《毕业设计（论文）三种混养模式下鱼类肠道菌群PCRDGGE的比较研究.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《毕业设计（论文）三种混养模式下鱼类肠道菌群PCRDGGE的比较研究.doc（22页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、本科毕业论文 题 目三种混养模式下鱼类肠道菌群的PCR-DGGE的比较研究姓 名学 号4专 业水族科学与技术指导教师职 称教 授中国武汉二一一 年 六 月分类号 密级华中农业大学本科毕业论文 三种混养模式下鱼类肠道菌群PCR-DGGE的比较研究The Comparative Study on Fish Intestinal Microbiota from Three Polyculture Patterns by PCR-DGGE学生姓名： 学生专业：水族科学与技术指导教师： 华中农业大学水产学院二一一 年 六 月目 录摘 要II关键词IIAbstractIIIKey WordsIV前言11材
2、料与方法41.1 实验材料41.1.1养殖模式与样品采集31.1.2 实验主要仪器及试剂41.2试验方法51.2.1鱼类肠道样品与水样的制备51.2.2肠道及水样微生物的提取61.2.3 PCR-DGGE分析51.2.4 DGGE图谱中部分优势条带的序列分析和系统发育分析71.2.5 数据分析62 结果与分析62.1 DGGE指纹图谱与肠道菌群群落差异82.2序列和系统发生分析123 讨论123.1 鱼类肠道菌群的作用123.2 养殖模式与食性对鱼类肠道菌群差异性分析133.3 鱼类肠道菌群结构分析13参考文献14致 谢16三种混养模式下鱼类肠道菌群PCR-DGGE的比较研究摘要本文对三种混养
3、模式下不同鱼类的肠道菌群的差异进行了比较研究。实验采用PCR扩增的变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术。通过实验，建立了三种养殖模式下鱼类肠道细菌的DGGE图谱，观察各种鱼类在不同的养殖模式下肠道细菌的多样性差异。通过四个月的养殖和数据分析，PCR-DGGE指纹结构及针对部分特定的PCR-DGGE谱带序列分析显示，不同模式下草鱼的肠道菌群相似性较高（42.2%），投喂配合饲料的草鱼与摄食浮游生物的鲢、鳙、匙吻鲟肠道菌群结构相差最大（41.6%），说明食性对鱼类肠道菌群的影响超过了养殖模式对鱼类肠道菌群的影响。同为滤食性鱼类，除二号养殖模式下的鳙的肠道和匙吻鲟的消化道菌群具有较高的相似性（5
4、0.3%）外，匙吻鲟的消化道菌群和鲢鳙的相似性低，说明鱼的消化道结构可能对肠道菌群也起一定的影响作用。细菌16S rDNA V3区特征片段经DGGE分离条带切割，共得到15条条带，克隆测序后进行系统进化分析，结果显示这15条条带分别归属于4个细菌类群：变形细菌门（Proteobacteria），拟杆菌门（bacteroidetes），厚壁菌门（Firmicutes）和梭杆菌门（Fusobacteria），与以往报道的肠道菌群结构相一致。不同的养殖模式会使鱼类肠道微生物多样性产生差异。相同养殖模式下，食性对肠道微生物的影响较大，说明鱼类肠道菌群对食性具有高度的依赖性，食性的改变可能造成鱼类肠道菌
5、群的紊乱甚至会导致鱼类对疾病的抵抗能力下降。这为鱼类的饲料研发和鱼病防治提供了基础参考资料。关键词混养模式；鱼类；肠道菌群；PCR-DGGE；16S rDNAThe Comparative Study on Fish Intestinal Microbiota from Three Polyculture Patterns by PCR-DGGEAbstract This article made a comparative study on the differences of fish intestinal bacteria from three polyculture patterns.
6、 The experiment was made by PCR-DGGE. Through the experiment, the DGGE profiles of the fish intestinal bacteria from three polyculture patterns was made, observing the differences of the diversity of fish intestinal bacteria. After four months cultivation and data analysis, the analysis of PCR-DGGE
7、fingerprinting structure and some specific sequence of PCR-DGGE bands showed that there were higher similarities of Grass carp intestinal bacteria from different patterns(42.2%), besides, the intestinal bacteria structure of the Grass Carp fed on compound feed and the Silver carp, Bighead carp and P
8、olyodon spathala had the greatest difference(41.6%), it showed that, compared with the polyculture patterns, the feeding habits had a greater influence on the fish intestinal bacteria. The same as the sieve fish, except the intestinal bacteria of Bighead carp and Polyodon spathala from the second po
9、lyculture pattern has a higher similarity (50.3%), the others have a lower similarity, it shows that the intestinal structure also has an effect on the intestinal bacteria. 15 DGGE bands reflecting varying phylotypes were excised , cloned and sequenced. Phylogenetic analysis of 15 cloned bands showe
10、d that bacterial phylotypes were made up of 4 phyla bacteria, Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes and Fusobacteria, which was consistent with the results of previous studies. Different polyculture patterns make the diversity of the intestinal bacterial become different. The feeding habits have
11、 a great influence on the intestinal bacterial of the fishes from the same polyculture patterns, this shows that the structure of the intestinal bacterial depend on the feeding habits, the changes of the feeding will make the intestinal bacterial become disorder, whats worse, make the resistance of
12、the fish come down. The study provided fundamental references to feed development and disease prevention.Key WordsPolyculture Pattern;fish;intestinal;microbiota;PCR-DGGE;16S rDNA前言鱼类肠道正常菌群是肠道微生物与宿主以及所处水生环境形成的相互依赖、相互制约的微生态系统，对营养物质的消化吸收、免疫反应以及器官的发育等方面具有其他亚因素不可替代的作用，并且影响到鱼类的生长、发育、生理和病理（宋增福和吴天星，2007）。鱼类
13、的种类、生存环境、生长发育、食物组成、健康状况等也对其肠道菌群的群落结构和功能产生影响（Hansen & Olafsen,1999,Jensen et al.2002; Uchii et al., 2006; Bano et al.，2007）。目前国内外学者已经开始利用分子生物学技术对鱼类肠道微生物群落的结构以及功能进行研究，如在鱼类肠道菌群功能方面，Bates et al.，(2006) 通过对无菌斑马鱼的研究发现肠道菌群对斑马鱼的肠道分化、大分子蛋白的吸收和肠道蠕动频率等都有重要影响。在鱼类肠道菌群群落结构方面，Kim et al. (2007) 通过传统的分离培养结合16SrRNA序列
14、鉴定技术对虹鳟肠道菌群进行了分析，发现大于70%的细菌属于变形菌门。Bano et al.,(2007) 通过对采自五个加利福尼亚盐碱沼泽的长腭泥鰕虎鱼（Gillichthys mirabilis）的肠道菌群进行了基于PCR扩增的变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）分析，发现其前中后肠优势种群不同。李可俊等（2007）则通过PCR-DGGE技术对长江口八种野生鱼类肠道菌群进行了比较分析，发现鱼类肠道菌群的差异主要与其食性相关。Nedoluha & Westhoff (1997) 发现不同的养殖系统养殖的条纹鲈肠道菌群存在差异。另外也有研究发现鱼类肠道菌群随鱼类的生长和食物的改变而发生改变（Uc
15、hii et al.,2006）。鱼类混养的不同养殖模式对鱼类的生长速度、饵料利用率、产量和发病率有较大的影响（林仕梅等，2006）。很多基于16S rDNA基因的分子生物学技术，如荧光原位杂交(FISH; Langendijk et al.,1995)，和变性梯度凝胶电泳技术(DGGE Rosenbaum and Riesner,1987;Muyzer et al.,1993)，广泛应用于鱼类肠道微生物菌群的研究。虽然鱼类肠道菌群对鱼类的生长发挥重要作用，并且已经有很多对鱼类肠道菌群各方面的研究，但是对不同养殖模式下鱼类肠道菌群多样性的研究却很少。本文通过对不同养殖模式下鱼类肠道菌群结构的变
16、化，并对影响其肠道菌群多样性的因素进行了分析，从而为将来分析不同混养模式下鱼类疾病发生机理及微生物在不同鱼类肠道中的作用提供参考资料，本研究采用PCR-DGGE技术对三种不同混养模式下鱼类肠道菌群结构开展了相关研究。1）PCR-DGGE技术的原理及步骤PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补复制链。DGGE技术的基本原理：DGGE(denaturin
17、g gradient gel electrophoresis)变性梯度凝胶电泳是一种电泳系统，利用序列不同的DNA片段在聚丙烯酞胺凝胶中解链温度不同的原理，通过梯度变性胶将DNA分开。当双链DNA分子在变性凝胶中进行电泳，其解链的速度和程度与其序列密切相关，相同碱基对数目的双链DNA分子由于碱基对组成的不同，解链所需要的变性剂浓度也不同，当某一双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时，即开始部分解链，解链程度越大，迁移阻力越大，DNA分子的迁移速度随之减小，产生的迁移阻力与电场力相平衡时，具有不同序列的DNA片段则停留于凝胶的不同位置，形成相互分开的条带图谱。理论上只要选择的
18、电泳条件足够精细，最低可检测到只有一个碱基差异的DNA片段。对鱼肠道微生物群落的分析常包括3个步骤：提取核酸、DNA片段扩增和通过遗传指纹技术即DGGE图谱来分析PCR产物。1.提取核酸 它是PCR-DGGE技术中最关键的技术问题，核酸提取的好坏直接影响到DGGE图谱的建立与分析。具体步骤:肠道菌体洗涤液破碎C或包膜一内容物释放核酸分离、纯化、沉淀或吸附核酸，并去除杂质一核酸溶解在适量缓冲液或水中。2.DNA片段扩增步骤：a.DNA热变性：加热使靶DNA双链解离。b.引物退火：当温度降低时，两个引物分别结合到靶DNA的两条链的3一末端。c.引物延伸：在DNA polymerase的催化下，引物
19、沿着靶DNA链由3末端向5末端延伸。新合成的DNA链在变性解离后，又可作为模板与另一引物杂交，并继续合成靶DNA链。3 DGGE图谱分析PCR产物利用软件对肠道菌群的多样性、动态性以及优势菌群的相对丰度进行分析。2）影响PCR-DGGE技术应用的因素：影响DGGE分辨率的因素：利用DGGE分析肠道菌群时，获得高分辨率的图谱是重要的前提条件。影响DGGE分辨率的因素很多。如DNA(或RNA)提取效果、PCR(或RT-PCR)扩增效果、电泳时间、电泳温度、凝胶浓度、变性剂梯度、染色方法等。这些因素都可以通过控制反应条件加以完善。3）鱼类肠道微生物菌群研究的意义。随着现代集约化和规模化水产养殖业的发
20、展，应激原的增多，导致水产养殖动物的免疫力下降，对疾病的易感性显著增加。人们通常采用抗生素和化学合成药物等手段来防治水产动物疾病，但长期大量的使用抗生素不仅破坏水产动物肠道正常菌群组成，造成肠道内菌群的微生态失调，导致它们对病原微生物的易感性增加以及细菌耐药性的增强，而且还会在体内残留，引起过敏等一系列不良反应，并造成整个生态环境的污染，严重阻碍了无公害水产养殖业的发展。近年来，人们开始尝试在养殖水体中施用微生态制剂(Probiotics)来改善养殖生态环境，提高养殖动物的免疫力，抑制病原微生物的繁殖，从而减少疾病的发生，在各国的水产养殖业中，微生态制剂得到日益广泛的应用。微生态制剂大都是通过
21、对肠道菌群施加影响而发挥作用的，因此，对动物肠道菌群的了解是研究和开发微生态制剂的先决条件。鱼类疾病的发生往往引起鱼类肠道菌群的变化，通过检测鱼类肠道菌群的变化可以预测疾病的发生，从而减少养殖过程中的损失。迄今为止，PCR-DGGE技术是仍是一种不完善的技术，通过利用该技术研究肠道菌群结构可以不断的完善该技术，从而使该技术得到更广泛的应用。4）鱼类肠道微生物菌群的研究进展。迄今，我国很多重要的水产养殖品种，其肠道菌群的结构研究只限于可培养细菌的研究，然而常规的平板培养法在微生态研究上存在着很多局限性，近几十年来的分子生物学研究表明，环境微生物中99%以上是无法获得纯培养的。例如:水环境(海水、
22、淡水、中营养湖泊)中可培养微生物仅占总数的1%;鱼类体表的可培养微生物不足总量的0.01%，并且在可培养的细菌中还有很多种类无法定性分析。由此可见，常规的人工培养法无法获取鱼类肠道菌群的全面信息。为了克服传统微生物培养技术的缺陷，变性梯度凝胶电泳(DGGE)作为一种免培养的微生物分析手段已经逐步引起人们的重视。已经有很多关于淡水鱼类肠道土著菌群的研究(Trust and Sparrow 1974; Huber et al. 2004)。研究显示，肠杆菌科、气单胞菌属、不动杆菌属、假单胞菌科、黄杆菌科为兼性厌氧型细菌，拟杆菌属、梭状芽孢杆菌属、梭杆菌属为专性厌氧型细菌(Trust and Spa
23、rrow 1974;Ringo et al.，1995)。尽管已经通过研究来确定营养、化学疗法和有毒化合物对肠道微生物动态的影响(Austin and Al-Zahrani,1988;Ringo,1993)，但是通过分子技术来描绘肠道中微生物多样性特征的研究却很少，因而运用PCR-DGGE技术研究鱼类肠道菌群具有进步的意义。目前为止，对鱼类消化道微生物的研究一直是以传统技术为基础。然而，这些研究限制了人们对鱼类肠道生态系统复杂性和不同微生物对像竞争排斥等的进程的理解。最近，分子技术使独立培养研究和拓宽人们对人类和陆生生物的消化道的知识变的十分便利。很多应用都是以16S rRNA基因，如荧光原位
24、杂交(FISH; Langendijk et al.,1995)，和变性梯度凝胶电泳技术(DGGE Rosenbaum and Riesner,1987; Muyzer et al.,1993)为基础的，并且16S rDNA克隆库已经成功的被用来做复杂微生物群落的分析。4）PCR-DGGE技术应用的展望动物肠道微生物的菌群结构及含量受到包括进食不同食物在内的各种因素的影响 ,正常肠道菌群能够提高生长速度,改善产品质量,并有助于减少疾病。传统的培养法只能对有限的几种已知微生物进行评估,无法认清样本的全貌。目前在肠道微生态学中,DGGE是一种新型的微生物群落复杂性和行为研究的工具,具有可靠、可重复
25、、快速和容易操作等特点。结合PCR扩增标记基因或其转录物的DGGE,能直接显示微生物群落中优势组成成分。PCR-DGGE技术虽然还存在一些不足,但是可以通过和其他一些方法如传统培养、杂交技术以及测序技术等相配合,从而更全面的认识微生态的组成和动态变化。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1养殖模式与样品采集表1 精养池塘三种养殖模式放养鱼种的搭配（单位：尾）Table 1：The composition of the fishes from three polyculture patterns模式草鱼鲢鳙匙吻鲟鲫小计模式2503540015340模式25035202015340模式25035
26、0015300实验用草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙（Aristichthys mobilis）、鲫(Carassius auratus)为2龄鱼种，个体体重分别为75.91107.68 g、53.175 g、49.6260.97 g；匙吻鲟（Polyodon spathula）为当年鱼种，个体体重为133.98167.07 g。试验设置三种养殖模式（见表1），实验用鱼来源于华中农业大学武汉新洲973项目实验基地。于2010年6月11日开始，2010年10月12日结束，共计122 d，期间早晚投喂草鱼料，
27、养殖期结束后将样品捕捞后冰冻运回实验室。1.1.2 实验主要仪器及试剂主要仪器：Mini-Beadbeater为Biospec公司产品；DGGE所用仪器The DcodeTM Universal Mutation Detection System为Bio-Rad公司产品；INGENYphorU-2 系统；粪便基因组DNA快速提取试剂盒来自原平皓生物技术有限公司；Cycle-Pure Kit来自Omega公司；Platinum Tap DNA Polymerase；各种规格移液器；PCR扩增仪；Gel Documentation XR系统；无菌操作台；电子天平；低温冰箱。主要试剂：丙烯酰胺；N，
28、N，-甲叉双丙烯酰胺及琼脂糖；DNA分子量标准；Taq DNA 聚合酶；蛋白酶K；dNTP；DNA酶；5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-Gal）；DNA酶；PCR扩增引物；细菌培养基；Tris平衡酚；溶菌酶；其他化学试剂除特别注明外，均为国产分析纯。1.2试验方法1.2.1鱼类肠道样品与水样的制备在无菌操作台上先用75%酒精擦拭鱼体表及解剖剪，用解剖剪沿肛门向上朝前呈弧形剪开，然后用无菌棉线结扎肠段，75%酒精棉球擦拭消化管外壁，用剪刀分离出肠道，并小心去除附着在上面的脂肪，剖开肠道后轻轻收集每尾鱼的内容物，来源于同一模式的六个样本混匀后-20 保存待用。用有机玻璃采水器分别采集等体
29、积的表、底层水混合，水样混匀后取0.2-0.5 L用GF/C滤膜抽滤，抽滤后的CF/C滤膜剪碎后放入灭菌的2 mL离心管中，16000 g，4 ，离心10 min，收集菌体沉淀，所有收集样品于-20 冷冻保存备用（Yan et al.,2009）。1.2.2肠道及水样微生物的提取采用粪便基因组DNA快速提取试剂盒（原平皓生物），按照说明书进行操作，所得基因组DNA溶于50 L无菌超纯水中-20保存备用。操作步骤如下：1、收集约180-220 mg粪便到2 mL离心管至冰上。2、加1.4 mL的缓冲液ASL，连续涡旋振荡1 min或直到完全混匀均一。3、将重悬物95 温育6 min。4、涡旋振荡
30、15 s，最高速离心1 min沉淀粪便颗粒。5、转移1 mL上清液至1.5 mL离心管，最高速离心3 min。6、转移400 L上清液到一个1.5 mL离心管，加入20 L蛋白酶K（20 mg/mL）溶液，充分混匀，加入400 L结合液CB，涡旋振荡15 s，充分混匀。7、70温育10 min。8、冷却后加入200 L异丙醇，涡旋混匀。9、将上一步所得溶液和可能出现的沉淀都加入一个吸附柱RA2中，（吸附柱放入收集管中）12000 rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。10、加入500 L抑制物去除液IR，12000 rpm离心30 s，去除废液。11、加入700 L漂洗液WB（先检验是否已加入
31、无水乙醇），12000 rpm离心30 s，去掉废液。12、加入500 L漂洗液WB，12000 rpm离心30 s，弃掉废液。13、将吸附柱RA2放回空收集管中，13000 rpm离心2 min，尽量去除漂洗液，以免漂洗液中含有乙醇抑制下游反应。14、取出吸附柱RA2，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加150 L洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液可以在65-70 的水浴中预热），室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。将提到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。15、所得的基因组可以在-20 的条件下保存。1.2.3 PCR-DGG
32、E分析采用细菌通用引物F357-GC/R518扩增16SrDNA基因的V3区，具体PCR扩增程序参考Yu & Morrison (2004)的方法进行。V3可变区域的引物序列为V338F(5-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）V534R（5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3）反应体系：10PCR buffer(Mg2+ free) 5l;Mg2+(2.5 mmol/L) 5 L；dNTP mix（2.5 mmol/L） 4 L；Tap（5 U/L）0.5l；BSA(20mg/ml) 3.5l；Pr
33、imer5（20mol/l）1l；Primer3（20 mol/L）1 L；模板DNA（50 ng/L）1 L；ddH2O 29 L。反应条件：94 、5 min；94 、1 min；65-55 、30 sec；72 、1 min(其中每个循环后复性温度下降0.5 )；20个循环后进入第二个循环程序：94 、1min；56 、30 sec；72 、1 min；10个循环后，72 、7 min。反应结束后取5 L反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。 DGGE指纹图谱的构建采用INGENYphorU-2系统（INGENY，莱恩，荷兰）进行。变性胶浓度为9%,变性梯度为40%70%(7 mol/L尿素
34、和40%去离子甲酰胺为100%变性)。电泳条件：在1TAE电泳缓冲液中60 条件下120 V稳压电泳12 h。电泳结束后用SYBR-GREEN（按1:10000体积比）染色30 min，使用Gel Documentation XR系统（Bio-Rad公司，美国）成像。1.2.4 DGGE图谱中部分优势条带的序列分析和系统发育分析用无菌手术刀将DGGE图谱中部分分离明显、条带清晰且亮度高的优势条带从凝胶上切下回收到1.5 L离心管中加入50 L无菌水4 浸泡过夜。然后以此为模板，使用引物F357/R518进行PCR扩增，PCR反应条件为95 预变性6 min，然后94 变性1 min，54 退火
35、45 s，72 延伸45 s，循环30次，最后72 延伸10 min。上述PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，经过纯化的产物连接到PMD18-T载体上，转化到E. coli Topl0感受态细胞，37 培养，经鉴定的阳性克隆交由武汉博越生物技术有限公司测序获得16S rDNA序列。测序获得的16S rDNA 序列在GenBank中做BLAST搜索，选取相似性最高的序列，用ClustalX 1.81进行全部对位排列，再用Mega 4.1软件构建N-J系统发育树。1.2.5数据分析使用Quantity One软件包生成鱼类消化道微生物PCR-DGGE图谱的0/1矩阵和相似性矩阵，并进行UPGMA聚类，
36、使用Canoco for Windows 4.5 进行PCA分析。2结果与分析2.1 DGGE指纹图谱与肠道菌群群落差异图1显示了三个不同混养模式下鱼肠道菌群PCR-DGGE指纹图谱，因为每条泳道代表的是1种鱼6个个体的混合样品，所以它反映的是这种鱼肠道菌群的整体状态。针对16SrRNA基因的PCR-DGGE分析共得到88条不同的细菌16S rDNA条带，其中样品特异性带22条，未检出共有带。检出鲢鳙消化道特异性微生物条带1条，匙吻鲟消化道特异性微生物条带1条，草鱼消化道特异性微生物条带1条，并检出草鱼与匙吻鲟消化道内共有而鲢鳙消化道内未检出的微生物条带1条，未检出鲢鳙与草鱼消化道内共有而在匙
37、吻鲟消化道内缺失或鲢鳙与匙吻鲟消化道内共有而在草鱼消化道内缺失的微生物条带。对PCR-DGGE图谱获得的0/1矩阵进行的UPGMA聚类结果显示，草鱼消化道微生物群落单独聚为一枝，匙吻鲟微生物群落单独聚为一枝，而鲢鳙鱼消化道微生物群落则共同聚为一枝（图2）。不同模式下草鱼的肠道菌群相似性较高（42.2%），投喂配合饲料的草鱼与摄食浮游生物的鲢、鳙、匙吻鲟肠道菌群结构相差最大（41.6%），除二号养殖模式下的鳙的肠道和匙吻鲟的胃菌群具有较高的相似性（50.3%）外，匙吻鲟的消化道菌群和鲢鳙的相似性低。说明在食性相同的情况下，鱼类的消化道结构对肠道菌群也起一定的影响作用，因为匙吻鲟是有胃鱼，而鲢鳙则
38、为无胃鱼。DCA排序也显示出类似的结果（图3）。图1：16S rDNA变性梯度凝胶电泳图谱Figure 1: PCR-DGGE 16S rDNA banding profiles of the fish intestinal bacteria from three polyculture patterns表2：鱼类肠道和水样菌群相似性矩阵Table 2: the similarity matrix of the microbiota from the intestinal of fishes and water养殖模式一号三号二号鲢鱼鳙鱼草鱼草鱼鲢鱼水样草鱼鲢鱼鳙鱼匙吻鲟肠匙吻鲟胃一号鲢鱼10
39、0鳙鱼41.6100草鱼1125.6100三号草鱼14.231.742.2100鲢鱼44.249.123.620.3100二号水样21.729.725.916.331.9100草鱼12.734454428.923.8100鲢鱼33.231.811.214.627.125.318.5100鳙鱼37.945.112.915.254.420.522.428.5100匙吻鲟肠15.225.623.924.827.91632.333.830.8100匙吻鲟胃21.529.923.716.839.820.728.521.850.353.9100图2 基于鱼类肠道菌群和水样菌群0/1相似性矩阵的UPGMA聚
40、类结果Figure 2: the result of UPGMA clustering based on the 0/1 similarity matrix of the microbiota from the intestinal of fishes and water图3 基于鱼类肠道菌群和水样菌群0/1相似性矩阵的DCA排序结果Figure 3: the result of DCA sorting based on the 0/1 similarity matrix of the microbiota from the intestinal of fishes and water图4 D
41、GGE谱带回收获得的16S rDNA系统进化树Figure 4: Neighbour-joining phylogenetic tree of the 16S rDNA obtained from retrieved DGGE bands注：C、Y、L、S分别表示样品来自草鱼，鳙，鲢，水样，后面的第一个数字表示不同的养殖模式。Notes: C, Y, L, S are represented as the samples from Ctenopharyngodon idellus,Aristichthys mobilis,Hypophthalmichthys molitrix and wate
42、r, the fist number represents the different polyculture patterns.2.2序列和系统发生分析16SrDNA V3区特征片段经DGGE分离条带切割，共得到15条条带，将条带进行克隆测序，所得到的序列大小在169195bp范围内。然后进行系统进化分析，结果显示这15条条带分别归属于4个细菌类群：变形细菌门（Proteobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes），厚壁菌门（Firmicutes）和梭杆菌门（Fusobacteria），且它们其中的大多数为未培养菌，占总条数的53%。15条序列中有5条属于厚壁菌门的梭菌纲(C
43、lostridia)，芽孢杆菌纲（Bacilli）；4条属于梭杆菌门的梭杆菌属(Fusobacterium)和鲸杆菌属（Cetobacterium)，3条与变形菌门的变形菌纲和变形菌纲相似；3条属于拟杆菌门的拟杆菌纲（Bacteroidetes）。其中水样S2-2和uncultured beta Proteobacterium clone WA0.2-od-38百分之百的相似，而这一细菌条带也存在于所有模式养殖鱼类肠道中，说明水样中和养殖鱼肠道的细菌存在相似性，三号养殖模式的草鱼C3-1与拟杆菌纲的uncultured Bacteroidetes bacterium clone GWS-Kdn
44、a9 百分之百相似，而以往的的很多报道也证实淡水鱼类肠道的专性厌氧菌以拟杆菌科为主，而这一细菌条带也存在于所有模式的养殖鱼肠道和二号养殖模式的水样中，三号养殖模式的L3-1与Streptococcus dysgalactiae strain CH74百分之百相似，这一细菌条带同样存在于2号和3号养殖模式的鲢鳙和匙吻鲟的消化道中，一号养殖模式的Y1-1与uncultured Bacteroidetes bacterium clone ESS-H6 百分之百相似，此细菌条带也存在于三个模式的所有鲢鳙鱼肠道中。3 讨论3.1 鱼类肠道菌群的作用鱼类肠道存在着大量的微生物，他们构成了鱼类肠道的微生物区系，这些微生物群落是动物生长进化的结果，它们对机体的营养、健康、免疫等方面有着极其重要的作用（赵庆新，2001）。在营养功能方面，鱼类肠菌群在鱼类的营养和消化吸收方面起着重要的作用。Kashiwada & Sugita等在鲤科鱼类肠道中分离出了能合成维生素的细菌。Bachel等在比较分析了淡水扁鳖和南方比目鱼的肠道厌氧菌的产酶功能后，发现这些肠道的厌氧菌可以产生酸性和碱性磷酸酶、四碳和八碳的醋酶、十四碳的脂肪酶、芳基化合物分解酶与糖普酶等供机体使用。在免疫功能方面，李莉研究发现，随着肠道内气单胞菌(Aeromonas)百分含量的下降，肠拟杆菌（Enterobacteri
