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1、刘敏 ,张明(安徽农业大学生命科学学院 ,合肥230036 )摘 要 :以愈创木酚为底物 ,采用平板筛选法筛选得到一株产漆酶菌株 W S122,形态学特性表明该菌属于绿色木霉 。对产酶条件的初步研究结果表明 , W S122菌株的产酶高峰期出现在接种培养后的第 4 d。与蔗糖 、乳糖 、半乳糖 和可溶性淀粉相比 ,以葡萄糖为碳源时 ,发酵上清液的漆酶活力明显要高 ,最大值达 230U /L。以 NH4 C l为氮源 ,最 有利于 W S1 22漆酶的产生 ,漆酶活力最高可达到 234U /L。 0101mmo l /L 的愈创木酚和 AB TS对 W S1 22 产漆酶有明 显的诱导作用 ,
2、35m g /L 的 Tween280可以明显提高 W S1 22的产酶水平 。关键词 :绿色木霉 ;愈创木酚 ;形态学特征 ;酶活力中图分类号 : Q935文献标识码 : A文章编号 : 1008 - 9632 ( 2008 ) 03 - 0040 - 04漆酶是一种含铜的多酚氧化酶 , 最早发现于日本漆树的伤流液 , 现广泛存在于昆虫 、植物 、真菌和细菌因而对于有着较高漆酶活性的木霉的研究有着重要的意义 。本文报道了一株产 漆酶 绿 色 木霉 W S1 22 的 筛 选 、鉴定和产酶条件的研究 。1 材料与方法111 材料 分离材料取自安徽省境内的各种土壤和各种树木腐朽部分 。112 培
3、养基种子培 养 基 ( PDA 培 养 基 ) : 葡 萄 糖 20 g, 马 铃 薯200 g,琼脂 16 g。筛选 培 养 基 : PDA 培 养 基 , 01015 % 愈 创 木 酚 ,50U /mL 链霉素 , 40U /mL 青霉素 ,水 1L , pH 值自然 。中 14 。漆酶能以 O 为受氢体催化酚类化合物 (不包2括酪氨酸 )的氧化 ,具有非底物特异性 , 因而能氧化各种酚类化合物 、杀虫剂 、多环芳烃和合成染料 59 等多 种环境污染物 ,特别是在小分子介体物质的作用下 ,可以氧化更多种类的物质 , 因而漆酶可以广泛地运用于 造纸业 ,印染业 ,食品业和医药业 。由于漆酶
4、巨大的应用价值 , 进行漆酶产生菌的分 离筛选一直是漆酶研究的热点之一 。从现有报道看 ,漆酶最主要来源于子囊菌和担子菌亚门的高等真菌 ,特别是担子菌中的白腐真菌 10 , 这些菌也是目前报道 最有效的芳香族类化合物的降解菌 。但白腐菌一般生 长周期长 ,而且所产漆酶大多为诱导酶 11 , 这些特性使工业生产难以有效进行 ,故筛选生长周期短 、产酶时间早的菌株具有十分重要的意义 。通过大量的研究 ,国内外已经获得了许多产漆酶的细菌和霉菌 , 如具有 一定的降解木质素能力的膨大拟青霉菌 12 , 有关枯草杆菌 13 和球菌 14 分泌漆酶也有少量报道 ,但是它们漆酶活性均比较 低 。而 广泛 分
5、 布 在自 然 界 的木 霉 属真 菌 ,是一类可分泌多种降解木质素 、纤维素的菌种 , 常具有多种酶系如纤维素酶 15 、几丁质酶 16 和漆酶 17 等 ,因而木霉在今后农业纤维素这一再生资源的利用 上将发挥重要的作用 , 有研究表明木霉虽然具有较高的纤维素酶活性 , 但其分泌产生漆酶的能力不强 17 ,发酵培养基 (改良 ) 18 : 葡萄糖 20 g, NH C l 215 g,4M gSO 7H O 015 g, FeSO 7H O 10m g, M nSO 424244H2 O 1m g, ZnSO4 7H2 O 1m g, CuSO4 5H2 O 2m g,N a2 H PO4
6、H2 O 100m g, KH2 PO4 110 g, CaC l2 10m g, VB150m g, H2 O 至 1L , pH 值自然 。113 产漆酶菌株的筛选在无菌环境下将样品研碎 , 十倍稀释成不同浓度 的样液 。吸取各梯度样品悬液 011mL , 均匀涂布于含愈创木酚的筛选平板上 ,每浓度设 3 个处理 ,置于 28 恒温培养 ,每隔 24 h 对初筛平板上新出现的有明显氧 化变色圈的菌落进行分离纯化 。将分离菌株分别接种到筛选平板上和 PDA 平板上 , 28 恒温培养 , 选出筛 选平板上出现明显氧化变色圈的菌株 ,并通过 PDA 平收稿日期 : 2007 - 04 - 28
7、作者简介 :刘 敏 ( 1981 - ) ,女 ,硕士研究生 , 主要从事微生物生理学研究 ;通讯作者 :张 明 , E2m a il: zhangm ing ahau1edu1cn。基金项目 : 安徽省高校“十五 ”优秀人才计划 (【教秘人 】2004 - 100 )板淘汰自身产色素的菌株 , 然后通过比较变色圈的大小和菌丝的生长速度 ,选出产漆酶能力强的菌株 。114 分离菌株的初步鉴定将分离菌株在 28 恒温培养 4 d, 观察菌落形态 。 采用插片法 28 培养 4 d, 镜检 , 观察菌丝和孢子形态特征 。115 粗酶液的制备与酶活测定粗酶液的制备 : 将发酵液于 8000 r /m
8、 in, 4 , 离心10m in,上清液即为粗酶液 。酶 活 力 测 定 19 : 在 4mL pH 值 410 的 50mmo l /L N aA c2HA c缓冲液中 (含 1mmo l /L 愈创木酚为底物 ) 加入 1mL 适当稀释的酶液 , 混合均匀后 , 置于 25 反应10m in,于 465 nm 处测定光吸收值的增量 。酶活力单位 定义为 :每分钟氧化 110mo l底物所需的酶量为一个 酶活单位 。116 培养基成分对 W S1 22 产漆酶活力的影响11611 碳源对 W S1 22 产漆酶活力的影响 在液体发酵培养基中分别以 20 g /L 葡萄糖 、蔗糖 、乳糖 、
9、半乳糖 、可溶性淀粉为唯一碳源 ,接种量为 5 % ,培养 6 d,定时测定漆酶活力 。11612 氮源对 W S1 22 产漆酶活力的影响 发酵培养基中分别以 0115 g /L N aNO3 、NH4 C l、酒石酸铵 、天冬氨酸 、蛋白胨作为培养基内唯一的氮源 ,接种量为 5 % ,培养 6 d,定时测定漆酶活力 。11613 诱导剂对 W S1 22 产漆酶活力的影响 发酵培养基中分别加入 0101mmo l /L 愈创木酚 、单宁酸 、AB TS、A zu re2B 作 为 诱 导 剂 , 再 按 5 % 接 种 量 接种 ,发酵培养 6 d,定时测定漆酶活力 。11614 表面活性
10、剂对 W S1 22 产漆酶活力的影响 发酵培养基中加入表面活性剂 Tween280 , 并设置1m g /L、3 m g /L、5 m g /L 3 个浓度处理 。发酵培养 6 d,定时测定漆酶活力 。2 结果与分析211 产漆酶菌株的筛选对土壤和植物样本进行初筛 ,得到 42 株菌落周围 有明显褐色氧化带的菌株 ,分离纯化后 ,将各纯化的菌 株分别点种于筛选平板和 PDA 平板上 , 30 条件下培 养 7 d后发现 ,有 4 株菌在筛选平板和 PDA 平板上均产生相同的红褐色氧化带 ,疑为菌丝产生色素所致 ; 其它各株菌仅在愈创木酚筛选平板 上有 明 显 的褐 色 氧化 带 ,说明这些菌
11、株能分泌胞外漆酶 。在这 38 株菌中 ,其中一株菌 (编号 W S1 22 )在平板培养 48 h后即产生了明显的褐色氧化带 ,随着时间的增加 ,其氧化带的颜色 逐渐加深 ,呈明显的阳性反应 , 且菌丝生长速度很快 ,48 h后菌落直径达 31mm。与其它各菌株比较 , W S1 22产酶时间最早 , 持续时间长 , 生长快 , 氧化变色圈的范 围最大 ,故将 W S1 22 选为进一步研究的材料 。212 菌株 W S1 22 的初步鉴定W S1 22 菌株在接种后 48 h 内菌丝生长缓慢 , 菌落 较小 ,紧贴培养基生长 ,仅有少量浅绿色孢子生成 , 72 h 后迅速生长 , 絮 状
12、气生 菌 丝 大量 出 现 , 孢 子 量迅 速 增加 ,颜色逐渐加深 , 直至变成淡黄色 。经镜检 , 菌丝有 隔 ,疏松不成束 。分生孢子梗为菌丝生出的侧枝 ,有隔膜 ,与菌丝区别明显 , 对生分枝 , 又可继续形成二级和 多级分枝 ,分枝角度呈锐角或直角 。分生孢子产生在分生孢 子 梗 顶 端 , 不 串 生 , 圆 形 , 成 绿 色 。根 据 魏 景 20 超的方法 ,结合菌落特征和镜检结果 , 初步鉴定菌株 W S1 22 为绿色木霉 ( T richoderm a viride Pe rs1ex F r1) 。213 生物量与产酶的关系W S1 22 菌株种瓶培养 3 d后接种于
13、 80mL 发酵培养 基 ( 250mL 三角瓶 ) , 于 30 、160 r /m in 摇床发酵培养6 d,每天 定 时 测 量 生 物 量 和 漆 酶 活 力 , 结 果 如 图 1所示 。图 1 生物量与产酶的关系F ig 1 Tim e cou rse of m yce ical grow th and lacca se p roduc tion of stra in of W S1 22从图 1 可以看出 , W S1 22 菌株在接种后的几天内生长迅速 ,生物量在第 5 d 达到高峰 , 随着菌丝的迅速 生长 ,漆酶活力也随之迅速上升 , 并在第 4 d 达到最大值 220U
14、/L ,之后酶活迅速下降 。由此 可 见 , W S1 22 的产酶高峰出现在对数生长后期 ,此时菌丝生长旺盛 ,分 泌胞外漆酶的能力最强 。214 发酵条件对 W S1 22 产漆酶的影响21411 不同碳源对 W S1 22 产酶水平的影响 分别以葡萄糖 、蔗糖 、乳糖 、半乳糖 、可溶性淀粉作为唯一的碳源 ,对 W S1 22 进行发酵培养 ,并测定漆酶活 力 ,结果如图 2 所示 。由图 2 可以看出 ,以葡萄糖为唯一碳源时 ,发酵液的漆酶活力要明显高于其它碳源 ,最 大值达 230U /L。此 外 , 以 乳 糖 为 碳 源 时 , W S1 22 在 第酶的合成表达 。D Souz
15、a D T等 21 报道愈创木酚及染料亮绿能使一株海洋真菌 N IOCC # 2 a 的漆酶产量提高30 倍 。在本研究中 ,这些物质对 W S1 22 产酶水平的影 响如图 4 所示 ,它们在发酵培养的初期均能促进 W S1 22 漆酶的产生 , 接种 1 d 后 , 各处理发酵液的漆酶活力 已经达到 45U /L 左右 , 而对照的漆酶 活力 明 显 要低 。但是 ,随着发酵时间的延长 ,单宁酸和甲苯胺兰对产酶 的促进作用下 降 , 因而 它 们 并不 能 促 进该 菌 株 产酶 。而愈创木 酚 和 AB TS 均 能 很 大 程 度 提 高 该 菌 产 酶 能 力 ,在产酶高峰期时 ,发
16、酵液的酶活力分别达到 314U / L 和 281U /L , 0101mmo l /L 愈创木酚与 AB TS能分别使 W S1 22 菌株的漆酶活力提高 43 %和 28 % 。由此可见 , 愈创 木 酚 和 AB TS 对 W S1 22 产 酶 具 有 良 好 的 促 进 作用 。21414 表面活性剂对 W S1 22 产酶水平的影响碳源 。图 2 不同碳源对 W S1 22 漆酶活力的影响F ig 2 Effec t of ca rbon sou rce s on enzym e ac tivity of stra in W S1 2221412 不同氮源对 W S1 22 产酶水
17、平的影响 不同氮源对 W S1 22 菌株产酶水平影响结果如图 3所示 。 5 种 氮 源中 NH4 C l 最 有 利 于 W S1 22 漆 酶 的 分 泌 ,酶活最高可达到 234U /L , 以下依次为 N aNO3 蛋白胨 天冬氨酸 酒石酸铵 。综合 W S1 22 产酶水平分 析 , NH4 C l最适合作为 W S1 22 发酵产酶的氮源 。图 5 Tween280 对 W S1 22 漆酶活力的影响F ig 5 Effec t of Tween280 on W S1 22 lacca se sec retion由图 5 可见 , Tween280 可以明显提高 W S1 22
18、的产 酶水平 ,但是 1m g /L 的 Tween280 对该菌株产酶基本上 没有明显效果 ,当其浓度达到 3m g /L 能在很大程度上 提高了菌株的产酶水平 。在第 4 d, 发酵液漆酶活力最 高达到 307U /L ,要明显高于对照 。表面活性剂对多环 芳烃具有增溶作用 , 该作用主要通过形成表面活性剂 胶束进行 。愈创木酚是简单的芳环结构物质 , Tween280 能够明显增加其在发酵液中的溶解性与吸收性 , 使 该诱导剂能够发挥较大的作用 ;再者 , Tween280 也增加了发酵液的溶氧量 ,从而有利于菌丝的生长 ; Tween280对酶活力的大幅度提高 , 还可能由于其提高了细
19、胞膜 的渗透性 ,使胞内的漆酶容易透过细胞膜分泌出来 ,而且膜透性的提高也促进了化学底物进出细胞 , 从而加 强了菌株对芳环类化合物的生物氧化能力 。因而 , 虽然诱导剂愈创木酚与 AB TS 能有效地提高绿色木霉菌株 W S1 22 产酶水平 , 但该菌株能在无诱图 3 不同氮源对 W S1 22 漆酶合成的影响F ig 3 Effec t of n itrogen sou rce s on lacca se p roduc tion of strain W S1 2221413 诱导剂对 W S1 22 产酶水平的影响图 4 不同诱导剂对 W S1 22 漆酶合成的影响F ig 4 Eff
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