）,基团转位,PEP 酶I HPr 酶III Py 酶I HPr 酶III,P,P,P,基团转位,四种运输营养物质方式的比较：P94 表4-5,第四节 培养基,培养基（medium）：人工配制的、适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。,一、配制培养基的原则,1、培养基必须满足微生
8、物的各种营养需求 培养自养微生物的培养基应由简单的无机物组成 如：氧化硫杆菌的培养基配方：硫粉 10g,MgSO47H2O 0.5g,(NH4)2SO4 0.4g,FeSO4 0.01g,KH2PO4 4g,CaCl2 0.25g,H2O 1L,培养异养型微生物的培养基中应含有微生物所需的各种有机物质。异养菌常用含糖基质为碳源，氮源以消化蛋白（如蛋白胨）、铵盐、硝酸盐为宜，尿素也可，有些需添加生长因子。,常用培养基（记住）,普通细菌培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，水 1L，pH 7.0-7.2放线菌培养基：高氏一号合成培养基酵母菌培养基：麦芽汁培养基霉
9、菌培养基：查氏合成培养基；马铃薯培养基海洋异养菌培养基：2216E培养基 蛋白胨 5g，酵母膏 1g，FeSO4 0.1g，陈海水 1L（或水2 NaCl），pH 7.6,马铃薯培养基,马铃薯 20g 蔗糖 2g 自来水 100mL 琼脂 2g pH 自然（约6.0）灭菌 115C，20min 马铃薯处理方法:马铃薯去皮，切成块加水，煮沸30min（注意火力的控制，可适当补水），用纱布过滤，滤液加糖，补足水至100ml，装入三角瓶。,褐藻酸钠培养基,褐藻酸钠溶于1L水中，调节pH值至7.0-7.2，继而溶入以下成分：NaNO3 2g;KCl 0.5g;MgSO47H2O 0.5g;FeSO46
10、H2O 0.01g;KH2PO4 1g;NaCl 30g;琼脂 20g,2、注意各种物质的浓度与配比,营养物质在浓度合适的条件下才表现出良好的作用，浓度大反而产生抑制作用。从营养贫瘠的环境中分离微生物，需用营养成分较低浓度的培养基培养。,部分海洋细菌要求在营养贫瘠的培养基上生长。在一般营养较丰富的培养基上，有的细菌于第一次形成菌落后即迅速死亡，有的则根本不能形成菌落。这类海洋细菌在形成菌落过程中因其自身代谢产物积聚过甚而中毒致死。,营养物质的配比会影响微生物的生长繁殖及代谢产物的形成。如：碳氮比。一般培养基中C/N（原子摩尔比）100/0.5-2 速效、迟效氮源的比例。速效（硫酸铵、蛋白质水解
11、产物等）利于机体的生长，迟效（蛋白质）利于代谢产物的形成。,3、选择合适的培养条件,细菌、放线菌一般为中性和微碱性（pH 7.0-7.5)；酵母菌、霉菌则偏酸（pH 4.5-6.0)。微生物大量产酸时，向培养基中添加缓冲剂或不溶性碳酸盐（CaCO3)。大量产碱时，可添加NaHCO3从自然环境中分离微生物时，应注意尽量与微生物的原始条件一致，如盐度、渗透压、温度等。,4、生产成本,工业发酵时，应考虑培养基的配制成本。可采用野生植物原料（富含淀粉质）及植物秸秆（纤维素、木质素等）、造纸厂废液（戊糖及短小纤维）、发酵废弃物（酒糟、酱渣）、食品加工废弃物（鱼浆蛋白）及其它废弃物（糠、麸皮、豆腐渣、甘蔗
12、渣、棉籽皮、花生壳、豆粕）。综合利用、变废为宝。,二、培养基的种类,按成分分为：合成培养基：对其组分完全了解，如：天然培养基：含有化学成分不完全了解的组分（天然有机物）按物理状态分为：固体培养基（琼脂1.52.0%）：微生物分离、鉴定、计数、保藏半固体培养基（琼脂0.20.7%)：观察运动特征、鉴定、保藏液体培养基：大规模生产发酵,琼脂 agar,从石花菜、江篱中提取的胶体多糖（红藻多糖），基本组成为硫酸半乳糖。40C凝固，96C融化。细菌一般不会利用,琼 脂,利用海洋细菌产生的多糖降解酶可制备琼胶寡糖，具有抗病毒、抗凝血、抗肿瘤活性。琼脂糖凝胶电泳,科研与生产中常用的凝固剂有琼脂、明胶、硅胶
13、。硅胶适合分离自养微生物。另外，一些天然的固体基质，如土豆块、胡萝卜条、馒头块、桔子皮等制成固体培养基。,按用途分为：基础培养基加富培养基（营养培养基）鉴别培养基选择培养基,基础培养基,满足一般微生物生长繁殖需要的基本营养基质。又名普通培养基如牛肉膏蛋白胨培养基,加富培养基,在基本培养基中加入特殊营养物质，如血清等，用以培养要求苛刻的微生物。又名营养培养基。,鉴别培养基,用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入某种特殊的化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种微
14、生物与其他微生物区分开来。如醋酸铅培养基。,选择培养基,是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。酵母菌分离：培养基可适当加入抗生素，如氯霉素、链霉素、新霉素或卡那霉素，抑制细菌生长。阿须贝（Ashby）培养基：分离固氮菌,大肠杆菌在EMB培养基上的菌落形态,鉴别培养基,大肠杆菌O157：H7在快速鉴别培养基上的菌落特征山梨醇麦康凯琼脂（左）37 C培养24h，典型大肠杆菌O157：H7菌落扁平，透明或半透明，边缘光滑，呈淡褐色中心，直径约2mm；梅里埃O157显色培养基（右）37 C培养24h，典
15、型大肠杆菌O157：H7菌落显蓝色。,大肠杆菌O157：H7在科玛嘉O157显色培养基上的菌落特征 37 C培养24h，典型大肠杆菌O157：H7菌落显紫红色，而普通大肠杆菌为蓝色菌落。,TCBS 培养基,硫代硫酸钠柠檬酸盐胆汁盐蔗糖培养基,CHROMagar（科玛嘉）弧菌显色培养基,科玛嘉弧菌显色培养基的灵敏度比传统培养基高，副溶血性弧菌会呈现紫红色；霍乱弧菌及创伤弧菌呈蓝色，溶藻弧菌为无色；其他的肠杆菌科细菌及革兰阳性的细菌不会生长。,单核增生李斯特氏菌在科玛嘉显色培养基上的菌落特征。在科玛嘉李斯特氏菌显色培养基上37C培养24-48小时，出现蓝色菌落，菌落周围有一不透明环。,单核增生李斯
16、特氏菌,单核增生李斯特氏菌在牛津琼脂（左）和PALCAM琼脂（右）的菌落特征。单核增生李斯特氏菌在两种琼脂上35 C培养24-48小时，出现灰绿色菌落，菌落周围有一黑色环。,发酵过程可分为6部分：1、配制微生物扩大培养和产物生产的培养基；2、培养基、反应器及附属设备的灭菌；3、培养数量充足的种子；4、发酵生产；5、产物提取和纯化；6、废物的排放。,补充材料：微生物发酵工艺,微生物发酵工艺流程：,种子罐,摇瓶,斜面,发酵罐,培养液,细胞分离,菌体,原料,培养基,灭菌,废液排放,无细胞培养液,产物提取,纯化,包装,批量发酵装置,批量发酵装置,名词解释：生长因子 主动运输 基团转位 鉴别培养基 选择培养基,作 业,
