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1、第3章 生化过程中化学及生物参数检测技术,2,本章内容,3.1 pH的测量3.2 溶氧的测量3.3 细胞浓度的在线测量3.4 生物传感器及其应用,3,3.1 pH的测量,4,一 概述,在发酵过程中由于微生物的代谢(消耗碳源或氮源，释放代谢产物如酸等)会使得发酵液的酸碱度发生很大的变化，而发酵过程需要维持在一定的酸碱度范围内。在生化过程中，pH的控制和调整已成为过程操作不可缺少的变量。因此pH的测量在生化过程控制中具有无比重要的地位。pH：表示体系酸碱度的参数，为溶液中H+的活度，即 pH=-lgH+，其范围为014，pH7为碱性。,5,二 pH测量原理,pH一般是利用电化学原理进行测定。常用一
2、组电极来测量，即测量电极和参考电极。测量回路如下图a所示，pH电极结构如下图b所示。,a 测量电路,b 玻璃pH电极示意图,电势与pH的关系为：Eel=E0-S(pHa-pHi)Eel电极电势，E0零电位，pHi内部缓冲液pH，pHa待测溶液pH。,6,pH电极只对H+有响应玻璃膜的结构由固定的带负电荷的硅酸晶格组成骨架(以GL-表示),晶格中存在体积较小,但活动能力较强的Na+,起导电作用。玻璃电极长时间浸泡在水溶液中,膜的表面形成一层厚度为10-4mm10-5mm的水化层。玻璃的硅酸结构与H+结合键的强度远远大于Na+的强度(约1014倍),发生如下离子交换反应：H+Na+GL-=Na+H
3、+GL-,7,当玻璃膜与试液接触时,由于外部试液与玻璃膜的外水化层,以及内参比溶液与玻璃膜的内水化层中,H+的浓度不同,H+从高浓度向低浓度扩散。破坏界面附近原来正负电荷分布的均匀性。在两相界面附近形成双电层结构,产生相界电位(E外和E内)。玻璃电极的膜电位等于二者之差,即E膜=E外-E内；膜电位的产生不是由于电子的得失和转移,而是离子交换和扩散的结果。,8,9,在实际使用中常用的pH电极均为复合电极，即pH电极与参考电极以及温度传感元件复合在一起。现在，许多制造商可提供能够耐受加热灭菌的pH电极。原位灭菌时，一般在灭菌时需将电极安装在一个由发酵罐制造商提高的专用外壳，以使电极外部在灭菌时能耐
4、受0.1MPa的压力。,10,11,pH复合电极,12,二 pH传感器使用,1 使用使用时，常先将pH传感器加上不锈钢保护套，再插入发酵罐，大多数pH传感器都具有温度补偿。由于电极内容物会随使用时间和高温灭菌而不断变化，因而在每批发酵灭菌操作前后均需进行标定，即用标准的pH缓冲液校准。通常pH测定范围为014，精度 0.020.05，响应时间至少数十秒，灵敏度0.01。,13,pH的精确测量需考虑的条件：温度温度影响pH，只有同一温度下测量值才能比较。溶液的均一性在悬浮液中，通过搅拌来达到物理化、学性质均一。,14,工业pH测量,电极安装基本原则为电极浸入待测液中，与液面高度无关；安装在容易拆
5、装且具代表性的地方；有搅拌的反应器，注意安装位置与搅拌桨的距离等关系；为了保证玻璃膜总是充满内部缓冲液，电极与水平的夹角不小于15o；内有液体电解质的电极必须在正压下操作。,15,信号处理,信号具有高阻抗特性，长电缆易受干扰的影响。解决方法：一般，电缆超过5 m，最好安装前置放大器，超过20 m时，必须安装前置放大器也可采用同轴电缆连接电极，在有强电磁干扰的情况下则应使用同轴电缆，同轴电缆保护层应接地。,16,(1)校准,发酵过程中重新校准十分困难，必须在使用之前校准。即将pH电极浸没到含一种或多种标准缓冲液中进行校准。pH电极需与发酵过程使用的pH计连接，按常规校准方法校准。,17,(2)灭
6、菌,灭菌有发酵罐原位灭菌、高压灭菌锅单独灭菌和使用化学灭菌。,18,(3)校准的检查,灭菌会使pH传感器发生偏移，需再校准。现大型的发酵罐有该类无菌校准系统。也可无菌取出发酵液，在罐外测其pH，再与发酵罐上的pH传感器测量值进行比较进行校准。,19,2 维护,(1)电极功能维护清除污染物，防止老化(高温等)。避免污染的方法有：经常使用适当的溶剂冲洗电极；如果有固体物质沉淀膜表面，则可提高搅拌转速或增大通气速率来除去。如含有蛋白质的污染物，电极浸入胃蛋白酶溶液或HCl溶液几小时；脂类等，用丙酮或乙醇冲洗。,20,(2)电极储存,电极应贮存在参考电解液中，如干燥贮存需在参考电解液活化数小时才可使用
7、。,21,三 温度补偿,温度主要通过一下四个方面影响pH测量值：温度影响待测溶液的离子积温度影响电极斜率(见能斯特方程)；温度影响等温内插点位置；温度影响电极扩散相应时间。在实际测定时特别要注意，只有当电极标定与待测溶液温度相同时才能得到准确的pH测量值。,22,3.2 溶氧的测量,23,一 溶氧测定原理,溶氧(DO)影响细胞的生长、产物的生成。反应器中溶氧的检测远比温度等参数检测困难。溶氧检测主要有3种方法，均需利用膜将测定点与发酵液分离，使用前均需进行校准。导管法；质谱电极法；电化学检测法(极谱分析法)。,24,1 导管法,将惰性气体通过渗透性的硅胶蛇管充入反应器，氧从发酵液跨过管壁扩散进
8、入管内惰性气流，惰性混合气体的O2浓度在设管出口用氧气分析仪测定。该法由于管壁对扩散的阻力，响应速率较慢，需几分钟。此法简单,易于进行原位灭菌，但校准时，由于氧浓度远低于液体中与之相平衡的氧浓度，使得惰性气体的流动对校准产生很大影响。,25,2 质谱仪法,质谱仪电极的膜可将发酵罐内容物与质谱仪高真空区隔开。除了溶氧的检测外，质谱仪和导管法通常可检测任何一种可扩膜扩散的物质。,26,3 电化学检测法(极谱分析法),27,最常用的溶氧检测方法是可蒸汽灭菌的电化学检测器。市售电极有电流电极和极谱电极两种。二者均用膜将电化学电池与发酵液隔开。对于溶氧测定，膜仅对O2有渗透，对其它干扰物则不能通过。其原
9、理是O2通过渗透膜从发酵液扩散到监测器的电化学电池，O2在阴极被还原时产生可被检测的电流或电压，这与O2到达阴极的速率成比例。,发酵液,膜外表面,膜内表面,阴极,O2扩散,跨膜扩散,电极内扩散,28,阴极检测到的是O2到达阴极的速率，取决于它到达膜表面的速率、跨膜传递的速率及它从内膜表面传递到阴极的速率。忽略传感器内动态效应，O2达到阴极的速率与氧跨膜扩散速率、氧扩散至膜表面的速率相等，与氧传质总浓度驱动力成比例。假定膜内表面O2浓度可有效降为0，则扩散速率与发酵液中溶解氧成正比，阴极测定的电信号与发酵液中溶氧成正比。,29,二 溶氧电极原理,工业发酵过程需进行高温灭菌处理，因此测量溶氧采用耐
10、高温消毒的带金属护套的玻璃极谱电极。原理如下图所示，是按照Clark原理设计的复膜电极，复膜是由聚四氟乙烯膜和聚硅氧烷膜复合而成，它既有高的氧分子渗透性，又有贮氧作用，可用来测量气体中的氧和溶解氧。包括一个阴电极(铂电极)和一个阳电极(银电极)，两电极之间通过电解质连接。,30,1 阴极，2 气体渗透膜，3 外壳，4 电解质，5 阳极，6 绝缘体，7 电解质薄膜,当两电极之间加一极化电压(0.6-0.8V)，有氧存在时，电极上将产生氧化还原反应：,阴极：O2+2H2O+4e-4OH-阳极：4Ag+4Cl-4AgCl+4e-,由此可见，在两电极之间就会有电流产生,31,典型的极化曲线见下图。,3
11、2,当极化偏置电压一定时，电极极化电流的强弱与溶液中氧的分压呈线性关系，根据Fick定律有：,i 电极电流，k1 常数，D 膜中氧扩散系数，a 膜材料氧浓度，A 阴极表面积，X 气体渗透膜厚度，pO2 溶液中氧分压,若电极材料一定，物理特性和尺寸一定，那么k1、D、a、A、X 都确定，则：i=KpO2即电极电流与氧分压成正比关系。则可测定溶液中氧浓度。,33,由Henry定律可知，溶液中的氧浓度与其分压成正比CL=pO2aL其中：CL 溶氧浓度，pO2 氧分压，aL 溶解度常数如果aL是常数，则电极电流信号可直接转化为溶液。但aL受温度和溶液组成的变化而改变。因此，用溶氧电极来测量发酵液中氧含
12、量时，只有当罐内温度、压力及发酵液组成一定时才准确。,34,三 溶氧电极的使用,极谱电极在测量中的动态响应速度、稳定性、温度漂移特性都比较好，能适应工业发酵要求。典型电极性能如下：,35,36,对电极寿命和稳定性影响最大的因素是发酵罐的高温灭菌。为了消除这种损害，一般采用电极保护套的方法，将溶氧电极装在可伸缩的保护套，灭菌后再推入发酵罐。电极安装在发酵罐中最合适的位置，能准确反映发酵液中溶氧的变化，其安装开孔不影响灭菌及留死角。一般安装在中部偏下，安装时要有一定的向下的倾斜角，防止安装口积液或清洗不到。溶氧电极的使用，需要注意四个方面：搅拌、温度、压力、以及电极校准。,37,1 搅拌的影响,由
13、于溶氧电极在工作中存在明显的电流，自身消耗大量的氧。电极信号与氧向电极表面传递的速率成比例，而氧的速率受到跨膜扩散速率控制。这一速率与发酵液中氧的浓度成比例，其比值取决于总的传质过程。电极工作一般条件是，氧向膜外表面的传递速率很快且不受限制。整个过程受跨膜传递的限制，比例常数易维持恒定。故需合理搅拌以满足工作条件。,38,2 温度的影响,溶氧电极的信号随温度升高显著增强，这是因为温度影响氧扩散速率。因此在使用时要注意温度的影响。一些溶氧电极带有温度传感器等仪表，以实现自动温度补偿。在计算机控制的发酵罐，可以通过软件利用单独的温度传感器信号，自动进行溶氧补偿。,39,3 压力的影响,压力的变化会
14、影响溶氧电极的读数，是因为增大了发酵液中氧分压。一般是因为压头的改变(出口滤器或管路压降产生)。可采用下列方法进行校准：在大气压下对电极进行校准；在预期的操作压力下对电极进行校准；根据氧分压或溶氧浓度给出所有结果，基于校准条件下的计算机进行校准，这些是影响电极响应的最直接的参数。,40,在对发酵罐接种之前需对溶氧电极进行校准，一般采用线性校准，包括零点和斜率的调节。零点是在向发酵罐通入大量的N2后进行设定。不用氮气校验则一般在灭菌后立即进行(Why?)。斜率、灵敏度和量程校准，在接种之前通入最大空气流量，并使搅拌速率设定在发酵期间的搅拌速率，等到测量值显示稳定，校准该读数为100%氧分压。校准
15、时罐压应与发酵操作压力相同。,4 校准,41,3.3 发酵罐内O2与CO2分压的测量,42,一 氧分析,微生物生长代谢过程中要利用氧，微生物的氧利用率(OUR)是生化反应过程的重要参数，因此，测量发酵排出气体中的氧含量成为研究生物生长和产物形成的主要变量。氧浓度的分析测量主要采用磁风式氧分析仪(磁氧分析仪)。原理：利用氧具有极高的磁化特性设计而成，当氧气通过非均匀磁场的作用时，将会形成“热磁对流”或称“磁风”，该磁风对敏感元件产生冷却作用，利用此进行氧浓度的检测。,43,含氧混合气进入测量环室，氧气被磁场吸入水平管。水平管绕有被加热的铂电阻丝的电桥线圈a、b，进入水平管的氧气受热温度升高，氧的
16、磁化率随温度升高而降低，减弱磁场对氧的吸力。变热的氧分子不断被冷却的氧分子所补充而排出磁场，因此在水平管中形成氧的对流，“热磁对流”，其强度随混合气中氧含量变化。对流强度的改变，使桥臂线圈a、b产生不同程度的冷却，使桥臂电阻改变，由a、b接至电桥测量电路，在电桥中产生不平衡电流，电桥两端输出不平衡电压，该电压信号与氧含量成正比关系。,44,45,二 尾气CO2的检测,大规模工业发酵的CO2量的测定具有重要价值，是发酵过程控制中重要在线信息。确定产生的CO2量有助于计算碳回收。研究发现生物量生长率与CO2生成率成线性相关性，进而开发估计细胞浓度的模型，由在线检测CO2的数据估算比生长速率。,46
17、,发酵工业中常用的尾气CO2分压(浓度)检测仪为红外线CO2测定仪。其检测原理：在近红外波段CO2气体的吸收造成光强度的衰减，衰减量遵循朗伯-比尔定律，即：lg(I0/I)=aLcCO2式中：I0、I：入射光与衰减后光强度，a：光吸收系数，L：光通过气体的距离，cCO2：CO2浓度。,47,3.4 细胞浓度的在线测量的测量,48,一 菌体浓度的检测方法及原理,菌体浓度的测定可分为全细胞浓度和活细胞浓度的测定，前者的测定方法主要有湿重法、干重法、浊度法、和湿细胞体积法；后者使用生物发光法和化学发光法，如通过对发酵液中的ATP或NADH进行荧光检测实现对活性胞浓度的检测。,49,利用离线检测如细胞
18、干重法、显微镜计数法。光密度法有时可实现在线检测，其它的在线检测包括浊度法、荧光法、粘度、阻抗和产热等。市售的生物量传感器多是基于光学测量原理制成的，也有一些利用过滤特性、细胞引起的悬浮液密度改变，或导电性改变。,50,应用光密度原理的生物量在线检测技术对球形细胞有效，检测中使用可灭菌的不锈钢探头，通过法兰将探头直接插入发酵罐。市售的OD传感器基于对光的透射、反射或散射而实现测定。细菌的波长在可见光范围内；较大的微生物选在红外波长；动植物细胞可用浊度测定法估计。随着波长下降，基质对光的吸收增强而干扰测定，常采用绿色滤光器、红外二极管的处理。,1 光密度,51,52,2 电性质,低无线电频率下悬
19、浮液的电容与浓度相关，该浓度指由极性膜(即完整细胞)封闭的液体组分中悬浮相的密度。局限：最大可接受的电导率(连续相的)约24 mS/cm，高密度培养时所用的溶缩培养基容易达到极限。同时气泡在检测中会产生噪声。,53,54,3 热力学,产热与活细胞量成比例。厌氧生长的理论热力学推导产热系数YQ/O：460kJ/mol。热通量量热法适用于大规模发酵。,55,二 在线激光浊度计,在线激光浊度计测量生物质浓度的最大问题是发酵液中的空气或CO2气泡对检测测量信号的扰动，从而影响测量的准确性和可靠性。最简单的可实现的方法：采用合适的线性迭代分析算法来随机处理和分析采样数据，对信号进行平滑处理，从而得到生物
20、质的干重浓度、比生长速率等重要信息。检测系统如下：,56,3.5 生物传感器及其应用,57,3.5.1 生物传感器,定义将生物体的成份（酶、抗原、抗体、DNA、激素）或生物体本身（细胞、细胞器、组织）固定化在一器件上作为敏感元件的传感器称为生物传感器。历史1962:Clark&Lyon 引入生物传感器的概念1971:Updike&Hickes 构建了第一个生物电极,58,生物传感器的基本组成敏感元件（分子识别元件）和信号转换器件,59,生物传感器的工作原理,（1）将化学信号转变成电信号 已经研究的大部分生物传感器的工作原理均属这种类型。酶传感器：酶催化特定底物发生反应，从而产生一种新的可供测量
21、的物质，用能把这种物质的量转变为电信号的装置和固定化的酶相耦合，即为酶传感器。,60,（2）将热能变化转换为电信号（3）将光效应转换为电信号（4）直接产生电信号,61,62,1、酶传感器,定义 酶传感器是一个复合电化学方法和酶系统的装置。它能对待检测的物质进行高度选择性和敏感性的检测。其核心是一个复合酶的生物膜电极，利用酶专一性地高效催化待测物的反应，同时结合电化学方法产生能检测的电信号。基本原理在控制的条件下酶催化的反应速度正比于底物的浓度。,63,检测葡萄糖的酶电极结构,O2 electrode,O-ring,Sample solution,Teflon membrane,Glucose
22、oxidase-PVCNylon net,Air,Recorder,O2+Glucose H2O2+gluconic acid-O2 probe to measure O2 concentration change,oxidase,64,65,More examples,Analyte Enzyme SensorGalactose半乳糖Galactose oxidase H2O2Ethanol(NADH)Alcohol dehydrogenase Pt/FeCN4-Urea尿素 Urease O2Pyruvate丙酮酸盐Pyruvate oxidase O2Cholesterol Choles
23、terol oxidase H2O2Lactose乳糖-galacttosidase+alcohol oxidase O2Aspartame Chenotrypsin+alcohol oxidase O2 Penicillin Penicillinase pHL-amino acid Amino acide oxidase NH3,66,2、组织传感器,以动植物组织薄片材料作为生物敏感膜的电化学传感器，系酶电极的衍生型电极。动植物组织中的酶是反应的催化剂，与酶电极比较，组织电极具有如下优点：1）酶活性较离析酶高 2）酶的稳定性增大 3）材料易于获得,67,肝组织电极的研究及应用,动物肝组织中含
24、有丰富的H2O2酶，可与氧电极组成测定H2O2及其它过氧化物的组织电极。1981年Mascini等研究了数种哺乳动物和其它动物（鸟、鱼、龟）的肝组织电极，报道了基于牛肝组织的H2O2电极。,68,牛肝-H2O2电极 取0.1mm厚牛肝一片，覆盖于氧电极的特氟隆膜上，用“O”型橡皮圈固定，即成牛肝组织电极。在pH6.8的缓冲液中，使电极与空气中的氧平衡，然后加入底物，底物为浓度大于1O-5molL H2O2溶液。反应产生的氧气到达氧电极的特氟隆膜时，使电极输出增加。在110-4mol/L底物浓度时，1.5min即可获得稳定电流。,69,向溶液中通氮气，降低氧的溶解度，减少空气平衡溶液中氧的残余电流（约10A）至十分之几微安，检测下限降低至110-5molL，相关系数：R=0.997（n9）,70,3.电化学DNA(基因)传感器,71,发酵工业中传感器的特点,1.传感器能安装在发酵罐内耐受高压蒸汽（120-135、30min以上）灭菌处理；2.传感器及二次仪表具有长期工作稳定性，在1-2周内其测定误差应小于5%；3.使用过程中可随时校正；4.材料不易老化，使用寿命长；5.传感器探头安装和使用方便；6.探头不易被物料粘住、堵塞；7.价格便宜,
