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1、第一节 DNA的合成一、DNA的半保留复制DNA双螺旋的两条链碱基顺序互补的性质是DNA自我复制的基本要点,第九章 核酸代谢,复制部位：真核生物：细胞核原核生物：细胞质的核质区,DNA复制时，亲代DNA的双螺旋先解旋并分开，然后以每条链为模板，按照碱基配对原则，各形成一条互补链。这样，从亲代的一个DNA双螺旋分子复制成两个与亲代的碱基序列完全相同的子代DNA分子。每个子代DNA分子中，有一条链来自亲代DNA，另一条则是新形成的，这样的复制方式叫做半保留复制（semiconservative replication）。,半保留复制,DNA半保留复制实验证据1958年Meselson(梅塞尔森)和
2、Stall(斯塔尔)用同位素（15N）和氯化铯密度梯度离心，首次证明了DNA的半保留复制。,用15NH4Cl唯一氮源培养大肠杆菌，之后，用14NH4Cl培养，然后进行CsCl2进行密度梯度离心。由于15NH4Cl密度大于14NH4Cl，因此，形成不同区带，经过若干代培养后，两个14NH4Cl区带增多。,复制的反应,PPi随即被焦磷酸酶水解，从而推动聚合反应的进行。,二、聚合酶I1956年Kornberg科恩伯格提取出了DNA聚合酶I。此酶为单肽链蛋白质，它以脱氧核苷三磷酸为活性单体物质来合成DNA链DNA聚合酶I在合成DNA时需下列物质：（1）所有四种脱氧核苷三磷酸-dATP、-dGTP、-d
3、CTP、-dTTP(脱氧胸苷三磷酸)及Mg2+。（2）带有自由3-羟基末端的有一定长度的DNA链作为前体，DNA聚合酶I不能从头开始合成DNA。（3）DNA模板DNA合成时增链的方向是从53的方向进行，增链速度约为10个核苷酸/秒,脱氧核苷三磷酸上的-磷酸亲核进攻DNA链的3-OH末端。DNA聚合酶I具有外切酶的功能(35或53)。,三、DNA聚合酶II和III1970年从大肠杆菌中分离出了DNA聚合酶II和III在生物体中，聚合酶III的功能是合成新的DNA链；DNA聚合酶I的功能是除去RNA引链和修补裂口。DNA聚合酶II的功能尚不清楚。,DNA聚合酶III是大肠杆菌DNA复制过程中真正的
4、复制酶！,四、解链酶（helicase）作用：能断裂互补碱基间的氢键,使DNA双链分离形成“复制叉”。,五、单链DNA结合蛋白(single stranded DNA-binding protein,SSB)选择性地与单链DNA结合。作用：稳定DNA单链模板,包括防止重新形成双 链、双螺旋结构以及防止被核酸酶水解。,六、引物酶(Primase)实际上该酶是一种特殊的RNA聚合酶。作用:在DNA复制开始时,在5端(5 3方向）合成一小段RNA引物。,七、DNA聚合连接酶1967年，在几个实验室同时发现了一种DNA连接酶作用：催化一条链的5-磷酸末端与另一条链的3-OH末端之间形成磷酸二酯健。只能
5、连接处于nick（缺口）状态的双链DNA，不能连接游离的两条单链DNA,八、DNA的复制真核细胞的复制是从多个起点开始的，以双向方式复制可是任何一种DNA聚合酶只能进行53的复制（领头链）。如何解决以53为模板进行复制的过程？,复制的起始,1、在拓扑异构酶、解链酶及单链DNA 结合蛋白的共同作用下，DNA解旋、解链，形成复制叉。2、依赖于单链模板，由引物酶催化按碱基配对规律合成一小段RNA引物(原核细胞引物长50-100个碱基，真核约10个碱基。）,复制起始阶段的特点,真核细胞：具有多个起始位点,原核细胞：仅有一个复制起始位点，但往往是双向复制（如E.Coli）,复制过程的调控主要取决于复制启
6、动的频率，而DNA延长的速度大体上是恒定的。由于真核生物在多位点上启动复制，所以尽管其DNA比原核生物DNA大得多，但复制的总速度反而比原核生物快。,DNA的复制是由引发体识别并结合于复制原点而被启动的，其机理比较复杂，目前还不十分明了。,链的延长,引物合成后，由DNA聚合酶催化，在引物 3-OH末端逐一添加与模板链对应互补的脱氧核苷三磷酸。随着复制叉的推进，两条新链的合成方向是不同的：领头链:链的延长方向（5 3）与解链方向（复制叉移动方向）相同，为连续合成。,随后链：,另一条链延伸的方向与复制叉前进的方向相反，它显然不能被连续合成，需要复制叉推进了一定的长度，有了一段DNA单链后，才能以此
7、为模板合成一个片段。因此这条新链的合成是不连续的，而且总晚于先导链，所以称为随后链。,这种前导链连续合成，随后链断续合成的方式，称为半不连续复制。随后链中合成的多个DNA片段，称为冈崎片段。冈崎片段的长度原核细胞中约10002000个核苷酸，真核细胞中约100200个核苷酸。,引物酶在复制原点附近合成一段RNA引物；DNA聚合酶(原核细胞)在引物的3末端逐个添加脱氧核苷酸。随着复制叉的推进，亲代DNA双螺旋不断被解开，先导链也不断延伸。,先导链的合成,随后链的合成,引物的合成：随后链的每个冈崎片段都需要合成 RNA引物。也是由引物酶催化。,冈崎片段的合成：DNA聚合酶(原核细胞)在引物的3末端
8、使DNA链延伸，直至抵达其下游的另一个冈崎片段的RNA引物的5端。,随后链的合成,冈崎片段的连结：DNA聚合酶一边以其DNA聚合活性在上游冈崎片段的3-OH末端添加脱氧核苷酸，一面以其53核酸外切活性切除引物，直至将引物全部切除。DNA连接酶将最后的缺口补好。,先导链和随后链中DNA的延伸由同一个DNA聚合酶全 酶二聚体催化,随后链的模板回折成环，从而使冈崎片段的延伸方向与先导链的延伸方向一致，它们的3末端分别落在DNA聚合酶全酶的双活性部位。因此，随着聚合酶的移动，两条链同时延伸。,复制的终止,水解引物及填补空隙 冈崎片段合成后，由DNA聚合酶水解去除RNA引物，并填补留下的空隙(53)聚合
9、。最后由DNA连接酶催化连接成完整的链，从而产生完整的双链DNA分子。,九、DNA的复修修复步骤如下：（1）特异的内切酶与损伤部位结合，在损伤部位的5-端切断磷酸二酯键；（限制性内切酶降解陌生的DNA）（2）外切酶水解除去包括损伤部位在内的一小段DNA单链。（3）DNA聚合酶I催化以母体为模板进行修复53。（4）连接酶进行连接。,差错率为10-9-10-10,新合成的子链与母链之间碱基配对严格性使用引物RNADNA聚合酶对底物专一性DNA聚合酶的校对作用5.DNA修复机制,DNA分子的完整性对细胞至关重要，这一点是其它生物分子无法比拟的。在生物的进化中，DNA复制中可因DNA聚合酶催化作用引发
10、出偶然的错误。环境因素（如辐射、紫外光照射、化学诱变物等）也可引起DNA序列上的错误，这些错误若不能予以改正而保留下来，会直接影响机体的生理功能，以致影响到后代的正常生长和发育。但是，生物体内存在有效的修复（repair）体系，保证了DNA复制的高度精确性。,1.DNA损伤的原因,外环境中的射线：X-射线、紫外线等 高剂量的紫外辐射使DNA链上邻近的嘧啶核苷酸之间形成化学键，生成二聚体；此外还有脱嘌呤作用和脱氨基作用.,2.修复,所有细胞对DNA的损伤都有一定的修复能力，以恢复正常的DNA结构。,修复的方式：光修复、切除修复、重组修复、SOS修复,(1)光修复 由DNA光裂合酶（photoly
11、ase）催化。该酶需要光（400700 nm）才能激活，它能切除嘧啶二聚体之间的连键(C-C键)，从而修复由紫外照射而造成的损伤。,(2)切除修复 该类修复是指在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤的部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出新的被切去的部分，然后使损伤的DNA恢复正常结构的过程。切除修复系统可对多种损伤起修复作用。切除修复有核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER）和碱基切除修复（base excision repair,BER）两种。,(2)切除修复 修复机制:其过程是：切补切缝 由专一性核酸内切酶催化，在离损伤处附近切断 由DNA聚合
12、酶在断口处进行DNA合成 由5核酸外切酶将损伤部位切掉 由连接酶将新合成的DNA链与原来的链连接,知识窗 NER缺陷与癌症和遗传疾病,核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER）缺陷与癌症的发生有关，如着色性皮肤病是由于体内NER系统缺陷引起皮肤细胞对日光或紫外线特别敏感，其所形成的T-T二聚体就是因缺乏能切除T-T二聚体的特异性核酸内切酶所致，以致在后续的复制中造成遗传信息改变，最终出现皮肤癌。,一些常染色体退行性疾病患者对太阳光极其敏感。还有的患者在婴儿时期皮肤明显地改变，如干燥、进行性的雀斑和角质化（一种皮肤肿瘤）并伴有眼损伤如角膜溃烂、晶体混浊和神经退行性症等，进而发展为致死的皮肤癌，其发病率是正常人得此症的200倍。科凯尼氏综合症（cockayne syndrome CS）也是一种遗传疾病，与NER基因缺损有关，因此，CS患者对紫外照射高度敏感，表现出与皮肤癌同样的发病率。,2.修复,(3)SOS修复 细胞在紧急状态下，能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA的损伤部位进行复制，从而避免了死亡，但产生很高的变异率。,
