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1、实验七：SOD的含量测定,一、超氧化物歧化酶的基本特性及生理功能,1、超氧化物歧化酶的组成 超氧化物歧化酶是一种能催化超氧阴离子发生歧化反应的金属酶，按金属辅基不同分为三类：Cu,Zn-SOD Mn-SOD Fe-SOD,2、超氧化物歧化酶的生理功能（1）延缓由于自由基侵害引起的衰老现象（2）治疗由自由基损伤而诱发的疾病（3）消除肌肉疲劳（4）提高人体的抵抗力,蛋白质含量测定方法,定氮法紫外分光光度法双缩尿法（Biuret法）Folin酚试剂法（Lowry法）考马斯亮蓝法（Bradford法）其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵1020倍，比Biuret法灵敏100倍
2、以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。,在选择方法时应考虑的几点因素,实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。,一、紫外分光光度法,蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸
3、光度与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。,二、双缩脲法（Biuret法）,双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成
4、紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。,三、Folin酚试剂法（Lowry法）,此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，
5、从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。进行测定时，加F olin酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼
6、酸磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20-250mg。,四、考马斯亮兰法（Bradford法）,1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸
7、（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。,SOD含量的测定,实验目的,学习考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理。掌握考马斯亮兰法测定蛋白质含量的实验技术。,本实验采用考马斯亮蓝G-250法测定SOD浓度。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色，它和蛋白质通过范德华力（Van der wals bond）结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beers law）。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质
8、的量。,280nm,275nm,实验原理,仪器：电子天平、紫外分光光度计、小烧杯、容量瓶、玻璃比色皿、洗瓶、试管、滤纸、擦镜纸、移液管试剂：超氧化物岐化酶、考马斯亮蓝G-250、磷酸、95乙醇、NaCl 考马斯亮蓝试剂：准确称取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95乙醇，加入100ml 85磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01（W/V）考马斯亮蓝G-250，4.7（W/V）乙醇，8.5（W/V）磷酸。,仪器与试剂,1.标准曲线的制作：,标准曲线绘制：准确称取SOD 10 mg，用0.15 mol/mlNaCl配制成1mg/ml蛋白溶液。取7支试管，按下表操作。,SOD标准曲线,实验步骤,2.样品测定：,精密吸取1mg/ml 的SOD溶液0.035ml，再加入0.065ml的0.15mol/L NaCl溶液，混匀后，加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，1h内以0号试管为空白对照，按上述方法测定595nm处的吸光度。平行测定三份，并记录吸光度数值，计算得到平均值。,1.以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。2.根据样品溶液的吸光度，用标准曲线计算出待测蛋白质的浓度。,数据处理,
