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1、 利用MTT法测定抗癌药物顺铂对Hela细胞增殖的抑制效果 摘要：目的：采用唾哇蓝(MTT)比色法来检测Hela细胞相对数和相对活力，利用已知浓度细胞培养后的吸光度生成细胞成长趋势曲线，从而推测抗癌药物顺铂对Hela细胞增殖的抑制效果。方法：采用MTT法先测出一组Hela细胞浓度的吸光值的指数方程，同时培养加入不同浓度的顺铂的Hela细胞，最后根据指数方程来计算不同浓度的顺铂抑制后的Hela细胞数量。结果：抗癌药物顺铂对Hela细胞增殖有抑制效果，不同浓度的顺铂抑制的效果都不一样，几乎呈线性关系。结论：采用MTT法检测有助于指导临床选择化疗药物剂量,提高化疗效果；顺铂对癌细胞的增殖有一定的抑制
2、作用。关键词：MTT比色法 顺铂 Hela细胞前言 检测细胞存活与增殖，过去常用的方法有染料排斥法和掺入同位素的释放法。前者易受主观因素影响，误差大；后者因放射线同位素污染环境，并需要价格昂贵的仪器设备，整个过程所需时间长，实际应用受到限制。1983年Mos-manntl首创了MTT比色分析法，其基本原理是活细胞线粒体脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成蓝紫色甲瓒(Formazan)，从而可用比色法推测活细胞浓度1。由于MTT法简单、灵敏、稳定;其检测结果与同位素掺入法有良好的一致性，同时又可避免同位素污染及特殊设备的需要，故可代替同位素掺入法，有效地应用于淋巴细胞转化2j，IL一2a，抗肿瘤药物的
3、筛选等研究中。我们以检测抗癌药物顺铂对Hela细胞增殖活性的抑制效果为例，对MTT法的操作步骤及条件进行了探讨，还探讨一下不同浓度的顺铂对癌细胞抑制效果。1 材料与方法1.1 细胞培养 将吹打的单细胞悬液调整细胞浓度约为500000个/ML，再稀释细胞浓度直到每孔的细胞约为10000个、5000个、2500个、1250个L、625个等这五个梯度，将其接种到96孔板内，一般同一浓度的细胞接种4孔作为重复实验，同时分别做一组空白对照和一组未知细胞浓度；与此同时，制造一组药物处理组细胞，有调整细胞浓度为2000030000/ML，每孔接入200ul，使每孔细胞数为5000个左右，最后同时放到培养箱内
4、培养，2436h后吸掉药物处理组的培养液加入不同浓度梯度的顺铂（1 ug/ml、5 ug/ml、10 ug/ml、15ug/ml）2各200ul，继续培养。1.2 呈色和比色 培养3天后，所有的孔都倒掉所有的培养液，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul,继续培育4h,终止培养，快速翻转培养板，弃去孔内液体，然后每孔加入DMSO150ul，振荡30分钟，使结晶物充分融解。最后选择490mm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值，记录结果。1.3 计算分析 首先，通过excel 软件以吸收光值为横坐标，接种细胞浓度为纵坐标曲线；生成接种细胞浓度与吸光值间的趋势曲线与指数方程；然后，按照公式
5、计算各种浓度顺铂处理对细胞增殖率的影响。细胞增殖抑制率=（未知药物处理的对照组吸光值药物处理组的吸光值）/未知药物处理的对照组吸光值。2 结果与分析 2.1 不同浓度的顺铂对Hela细胞的抑制效果 表一 不同浓度的顺铂对Hela细胞的抑制率顺铂浓度/ug/ml 对照组 1 5 10 15OD值 0.613 0.335 0.269 0.193 0.149细胞增殖抑制率 -45.35% -56.12% -68.52% -75.69% 如表一所示，各实验组Hela细胞的抑制率不同，顺铂以浓度依赖方式降低吸光度值,与对照组相比均有显著性差异，随着药物浓度的增加,细胞的抑制率也有增加的趋势。说明顺铂能显
6、著抑制HeLa细胞生长增殖,降低细胞活性。对其他实验组的结果，看出在不同浓度的顺铂下，不是浓度越大越好，它是由一定的范围的。所以说明顺铂用药量要看实验的条件或看作用的对象，对于作用的条件、时间、培养条件、操作方式等等都会对影响顺铂的作用效果。所以在应用上一定要很好地限制一切影响条件。3 讨论与分析 本实验探讨的MTT法测定顺铂对HeLa细胞增殖的抑制作用，借鉴其他实验组的数据，看出不同浓度的顺铂对细胞的抑制效果不同，相对来说，浓度越高，抑制效果会更好，如果应用在患者上，就要针对患者的身体素质来下药，患者的身体素质很好的话，下药量大的话对癌细胞的抑制效果也会越好，但也不是无限量的大，不适合患者的
7、话只会对患者带来严重的副作用。无论是实验动物或癌症患者，使用顺铂后均有不同程度的毒性反应发生，这些毒性反应主要包括肾毒性、消化道毒性、骨髓抑制、神经毒性和耳毒性，尚有极少数患者出现心律不齐、肝功能减退、致畸、不育症和部份电解质紊乱。并几发现:当全身体温升高时，明显加重顺铂的细胞毒性、范围和严重程度，其机制是高体温增加了组织对顺铂的摄取，改变了机体对顺铂的代谢，增加DNA交联形成或抑制了DNA的修复8. 9.10.更有文献报道，顺铂可能激发某些致癌因素11或促使某些良性肿瘤向恶性转化12。正是这些毒副作用限制了顺铂的临床应用。 四唑盐比色实验(MTT)是一种检测细胞存活与生长的方法,MTT法广泛
8、应用于细胞系的体外抗癌药物筛选,在M TT比色分析中,单细胞悬液制备、细胞存活率、细胞接种量、药物剂量及作用时间均可影响肿瘤细胞的药物敏感性3。据细胞生物学研究,在细胞中毒的过程中,线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶能脱下琥珀酸的氢原子,使之氧化成延胡索酸,而染料MTT作为脱下氢原子的接受剂,被还原成蓝紫色的产物,通过分光光度计检测颜色的深浅变化,能定量的反映细胞数和/或活性的变化。具有代谢活性的细胞,无论处于静止期,还是分裂期,都有还原MTT的作用,还原程度与细胞活性有关。MTT法反映了肿瘤细胞群体对药物的敏感性,具备简便、快速、经济,与临床疗效相关性好的特点。因此M TT法药敏试验近几年较广泛应
9、用于临床恶性肿瘤(白血病、胃癌、肺癌、脑胶质瘤、乳腺癌)的化疗药敏检测4。 顺铂抗癌作用机理，许多证据证明DNA是顺铂作用的主要靶分子。同位素标志法研究顺铂对Ehrlich腹水癌细胞合成DNA、RNA和蛋白质的影响结果表明顺铂能特异地抑制DNA的合成而对RNA及蛋白质的合成没有抑制13。顺铂中的Pt()与癌细胞核中的DNA上碱基相结合,破坏遗传信息的复制和转录等过程,从而抑制癌细胞的分裂。反式二氯二氨合铂(反铂)并无抗癌活性说明顺铂与DNA的作用方式是特异性的,研究表明顺铂与DNA的结合方式主要是与癌细胞DNA片断上同股相邻G-G链内交联或与同股相邻A-G链内交联,因此这两种方式可能对顺铂的抗
10、癌活性起重要作用,而反铂不能形成这两种交联13。 顺铂属细胞周期非持异性抗肿瘤药物，但对不同类型的细胞在细胞周期中的作用部位却有一定差异。文献报道顺铂对G期细胞作用较强，通过与DNA链交联而杀伤细胞5，并损伤癌细胞膜结构，具有广谱抗癌作用，其效力强于丝裂霉素(MMC)和环磷酞胺(CTX)。据报道，在283例恶性肿瘤患者中，单独应用顺铂，对架丸癌的有效率为68.9%(31/45)、卵巢癌为57.6%(理9/85)、膀胧癌为52.9%(27/51)、肾盂及输尿管癌为36.4%(16/d4)、前列腺癌为19%(11/58)，其中笨丸癌的完全缓解率为17.8%(8/45)。由此可见，顺铂对泌尿生殖系统
11、恶性肿瘤有明显疗效，特别是睾丸癌6。对其它系统的恶性肿瘤亦有疗效。顺铂与某些化疗药物(如2;deoxy-5-azaeytidine，DAC)联合应用，可以增强顺铂与肿瘤细胞DNA的结合，加强其抗癌作用7。改变给药途径，亦能提高顺铂对某找肿瘤的疗效。 参考文献1 王玉萍.邵斌.楚天骄.雷冬梅.郝志伟.党秋红.张欢.曾宪旭 MTT法检测Hela细胞对化疗药物敏感性的研究 中国妇幼保健2006年第21卷2 庞荣清刘春生张步振潘兴华 顺铂对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用现代实用医学2003年10月第15卷第10期 3辛华雯 140例胃癌乳腺癌化疗药物敏感性MTT法研究1中国肿瘤临床,1994,21(
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