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1、第四章,愈伤组织培养,胡萝卜愈伤组,织,1,愈伤组织概念：,组织培养中，利用特定的条件，促,使原已分化并具有一定功能的植物,细胞脱离原来的发展轨道，失去原,有的状态和功能而成为能进行活跃,分裂的一团细胞，称为愈伤组织。,愈伤组织的相关概念,愈伤组织培养：,将母体植株上的各个部分切下作为外值体，接种到无菌的培养基上，,进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。,2,第一节,愈伤组织的诱导,郁李的愈伤组织,3,再分化,：,愈伤组织在一定的培养条,件下又可以经过胚胎发生形成双极性,的胚状体，或经过器官发生形成单极,性的芽或根，进而重新形成完整的植,株，这后一段过程一般称为再分化。,脱分化,：一个已停止
2、分裂的成,熟细胞转变为分生状态，并形,成未分化的愈伤组织的现象。,细胞的全能,性的体现,4,一、愈伤组织形成的条件,外植体,（,explant),培养条件,(condition of,culture),?,诱导愈伤组织的成败关键主要不是,实验材料,，而是,培养,条件,，其中,激素的成分和浓度,是最重要的因素。,5,1,、外植体的选择,一般情况下：,?,双子叶植物,比,单子叶和裸子植物容易,?,幼年细胞和组织比成年的容易,?,二倍体细胞比单倍体细胞容易,?,同一种植物不同基因型诱导愈伤组织的能力也不,相同,（,24,个水稻抗稻瘟病单基因鉴别品系悬浮细胞系的建立，,14.3%97.1%,周晓罡等，
3、西南农业学报，,2008,年,03,期,）,6,2,、培养条件,?,生长素：,2,4-D,、,NAA,、,IAA,等,?,细胞分裂素,：,6-BA,、,KT,、,ZT,等,7,二、愈伤组织的形成过程,(,王凯基等,1981,）,图,3-2,油橄榄愈伤组织形成过程中各期细胞形态和,RNA,含量变化,8,（一）诱导期（起动期）,诱导期又称起动期，指细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成,的起点。,9,Callus arising from leaf,tissue,Callus arising from vascular,tissue,From root,From embryo culture,10
4、,Photo indicating where the,callus(c)arises from,11,外植体细胞在完整植株中随着细胞的分化过程而逐,渐停止分裂，开始执行它们各自不同的功能。外植,体细胞一般处于静止状态，称为,静止细胞,。,12,1,、特点,细胞的气体交换迅速增加,。,多聚核糖体不断增加,：,截止,M,期前，每个细胞中的,RNA,含量增加到,300,；,蛋白质发生周期性的积累：,每个分裂细胞的总增加量,约为,200,；,酶活力也发生一定的变化,：,DNA,聚合酶活力增加、,与代谢有关的酶类，如己糖激酶和一些脱氢酶的活力也增加。,细胞的大小,基本没有变化。,13,2,、,诱导期的
5、长短,?,内部：植物的种类、生理状况,?,外部：光照、,外源激素,因素决定。,?,最常用的有,2,，,4,D,、,NAA,、,IAA,和细胞分裂素等。,?,组织的机械损伤,也作为一种刺激因素诱导细胞开始分裂，,愈伤组织往往出现在伤口处。,?,有些天,然提取物,对愈伤组织的诱导和维持十分有益，常用,的有椰子汁（,10,），,0.5,的酵母提取物，,5,10,的番,茄汁。,Yeoman,和,Mitchell(1970),指出了核仁是生长物质的作,用部位。,改善,14,（二）分裂期（,Cell division,）,外植体,(explant),中已分化的活细胞在外源激素的作用下，外植,体,外层细胞,
6、出现了分裂，由于外层细胞的迅速分裂使得这些细,胞的体积缩小，逐渐回复到分生组织状态，因此也称为,回复变,化。,15,1,、分裂期细胞的特征,外层细胞进行分裂，而中间的细胞不分裂。,细胞的数目迅速增加。,胡萝卜组织培养,7d,后，,细胞数可增加,10,倍。,每个,细胞平均鲜重下降,。,细胞体积小,，内无液泡。,核和核仁增大到最大,。,RNA,含量减少，而,DNA,含量保持不变。,随着细胞不断分裂和组织生长，组织的总干,重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的,合成极快。,16,细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织,的结构，颜色浅而透明,。,2,、愈伤组织的特征,17,（三）分化期（,Differen
7、tiation,）,停止分裂的细胞发生生理,代谢变化而形成由不同形,态和功能的细胞组成的愈,伤组织。,18,?,分化结构的形成过程加速,，超过了回复变化。,?,外层细胞的分裂逐渐减慢，甚至停止，为次生,生长所代替，大量次生结构出现。,?,在这时期中细胞的伸展和分裂处于平衡，故细,胞的平均大小往往没有变化。,1,、分化期特点,19,胡萝卜愈伤组,织,2,、愈伤组织的特点,生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，有光,泽；也有浅绿色或绿色；老化的愈伤组织多转,变为黄色甚至褐色。,Friable,松脆易碎的,Hard/lignified callus,20,Callus may have a yell
8、ow,white,green or,red(,anthocyanin,花青苷,),appearance.,21,第二节,愈伤组织发生的形态学和细胞学,烟草愈伤组织在,8,周培养期间形态的变化,（自桂耀林）,22,1,、色泽：,一般为淡黄色、绿色或白,色，亦可为红色。,影响因素：,葡萄糖的水平，可溶,性淀粉的存在，缺氮、温度、光,及外源激素等营养物质和环境因,素,。,黑暗中培养的烟草愈伤组织,魔芋愈伤组织,菠萝的愈伤组织,一、形态学,23,Callus exuding sticky poly-saccharides,2,、质地,?,疏松,?,致密,Rhizogenic callus,Friabl
9、e,松脆易碎的,Hard/lignified callus,Callus types,转,换,2,4-D,（备注）,有机态的还原态氮,铵态氮,细胞悬浮系,24,二、细胞学,图,3-4,图解示致密愈伤组织和疏松愈伤组织,(A),致密愈伤组织,(B),疏松愈伤组织,1.,巨大的,细胞,2.,管状细胞,3.,大的胞间隙,?,愈伤组织并非完全由薄壁细胞组成。,?,不同类型的愈伤组织在细胞组成上有明显不同。,?,在长期培养过程中，愈伤组织细胞会发生染色体数目或结构的变,化及基因突变：染色体出现多倍体和非整倍体,组培快繁的障碍,育种提供基础,25,第三节,愈伤组织培养中的形态发生,及体细胞胚胎发生,（一）
10、细胞的分化（维管组织）,（二）器官的分化,一、愈伤组织培养中的形态发生,二、体细胞胚胎发生,26,（一）细胞的分化,1,、在培养中，已观察到的细胞类型,薄壁细胞,分生细胞,管胞,色素细胞,石细胞,纤维细胞,等，,其中以,维管组织（特别是木质部）的分化最为常见。,27,2,、影响维管组织分化的主要因素,?,激素,?,生长素：,起到主要的作用，低浓度刺激木质部分化。,?,激动素：,?,可以增加愈伤组织中管胞形成的比例；激动素和生长素协同增,效作用,?,BAP,，,2-iP,和,ZT,也有一定的作用，但没有证据证明他们的普遍性。,?,蔗糖,?,在丁香的组织培养中，当生长素浓度不改变而变化蔗糖浓度时，
11、,在蔗糖浓度为,1.5,2.5,的范围时，愈伤组织内仅形成木质部；,超过,4,时则几乎完全为韧皮部；在,2.5,3.5,时，既形成木质部,也形成韧皮部。,?,物理因素：,研究较少。光、温度对木质部的形成有一定的影响。,28,（二）器官分化,1,、,通过器官发生途径产生再生植株的基本方式,有,3,种,（,konar,等，,1972,）,芽,根,植株,：,普遍,愈伤组织,根,芽,植株：,根有抑制芽,产生的影响,根和芽,植株,29,2,、影响因素,?,激素,?,2.4-D,与,KT,：,比例较高时，有利于茎的形成，反之，有利于根的形成。,?,赤霉素（,GA3,）：,抑制烟草、紫雪花（,Plumbag
12、o indica,）秋海棠,（,Begonia,）及水稻的器官分化。,GA3,的完全抑制作用只发生在黑暗条,件下。,?,乙烯：,对芽的分化有一定作用，作用方向与植物种类和处理的时间有关,。,?,物理因素,?,光强、光质和光周期：,一般光强为,1000,15001x,，光周期,12,16h,，,近紫外和蓝紫光促进芽的发生，而红光显著促进长根。,?,温度,：,25,左右的培养温度适于器官发生，但接近于植物原产地的生,长温度对培养物更有利。,30,（,1,）胚状体：,高等植物的体细,胞在一定条件下所诱导形成的胚，,称为体细胞胚，即所谓的胚状体。,二、体细胞胚胎的形成,1.,体细胞胚胎发生的几个概念,
13、（,2,）胚状体形成的,5,个阶段：,原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷,形胚和子叶期。,31,（,3,）由胚状体形成完整植株，与不定芽和根发生相比，有以下三,个特征：,第一、具有两极性，,即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端,分化芽端与根端，而不定芽或不定根都为单向极性,;,第二、,胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联,系，,而不定芽或不定根往往与愈伤组织的维管组织相联系；,第三、,胚状体的维管组织的分布是独立的“,Y,形,，而不定芽的维管,组织无此现象。,32,2,、愈伤组织中胚状体特征,?,二极性,?,在组织培养的器官发生过程中，愈伤组织是一团无极性分化的细胞团，器官分化,
14、中芽或根分化只是具单极性，而胚状体在分化初期就具胚根和胚芽两极，具明显,的形态特征上的极性（,Polarity,）类似于合子发育中的种子结构。,?,生理隔离,（,physiological isolation,）：,?,指体细胞胚与母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，胚状体与周围组织间,形成缝隙，处于较独立的状态，尽管细胞组织间仍有胞间连丝存在，这是体细胞,胚获得营养，激素及能量来源的通道，其后这些细胞趋于解体。,?,遗传稳定,?,胚状体起源于单细胞或细胞团，在其产生和发育过程中，一旦形成即通过了分化,过程，结构即稳定无需较长时间的脱分化与再分化过程，细胞变异的频率较低，,成苗率较高，遗传
15、稳定性好。,?,重演受精卵形态发生的特征,?,诱导阶段所形成的原胚或原胚团，要转入无激素的培养基中，使它进一步分化发,育，经历球形胚，心形胚，鱼雷形及子叶形体胚的发育阶段。,33,3.,愈伤组织中胚状体发生的部位,?,可来自于外植体或愈伤组织表面的单细胞：较为常见,?,可以发生在愈伤组织的内部。,34,4.,体细胞胚胎发生的方式,（,1,）由外植体直接分化成胚，中间不经过愈伤,组织阶段,?,如石龙芮再生植株茎表面长出不定胚，槐树种子的子叶在,组织培养过程中，可在切口处产生愈伤组织的同时，在子,叶组织中分化出体细胞胚等。,（,2,）外植体先愈伤化，然后由愈伤组织表面分,化形成体细胞胚。,35,5
16、.,影响体细胞胚胎发生的主要因素,（,1,）外植体不同植物的基因型不同，在培养条件下形成,体细胞胚的反应各异。,?,如柑橘类，胡萝卜及矮牵牛等容易诱导体细胞胚，但烟草却难以发生,体细胞胚。,?,柑橘类中的甜橙易于胚胎发生，而宽皮橘较难，各种植物种子的子叶,一般易于发生胚状体。,（,2,）生长调节物质：主要是生长素,?,在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，每,个步骤需要一种不同的培养基。,?,愈伤组织的建立和增殖所需的是一种含有生长素的培养基，通常,所用的生长素是,2,4-D,，浓度范围,0.5,1mg/L.=,胚性细胞团,-,继代培养不能形成胚。再转入生长素含量极低或没有
17、的培养基,上,=,胚,36,（,3,）氮源,?,无机态的,NH4+,有利于胚胎发生。,?,有机态的氮：椰乳，酵母提取液、水解酪蛋白，其使,用的浓度多在,400mg/L,左右。,（,4,）其他因子,?,据,Brown,等（,1976,）报道，在野生胡萝卜中，,高浓度,的钾,（,20mmol/L,）是胚胎发生所必需的。,?,在培养基中,溶解氧的含量,应低于一个临界值,（,1.5mg/L,）,否则将有利于生根，而不利于成胚。,?,另外，培养过程中的环境条件,如光照，温度，对外植,体的预处理如辐射，低温及离的等都会影响胚状体的发,生。,37,三、人工种子,（,artificial seed,）,1,、
18、概念：,?,人工种子是指通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的,材料，外面还被有特定物质，在适宜条件下可以发芽成苗的植物幼体。,2,、人工种子主要使用二倍性的体细胞胚,3,、存在一些问题,首先，一些具重要性状的植物基因型目前发生体细胞胚的能力较弱，再生系统,尚不健全，难以形成有活力的胚并同步化发育；,其次，已经制作出来的人工种子的生产成本远高于自然种子；,再者，人工种子的贮藏，运输及机械化播种等问题尚未解决。,38,39,40,?,加快了园艺植物新品种和良种繁育速度,?,培养无病毒苗木,?,获得倍性不同的植株,?,克服远缘杂交困难,?,保存种质资源,?,提供育种中间材料,?,诱发和离体筛选突变体；,?,制造人工种子,第四节,愈伤组织培养的应用,41,1,解释下列名词,:,脱分化、再分化、胚状体、细胞全能性,2,在诱导脱分化与再分化时，对植物生长物质有何要求？,3.,愈伤组织的形态发生有哪些途径？比较各途径形成的,植株之区别？,4,愈伤组织诱导对外植体有何要求？,5,、学习了愈伤组织的形成及其影响因素后，你有什么启,发？,复习思考题,42,细胞分裂,素和生长,素使用浓,度之间的,关系。,细,胞分裂素,/,生长素,43,
