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1、实验七 SOD检测波长的选择及含量测定,一、超氧化物歧化酶的基本特性及生理功能,1、超氧化物歧化酶的组成 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）是一种能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应的金属酶，按金属辅基不同分为三类：Cu,Zn-SOD Mn-SOD Fe-SOD 自由基：是一类非常活跃的化学物质，人体正常的新陈代谢就会产生自由基、是人体活动所需要的，但在某些特殊的情况下，体内会产生过量的自由基。它可聚集体在人体各组织器官上，导致各种慢性病与老化，故说它是万病之源，是人体健康的大敌。,2、超氧化物歧化酶的生理功能（1）延缓由于自由基侵害引起的衰老现象（2）治疗由自由
2、基损伤而诱发的疾病（3）消除肌肉疲劳（4）提高人体的抵抗力,蛋白质含量测定方法,定氮法紫外分光光度法双缩尿法（Biuret法）Folin酚试剂法（Lowry法）考马斯亮蓝法（Bradford法）其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。,在选择方法时应考虑的几点因素,实验对测定所要
3、求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。,一、紫外分光光度法,蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，
4、有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。,二、双缩脲法（Biuret法）,双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基（-CONH2）或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定波长为540nm，测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的
5、物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。,三、Folin酚试剂法（Lowry法）,此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。此复合物将Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。这个测定法的优点是灵敏度高，
6、比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20-250mg。,四、考马斯亮兰法（Bradford法）,1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，
7、溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。,SOD检测波长的选择及含量测定,实验目的,掌握SOD检测波长的选择方法学习考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理。掌握考马斯亮兰法测定蛋白质含量的实验技术。,本实验采用考马斯亮蓝G-250法测定SOD浓度。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色，它和蛋白质通过范德华力（Van der wals bond）结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beers law）。此染料与蛋白质结合后颜色
8、由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。,实验原理,仪器：电子天平、紫外分光光度计、小烧杯、容量瓶、玻璃比色皿、洗瓶、试管、滤纸、擦镜纸 试剂：超氧化物岐化酶、考马斯亮蓝G-250、磷酸、95乙醇、NaCl 考马斯亮蓝试剂：准确称取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95乙醇，加入100ml 85磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01（W/V）考马斯亮蓝G-250，4.7（W/V）乙醇，8.5（W/V）磷酸。,仪器与试剂,1.SOD检测波长的确定准确称取SOD粉末10mg，用0
9、.15mol/L NaCl配制成1mg/ml蛋白溶液，作为标准储备液。从上述储备液中吸取两份，每份0.4ml，分别放置在试管中，其中一份加入0.15mol/L NaCl 溶液5ml，摇匀后备用；另一份中先加入0.15mol/L NaCl 溶液0.6ml，再加入5ml考马斯亮兰试剂，1h内以0.15mol/L NaCl 溶液为空白分别进行全波长扫描，并记录最大吸收波长。,实验步骤,2.SOD标准曲线的制作,取已配制好的标准储备液备用。取6支试管，按下表操作。,SOD标准曲线,3.样品测定,精密吸取1mg/ml 的SOD溶液0.35ml，再加入0.65ml的0.15mol/L NaCl溶液，混匀后，加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，1h内以0号试管为空白对照，按上述方法测定595nm处的吸光度。平行测定三份，并记录吸光度数值，计算得到平均值。,1.绘制SOD在染色前后的全波长扫描图谱，并指出最大吸收波长分别是多少。2.以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。3.根据样品溶液的吸光度，用标准曲线计算出待测蛋白质的含量。,实验结果,
