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1、Institute of Modern Separation Science,生物大分子的色谱分离技术及应用,白 泉 教授,西北大学现代分离科学研究所,Institute of Modern Separation Science,Northwest University,Key Lab of Modern Separation Science in Shaanxi Province,Key Laboratory of Synthetic and Natural Functional Molecule Chemistry of Ministry of Education,Xian,710069,
2、China,第一节 反相高效液相色谱High Performance Reversed-Phase Liquid Chromatography(RPLC),一、RPLC的特点,1、具有分离效果好，分析速度快，检测灵敏高，重复性好，易于直接定量而后实现自动化。2、采用有机溶剂作流动相，比盐水体系易从样品中除去有机溶剂，后处理比较方便。3、比其他几类HPLC法分辨率高，同样长的柱子，它分离蛋白质的数目较其他方法多。4、若蛋白使用此方法不失活时，RPLC是除去热源非常有效的方法，也是分离纯化非常有效的工具。如IL-2,-IFN和胰岛素等纯化中常用RPLC。即使是蛋白质在分离后无生物活性，仍可进行一级
3、结构的测定。它也是蛋白质氨基酸序列分析前处理非常有效的工具。,二、缺点,1、固定相疏水性过强，极易造成蛋白质的构象不变化,而导致蛋白质变性失活。2、流动相采用有机溶剂和低pH，也可使蛋白质的活性降低，对蛋白质易污染。3、有机溶剂有毒，对环境易造成污染，且有机溶剂不易除去。,四、保留机理,疏溶剂化理论,认为溶质或蛋白质在RPLC上进行分离时，与生物膜中的流动镶嵌结构(Fluid mosatic model)有某些相似之处。在这个模型中，蛋白质的非极性区与膜中的类脂部分(相当于反相色谱填料的配体)相邻，而蛋白质的极性部分则暴露于含水的环境中(相当于流动相)。既蛋白质在RPLC分离过程中，疏水效应起
4、着重要的作用。,这个缔合产物可用图5-1表示。当非极性溶质或溶质分子中的非极性部分引入到极性的流动相时，分子中的非极性部分总是趋向与其它非极性部分蔟集一起，这样可以减少与极性溶剂的接触面积，使体系能量最低，这是由于图中黑箭头所示的疏溶剂力的缘故。流动相的表面张力越高，这中束缚力就越强。相反，若溶质分子中有极性官能团存在时，则和极性溶剂的作用力(空箭头所示)增加，不利于与固定相的缔合。,五、固定相,1、基质刚性基质：硅胶、玻璃球等半刚性基质：交联聚苯乙烯聚合物等软基质：琼脂糖，Sepherose,Sepherdex要求：粒度：5-10m 孔径：小分子：100A 大分子：200500A,2、配体
5、非极性化合物C2,C4,C8,C18等，苯环长链烷烃随着碳数的增大，疏水性增大，保留值增大。对不易保留的物质，采用长链；对易保留的物质，可用短链。长链由于空间位阻，键合密度小。链长，可掩盖硅羟基。,六、流动相,1、要求在210nm-280nm的紫外吸收要小。溶剂要容易除去。峰形要窄。高的生物活性和质量回收率。价格低，毒性小。选择性好。,2、常用有机溶剂：甲醇，正丙醇，异丙醇，乙腈，四氢呋喃等3、离子对试剂：三氟醋酸，磷酸，甲酸作用：与蛋白质形成离子对使其在有机溶剂中溶解。抑制硅胶键合相留下的硅羟基对蛋白质的二次吸附。,七、洗脱方式,小分子：等浓度洗脱 生物大分子：梯度洗脱,1、A液：H2O+0
6、.1%TFA B液:H2O+甲醇+0.1%TFA2、A液：H2O+0.1%TFA B液:H2O+乙腈+0.1%TFA3、A液：H2O+0.1%TFA B液:H2O+正丙醇+0.1%TFA4、A液：6 mol/L 甲酸+H2O B液:4 mol/L 甲酸+H2O+72%(V/V)异丙醇,洗脱剂强度增加,八、影响分离条件的因素,pH离子强度与离子对试剂有机溶剂表面活性剂温度流速,2.离子强度与离子对试剂,当pH值被设定后,缓冲液中的离子强度也常用来调节蛋白质的保留。增加离子强度，增强了蛋白质与键合相间的疏水作用。在多数情况下，较高的离子强度(0.2)可使蛋白质有较好的分辨率和回收率，降低离子强度会
7、引起峰形变宽，分辨率降低。但有些蛋白质如卵蛋白及磷酸化酶B在低离子强度时收率反而提高。,缓冲液中的盐和酸除了起缓冲作用外,还通过离子对的形成改变蛋白质的表面极性,从而影响蛋白质的保留性和选择性。例如在低pH时,蛋白质的带正电荷功能团与带负电荷的反离子形成离子对复合物。这种复合物具有与蛋白质本身完全不同的色谱性质。如果反离子是疏水的(如三氟乙酸根或七氟丁酸根)，则使形成的复合物的保留时间增加。如果反离子是亲水的(如磷酸根或甲酸根)，则使复合物的保留时间减少。实际上蛋白质保留时间的改变还涉及离子对对硅醇基的作用。在C3柱上分离牛血清蛋白和-乳球蛋白，在其他色谱条件相同情况下，如用离子对试剂七氟丁酸
8、，这两种蛋白质在几分钟内就可分开，但如改用三氟乙酸，则两者就分不开。,3.有机溶剂,通过疏水作用结合在反相柱上的蛋白质需要有机溶剂把它洗脱下来，因此有机溶剂的选择是改变大拿比值保留性质的重要手段之一。较常用的溶剂有乙腈和丙醇，不常用的有甲醇、乙醇、二氧六环及四氢呋喃等。对蛋白质而言，疏水性较大的丙醇是个较好的溶剂，因为丙醇洗脱蛋白质的浓度比其它溶剂低，因而减少了蛋白质变性及失活的可能性。适当使用一种以上的有机溶剂如异丙醇-丁醇、乙腈-异丙醇等可进一步降低有机溶剂总浓度并改变分辨率及回收率。,5.温度,蛋白质在RPLC分离过程中构象会发生变化，这也与温度有关。提高柱温往往可以改变蛋白质的保留时间
9、和收率，但必须考虑到提高柱温也会引起蛋白质的不可逆变性和失活，因此蛋白质分离一般得在室温或低温下进行。,6.流速,由于蛋白质的分子大，扩散慢，所以较低流速有利于提高分辨率。,九、应用,重组人IL-2的纯化重组人-IFN蛋白质氨基酸组成的测定酶活性的测定胰岛素的纯化,图8-10 在RPLC中两种流动相对标准蛋白的分离图a.甲醇-水-TFA体系 b.醋酸-水体系,第二节 离子交换液相色谱(Ion exchange chromatography,IEC),一、离子交换过程,1、阴离子交换剂硅胶-R+Y-+X-硅胶-R+X-+Y-2、阳离子交换剂硅胶-R-Y+X+硅胶-R-X+Y+,二、特点,流动相为
10、盐水体系，操作条件比RPLC温和，蛋白在IEC分离时多以活性状态存在。IEC流动相价格比RPLC便宜，且易处理，对试剂纯度要求相对较低。蛋白质在IEC时依蛋白质与配体间静电作用力不同而达到分离的，与RPLC的疏水作用力不同，蛋白质与配体作用温和。IEC与RPLC分离效果相差不太大，两种分离方法可互为补充。IEC质量负载非常高，一般每克填料可达50-200mg的蛋白质。IEC既可使用pH梯度也可使用盐梯度洗脱蛋白质，使这种方法具有更高的适用性和灵活度。,三、保留机理,1、静电作用模型 离子交换过程主要是由静电作用控制的，其保留次序取决于配体与蛋白质间的静电作用力大小。作用力的保留时间长，作用力小
11、的保留时间短。蛋白质与配体间的静电作用力可用库仑定律来描述：F=Q1Q2/r2这里Q1和Q2表示作用离子的点电荷,为介电常数，r为两点电荷的距离。蛋白质与固定相之间不是点电荷的作用，但它们仍然可以近似地使用上式来描述。,在IEC上分离蛋白质时，IEC固定相的配体表面要吸附一层相反电荷的离子来保持其电中性，从而形成了双电层，如图4-9所示。双电层厚度直接正比于配体的密度。蛋白质表面带有电荷也呈现出相同的性质，当蛋白质在交换过程中遇到固定相的双电层时，蛋白质表面和固定相表面的离子会重新分布，即原先吸附在两个表面的离子被排除，蛋白质和配体吸附在一起。要从离子交换剂上解吸附蛋白质，必须增加与蛋白质所带
12、电荷相同离子的离子强度。,蛋白质所带电荷的多少，是由蛋白质分子的酸性和碱性氨基酸残基共同决定的。在酸性条件下，碱性氨基酸残基被电离，而羧基电离被抑制，蛋白质获得净的正电荷；与之相反，在碱性条件下，羧基被电离，氨基被中和，蛋白质获得净的负电荷。而在中间某个pH时蛋白质的净电荷为零，此时的pH值称之为蛋白质的等电点(pI)。pH=pI，由于不带电荷，蛋白质在IEC上不保留。pHpI，蛋白质带负电荷，它将在阴离子交换柱上保留，在阳离子交换柱上不保留。pHpI，蛋白质带正电荷，它将在阳离子交换柱上保留。,表6-1 Kopaciewicz在HPIEC上研究蛋白质保留行为时所用蛋白质的等电点和分子量,五、
13、固定相,固定相配体的密度、性质以及颗粒和孔径大小对蛋白质的分离都有影响。常用的离子交换基团：WAX:-NH2,-NHR,-NRRSAX:-NR3+,-N+WCX:-COOHSCX:-SO3H,-PO4H2,阳离子交换基,强酸性，聚苯乙烯树脂,弱酸性，羧甲基纤维素,弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂,阴离子交换基,强碱性，聚苯乙烯树脂,弱碱性，二乙氨乙基纤维素,Ion-Exchange chromatography,If pH mobile phase=7.2 Then charge of the proteins:(-)(-)(+)(+),Anion exchange column=+charge
14、d,Increased salt concentration,Ion-Exchange chromatography,-,-,+,+,目前有两种离子交换填料在国际上被认为是较好的：一是Mono beads系列，它是通过化学改性使高聚物基质微球具有亲水性，然后再接上季胺基团或磺酸基团制成具有大的孔结构和中度交换容量的阴阳离子交换剂Mono Q和Mono S。这种系列填料对于生物大分子样品有非常好的分离度、回收率、负载量和穿透性，其应用非常广泛。二是TSK gel PW系列，它们是以亲水性高聚物为基质的填料，也是一中大孔度、小颗粒、中度交换容量的离子交换剂，应用也非常广泛。,三、非多孔填料,这些填
15、料同前面所讲的反相填料一样，特别适合于蛋白质的快速分离。它包括无机基质和有机基质两部分。无机基质仍以硅胶为主，有机基质可供选择的余地较大，有亲水性高聚物基质、交联聚苯乙烯基质、交联琼脂糖基质。目前已有许多商品出售。用于分析用的非多孔填料一般粒度为几个m，颗粒小而均匀，分析速度快，分离度、柱效和样品的回收率高，特别适合于分离具有生物活性的蛋白质。,2、pH,pH值的变化既可改变蛋白质的净电荷还可以影响配体的电离程度，造成蛋白质在HPIEC上的保留产生不同的改变，从而的大分离。因此，在HPIEC上可以通过改变pH来获得选择性地分离。使用pH梯度分离蛋白质时，pH是采用增加还是减小的方式进行并没有规
16、律可循，只能通过实验来摸索。,使用HPIEC分离蛋白质时，通常流动相的pH值高于或低于pI一个pH单位。即pHpI+1或pHpI-1。pH值远离的越多，蛋白质的保留值就越大。当pH远离pI2-3个单位时，多数蛋白质的保留时间对pH作图就会出现一个平台。此时再想通过增加pH值来获得大的保留值意义就不大了。从理论上讲，可以发现一个pH值，在这个pH时，欲分离蛋白脂的保留时间与其它不同，若此时pH值对蛋白质的生物活性无影响，就可以认为此时的pH值就是最佳分离条件。但此点必须通过实验才能得到。,、洗脱方式,在HPIEC上分离蛋白质，常常用改变盐浓度的浓度梯度方式，在低的盐浓度时，蛋白质与配体结合，随着
17、盐浓度的增加，蛋白质依次被洗脱下来。,梯度洗脱主要是通过改变梯度洗脱时间来选择比较好的分离效果。梯度时间延长，分离度增加，但同时又使峰形变宽，造成检测的灵敏度降低。从另一方面来讲，梯度时间太长，蛋白质在柱子上的停留时间增加，对蛋白质结构的稳定性并不太好，因此，梯度时间的选择要适中。,5、温度,温度常常造成蛋白质构象的改变，其结果会造成蛋白质表面的电荷重新分布，从而影响蛋白质的保留值。温度的改变也可用来改变蛋白质的选择性。,6、添加剂,在HPIEC上分离蛋白质时，有许多蛋白质的溶解度较低，造成柱子的负载较低。为了克服上述缺点，常加入一些添加剂来增加蛋白质的溶解度。非离子去垢剂和两性离子去垢剂在H
18、PIEC上常常被使用。6mol/L脲既可用来溶解蛋白质也可使蛋白质解离。有机溶剂乙二醇、乙醇和丙酮在HPIEC上有时也被用来溶解蛋白质。当然添加剂出来增加蛋白质溶解度外，还可以改善分离的选择性。,为了在HPIEC上获得一个好的分离结果，可通过改变以下条件来获得最佳分离结果：调节离子强度选择最佳pH改变盐的种类或抗衡离子，改进选择性。调整梯度洗脱时间用添加剂来调整选择性。,七、应 用,1、肿瘤坏死因子(TNF)2、膜蛋白3、血红蛋白4、单克隆抗体5、TGF-半乳糖苷酶,第三节 高效疏水相互作用色谱High Performance Hydrophobic Interaction Chromatog
19、raphy(HPHIC),一、历 史,1961年，Gillam等使用苯甲酰二乙氨基乙基纤维素对核酸进行了分离。1972年Er-Z等将不同链长的,-二胺同系物键合在琼脂糖上，以不同pH值的盐溶液作为流动相分离和纯化了糖原磷酸化酶。1973年Hjerter明确提出了靠疏水基团的疏水力进行色谱分离的概念。80年代初期，由于硅胶基质的应用，HIC才得以迅速发展，成为HPHIC。,二、定 义,用适度疏水性的固定相，以含盐的水溶液作为流动相分离生物大分子的液相色谱法叫做疏水相互作用色谱法。,三、特 点,溶质保留过程有一个与其他色谱相反的温度系数，即温度增加，保留时间增长。在相对高的盐浓度下吸附于固定相，而
20、在低盐浓度时洗脱下来。固定相疏水基团的极性大于HPRPC。,1、疏溶剂化理论,Melander和Horvath根据Sinanogh和Abdulman的空穴理论，考虑溶质与疏水配体之间通过疏水相互作用二形成络合物，形成络合物过程的推动力来自于蛋白质分子所具有的减少与水接触非极性表面的倾向，此过程造成自由能的降低。这时，自由能的变化除和蛋白质与配体作用的空穴生成自由能Gocav、静电作用自由能Goes、范德华作用自由能Govdw有关外，还与蛋白质和配体与溶剂作用自由能Gored、无溶剂存在时蛋白质与配体Goassc有关。,Ink=Km-Sm,式中Km和S为常数，m为盐的质量摩尔浓度。当用lnk对盐
21、浓度m作图时应得一条直线。Km为截距，表示当盐的质量摩尔浓度为0时，即纯水中的lnk值。S为斜率，是一个与蛋白质和配体作用的接触面积有关的常数。,在高盐浓度下,每种自由能变在一定条件下都正比于盐的质量摩尔浓度,在压力P和温度T恒定的条件下(由于R为普适气体常数,为柱相比),上述关系可简化为:,在盐的水溶液中，盐的质量摩尔浓度与溶液的表面张力成正比。因此，在溶液中加入盐后，溶液的表面张力就会增加，这样便会导致体系的自由能增加，有利于蛋白质之间和蛋白质与配体之间的接触。这个模型只适用于对蛋白质有强的盐析作用而无特异作用的盐。,盐析盐：减小蛋白质的溶解度，增加其稳定性。盐溶盐：增加蛋白质的溶解度，减
22、小其稳定性。,盐 KSCN NH4NO3 NH4Cl NaCl Na2HPO4(NH4)2SO4 Na2SO2 0.45 0.85 1.39 1.44 2.02 2.16 2.73 盐溶盐 盐析盐,对于那些具有特异性作用的盐，如MgCl,CaCl以及具有盐溶盐性的盐，如KBr,胍,SCN-等，将不遵守这个规律。另外，在流动相中存在着有机添假剂如蔗糖和表面活性剂等时，其结果也不能用此方程来描述。,三、填 料,基质配体合成,1、基 质,软基质：琼脂糖Sepharose，葡聚糖Sephadex硬基质：硅胶silica，扩孔玻璃，聚合物基质,2、配 体,配体大多数是一些含N或O原子的中等疏水性的有机基
23、团。HPHIC上，填料对蛋白质的作用强弱主要取决于配体的性质和密度。蛋白质的保留值与配体中烷基碳链长度成正比，烷基链越长，保留值越大。配体的密度除影响填料的疏水特性外，还会影响柱容量。填料的配体密度增大或配体碳链长度的增加都增强了填料的疏水性；而增加配体的极性组分比例则能减小配体的疏水性。所以，选择合适的配体是HPHIC的一个关键。,四、影响分离的因素,离子强度盐添加剂固定相的疏水特性pH值温度填料孔径,2、盐,盐的种类对洗脱能力的影响可以从两个方面来说明。一是用盐的摩尔表面张力增量来定量说明对保留的影响，盐的摩尔表面张力增量大，则蛋白质在HPHIC中保留值也大。二是各种盐和离子破坏水的有序排
24、列的能力，这种能力的大小即洗脱效率的顺序是与Hofmeister系列一致的。洗脱能力依次为KSCN CaCl2 NH4Cl NaCl(NH4)2SO4 Na2SO4 许多高浓度的盐溶液对大多数蛋白质是无害的。园二色谱实验表明，无论3mol/LNaCl或是1mol/LNa2SO4都不改变牛血清白蛋白和卵清蛋白的构象。某些离子如SO42-可以提高蛋白质构象的稳定性，同时能使蛋白质溶解度下降，对蛋白质有盐析效应，使蛋白质与固定相的疏水作用增强，这些盐或离子洗脱能力较弱；但有些离子如Ca2+,SCN-等能降低蛋白质构象的稳定性，使蛋白质发生不同程度的变性，同时也能提高蛋白质的溶解度，有盐溶效应，这些盐
25、或离子的洗脱能力较强。,按照盐析效应和洗脱能力，可将离子和盐排列如下顺序：负离子：PO43-,SO42-,CH3COO-,Cl-,Br-,NO3-,ClO4-,I-，SCN-正离子:(CH3)N+，NH4+,K+,Na+,Li+,Mg2+,Ca2+,Ba2+盐：KH2PO4,Na2HPO4,(NH4)2SO4,KAC,NaAC,NaCl,NaNO3,Na2SO4,盐析作用增强,洗脱能力增强,由上述可知，选择合适的盐对分离后蛋白质的活性和分离效果都很重要。在HPHIC中，(NH4)2SO4、NH4AC、磷酸盐和氯化钠等都是常用的盐，其中(NH4)2SO4应用最为广泛，其主要原因为溶解度大，对蛋白
26、质活性影响小，盐析能力强。,3、添加剂,在流动相中添加少量乙二醇、尿素、蔗糖等物质，降低流动相的极性可以使蛋白质保留作用减弱。表面活性剂也常被用来作为流动相的添加物，它可以改变蛋白质的保留性质。在添加这些物质时要注意它们对样品活性的影响。,4、固定相的疏水特性,在HPHIC中，首先固定相要具有明显的疏水特性，对蛋白质的作用尽可能不附带静电引力，范德华力和氢键等；另外其表面疏水基团的密度又要适中，一般较反相色谱固定相低10-100倍，呈弱疏水性，对蛋白质的吸附为中等强度，密度太高会对蛋白质产生不可逆吸附。,Fig.2.Chromatograms of lysozyme from four kin
27、ds ofHPHIC with various hydrophobicities columns(4.0 mm I.D.100 mm).1,PEG-400;2,PEG-600;3,PEG-800;4,phenylgroup.Except flow rate of mobile phase being 1.0 mL/min,theother chromatographic conditions are the same as that shown infig.1(b).AUFS:0.08.Sample size:20 mL 5.0 mg/mL lysozymeand final concentr
28、ation in collected fraction was 0.10 mg/mL.,Fig.3.Chromatograms of four proteins from three kinds ofHPHIC with a comparable hydrophobicity but different ligands.(a)PEG-600;(b)THFA;(c)phenyl group.1,Cytochrome-C;2,myoglobin;3,lysozyme;4,a-chymotrypsin.AUFS:0.08.The concentration of each protein was 5
29、.0 mg/mL.The absoluteamounts of them are:40,30,15 and 30 mg for 1,2,3,and 4 andtheir final concentrations are 0.133,0.100,0.075 and 0.10mg/mL,respectively.Except flow rate of mobile phase being0.8 mL/min,the other chromatographic conditions are the sameas that indicated in fig.2.,6、温度,对大多数蛋白质来说，在一定范
30、围内，温度升高会增大保留值，但同时易使溶解度变小，生活活性降低。所以HPHIC一般在相对稳定的室温或低于室温下操作。温度增加，蛋白质内部更多的疏水基团暴露到蛋白质的外部，使之与配体的作用增强，保留时间增加，但不同的蛋白质对温度的稳定性选择性。,五、蛋白质在HPHIC与HPIEC保留行为的比较,柱子的类型是决定蛋白质保留行为的关键，不同类型的色谱柱对蛋白质保留顺序影响很大。蛋白质在HPHIC和HPIEC柱上的保留顺序见下面的结果，由此可以看出，打那笔直在两类柱上的保留顺序完全不同。这些不同主要是柱子类型不同所造成。当然，盐也会部分地影响蛋白质的保留顺序，但相对于柱子类型不同造成的变化来讲则很小。
31、,HPHIC：-糜蛋白酶原-A-淀粉酶溶菌酶OVABSA肌红蛋白细胞色素-cHPIEC:溶菌酶-淀粉酶细胞色素-c-糜蛋白酶原-A BSAOVA肌红蛋白,蛋白质在理想的HPHIC柱上保留时应该只与蛋白质与柱子间的疏水作用力有关，但在实际上，往往有不同程度的偏离。,在HPHIC上除了疏水作用力外，还有静电作用力存在。为了避免这种作用力对疏水作用力影响过多，常限制HPHIC在高的盐浓度下使用，即盐的浓度一般要大于0.5mol/L。,蛋白质在HPIEC上的分离是靠蛋白质与填料之间的静电作用力不同来实现的，为了证实疏水作用力的存在，通常加入一些极性有机溶剂如乙二醇、异丙醇和乙腈等。通过观察保留值减少的
32、程度来证明疏水作用在HPIEC对蛋白质保留贡献的大小。,以上结果说明蛋白质在HPHIC和HPIEC柱上进行分离时，疏水作用力和静电作用力同时存在，它们共同控制着蛋白质的保留，只是在HPHIC上以疏水作用力为主，在HPIEC上以静电作用力为主。当然这两种作用力的大小在不同类型的色谱上是有所区别的。,六、蛋白质在HPHIC和HPRPC上保留行为的比较,1、流动相 RPLC的流动相中有机溶剂的洗脱能力强而水最差，而在HPHIC中水的洗脱最强，盐溶液最差。盐 水 极性有机溶剂 HPHIC RPLC 洗脱能力小 大 因此在RPLC中有时常加入一些盐濑增加蛋白质的保留，在HPHIC加入一些有机溶剂来减弱蛋
33、白质与配体间的疏水作用，使蛋白质更易洗脱。,2、柱子配基 HPHIC HPRPC极性非极性相间 多为非极性配体配体密度低 配体密度高疏水性弱 疏水性强配体链较长 配体链有长有短,3、温度 随着温度的增加，蛋白质在HPHIC上的保留值增大，而在反相色谱上的保留减小，二者受温度的影响是相反的。,六、应 用,-IFN-IFN单克隆抗体IL-2,第四节 高效亲合色谱High Performance Affinity Chromatography(HPAFC),二、定义,亲合色谱是基于分离物与配体间特异的生物亲合作用来分离生物大分子的一种色谱技术。,三、特点,其它几类色谱的作用机理与HPAFC不同。HP
34、AFC是基于配体与分离物间的特异性亲合作用，分离选者性强，效果好，纯化倍数比其它几类色谱高。其它几类色谱除HPHIC外，即可用于分离小分子，也可用于分离生物大分子，而HPAFC仅适合于分离生物大分子。与其它几类色谱不同，HPAC很少讲板高和理论塔板数。因为这些理论在HPAFC上无意义。HPAC柱子的专用性强。,四、缺点,柱子的专用性强，成本高，有时易产生不可逆的吸附造成分离无失活，分离的动力学过程慢，柱子寿命短，在制备填料时对制备技术要求高。,五、作用机理,蛋白质在HPAC上的分离主要以来于配体与分离物间的识别，而这种识别作用符合所谓的锁匙作用模型和诱导作用模型，具有高度的生物选择性。L+E=
35、LE,K1为平衡常数，Ls是配体的表面浓度，LEs是溶质结合配体的浓度，Em表示溶质在流动相中的浓度。当在比较低的溶质浓度时，而且假定L与E的结合符合线性吸附方式，LsLEs可近似认为等于Ls。,溶质的保留与配体密度和分离物之间的特异亲合作用常数有关，平衡常数越大，其越难洗脱；配体密度越大，保留时间越长。,使用HPAFC分离生物大分子时，亲合平衡常数变化范围可以从102到1015M-1(单位为1/mol)。,Affinity chromatography,Makes use of specific binding interactions between molecules,1-Incubat
36、e crude sample with the immobilized ligand,2-Wash away non bound sample components from solid support,3-Elute,六、固定相,HPAFC填料的基本组成,、核心问题 亲合色谱固定相的合成较困难，有较高的要求。主要是因为亲合色谱固定相由三部分组成。,在合成HPAFC填料时，应记住以下几个原则：合成的方法要有重现性，不改变配体的结合常数、选择性或洗脱物与配体间的解离常数，配体键合在基质上后，所有键合配体的结合常数要尽可能均匀；填料要有尽可能小的非特异性吸附，分离机理和化学稳定性要保持不变；配体的
37、密度要满足要求。,、配体,所选择的配体应与被分离的蛋白质间有一种特异性的生物亲合作用。抗原 antigens，底物 substrates，抑制剂 inhibitors，变构因子 allosteric effectors，协助因子 cofactors，核苷酸 nucleutides，激素 hormones，酶 enzymes，抗体 antibodies，核酸 nucleosides，半抗原 hapten，受体 receptors，合成染料 synthetic dyes，糖 sugars。,特异性配体只针对单一的物质进行特异的结合而与其它物质不作用。抗体抗原，抗生素蛋白生物素，激素受体，蛋白受体这
38、类配体的选择性高，使用方便，但为数较少，其特异性常随分离条件发生变化，因此，对不同的分离对象为获得特异性配体，常常需要通过大量的实验进行筛选。,通用性配体通用性配体在一定条件下可与一类或几种生物分子作用，这种配体一般为小分子。具有容量高，花费低等突出优点。另外，通过改善吸附和洗脱条件，可以弥补通用性配体亲合色谱特异性较差的缺点。三嗪染料，金属螯合、组氨酸、核苷酸等。,1、三嗪染料 三嗪染料是多环芳香族的硫化物，含有三嗪反应基团，与基质的连接很容易，有许多官能团可以和蛋白质进行作用，在分离时与蛋白质作用包括离子交换、疏水和电荷转移等。在一定的pH和离子强度下，染料与蛋白质表面残基上的电荷和疏水性
39、差别等综合因素造成蛋白质对染料的选择性吸附。染料对蛋白质的作用机理还不清楚。,2、金属螯合配体金属螯合配体是利用过渡金属如Fe2+,Ni2+,Cu2+和Zn2+等能与电子供给体N，S和O等原子以配位键连接。用亚氨二乙酸类螯合剂与重金属离子作用，生成带有多个配位基的金属螯合物。这类螯合物在水溶液中与水分子高度溶剂化，具有活泼的羟基和由盐产生的活性基团。这些与基质连接的金属螯合物上的配价位点就是生物分子的吸附位点，这些位点在溶液中由溶剂分子或阴离子占据。因此，在制备连接基质的螯合物配体时要综合考虑两个因素。即配价金属的稳定性和金属螯合物的配价位点。不同吸附位点的螯合物对蛋白质的选择性和容量也不相同
40、。金属螯合物与蛋白质的作用主要通过静电吸附、配价键结合和共价键结合三种方式进行作用。,Commonly used affinity columns:Ni2+binds to poly Histines(example 6xHis)Specific antibodies(anti-Flag tag)glutathione binds to GSTProtein A or G binds antibodies,Affinity chromatography,Ni-NTA columns,The high affinity of the Ni-NTA resins for 6xHis-tagged
41、proteins or peptides is due to:1-the strength with which these ions are held to the NTA resin,NTA has a tetradentate chelating group that occupies four of six sites in the nickel coordination sphere,2-the specificity of the interaction between histidine residues and immobilized nickel ions,3、外源凝集素 C
42、on A是外源性凝集素，对糖蛋白具有强的亲合力，因此可以从混合溶液中将糖蛋白分离出来。4、核苷酸 AMP对脱氢酶具有良好的亲合力，可以用来分离脱氢酶及其同功酶。5、组氨酸 组氨酸也是一个很好的通用配体。在氨基酸中组氨酸具有很过独特的性质，如它的疏水性很弱，由于咪唑环使其电子转移的可能性很小，其pK值范围宽，具有不对称的碳原子等。这些性质决定了组氨酸能以多种形式与蛋白质进行作用，而且当适当的基团与基质作用后，还会出现与蛋白质特异的偶极诱导作用。现在已有很多实验证明组氨酸与蛋白质的作用主要涉及静电吸附和疏水作用两方面。此类亲合色谱柱已有商品柱出售。,C、间隔臂,在一些情况下，配体可以直接连在基质上
43、，但大多数情况下，由于载体的几何位阻常常限制分离物与配体的结合，尤其是当配体为小分子，分离物为大分子时更为严重。为了使配体能与分离物的作用位点起作用，通常在配体和载体中间加入一定长度的有机基团，即间隔臂(spacer arm)。,间隔臂的长度和合成方法的选择必须认真考虑，臂太长，自身返折，使有效长度比自身更短；太短又达不到目的，因此，长度要合适，一般为10-20A。另外，具有亲水性，可减弱对蛋白质构象的影响。对于一个理想的间隔臂，它应该长度合适，对分离物不进行非特异的吸附(即不能带太多的电荷和不能有太强的疏水性)，无外加的活性吸附点，有连接配体和载体的双功能反应基团。,七、洗脱过程,当分离物与
44、配体间的结合常数较小时(102104M-1)，在等浓度洗脱下，使用洗脱能力弱的流动相就可能使分离物获得分离。但对于结合常数大的蛋白质，却很难洗脱，为了使之洗脱，必须设法较少分离物与配体间的结合常数，以便使k保持在一个合适的位置和获得一个合适的洗脱峰形。一般有两种方法可以用来洗脱较强结合的物质，即生物选择性(竞争)洗脱和非选择性洗脱。,特异性洗脱方法的选择生物选择性洗脱可使用等浓度、梯度、分段洗脱和脉冲洗脱方式。等浓度的生物选择性洗脱适合于配体与蛋白质间作用较快的动力学过程。梯度洗脱在HPAFC上分离较宽范围的配体与蛋白质具有不同亲合力物质是有用的。脉冲洗脱方式(pulsed elution)应
45、用较为广泛，其洗脱方式为当样品负载于柱上后，再脉冲地注入浓的竞争剂。这种方式比梯度或分段洗脱(step change)更方便。一次脉冲洗脱或许并不能将样品完全洗掉，这就需要第二、第三次地进行重复洗脱。一次不能被完全洗掉的原因与动力学因素有关。低的流速有利于蛋白质的完全洗脱，流速越低，一次洗脱掉样品的量越高。,停流洗脱(stopped-flow elution)停流洗脱认为是脉冲洗脱应用的扩展，该技术通过停止流动相的流动，让脉冲进入柱子的竞争剂在柱中多停留几分钟，以保证样品在一次脉冲洗脱中可以完全洗脱，而且让峰形变的窄一点。在实际过程中，停流洗脱实验过程可以采用以下的方式进行。生物特异性洗脱技术
46、和条件的选择既依赖于分离的目的，同样也依赖于生物特异性作用的热力学和动力学过程。热力学作用(K1和Kc1)可以告诉所需竞争剂的浓度，生物特异性作用在HPAFC分离中相对较慢，溶质从结合点上解吸附的时间对选择洗脱方式时是一个重要的因素。,非选择性洗脱非选择性洗脱使用的流动相可以非特异地破坏配体与溶质间的结合。普通非特异洗脱涉及改变流动相pH、离子强度、加入一些离液序列的试剂(脲、KSCN)等或有机试剂。这些修饰剂(modifiers)或许造成配体或溶质的失活，或简单地破坏配体和蛋白质间的离子、静电或疏水作用。如高浓度盐常常用来减弱库仑作用力、有机溶剂用来调整氢键和疏水作用，使蛋白质与配体间的作用
47、力减弱。非特异性洗脱条件的选择主要基于大量的实践。,优点是溶质解吸的动力学限制可以被克服；当被分离的竞争试剂不易获得时，非特异性洗脱就提供了一个非常有用的洗脱方式。缺点：、它不仅仅可能将结合或不结合的物质分离，一个比较明智的方法是选择作用强度适中不使分离物失活的条件来作为洗脱剂。、剧烈的非特异性洗脱条件常常造成溶质或配体结构不可逆的改变，分离高活性蛋白质时更应进行仔细地考虑。,对于两个生物大分子间的作用，如Ab-Ag，受体-蛋白质，其作用与酶与底物之间的作用非常相似，符合钥匙作用和诱导作用模型，这就要求在合成填料时尽可能保持生物配体的结构不变。,免疫亲和层析：将蛋白质抗体偶联到免疫亲和柱可用于
48、抗原蛋白的纯化；凝集素亲和层析：凝集素是一大类能专一性和糖类和糖复合物结合的蛋白质，固定化凝集素可用于糖蛋白纯化；染料亲和层析：有多种染料可与各种类型的酶结合，又不受酶的作用，可用于多种蛋白的分离。,亲和层析中的三大通用技术,在各种表达载体上都带有各种标签蛋白，如GST-tag、His-tag、V5-tag等，它们不仅可用于鉴定蛋白表达与否，更可用于与之相连的目标蛋白的纯化；通过免疫亲和层析技术，只需一步，即可纯化带有标签的目标蛋白。,亲和层析是基因工程中最常用的纯化技术,凝集素亲合色谱(Lectin affinity chromatography),Lectins are sugar-bin
49、ding proteins with tremendous experimental utility because of their specific interactions with glycoconjugates.Lectin affinity columns are especailly useful for purifying membrane proteins and secretory proteins,which are frequently glycosylated.,八、金属螯合亲合色谱(Immobilized metal-ion-affinity chromatogra
50、phy,IMAC),九、应用,第五节 高效体积排阻色谱High Performance Size Exclusion Chromatography(SEC),Size-exclusion chromatography,Size-exclusion chromatography,Absorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions.You can also perform an enzyme specific assay.,要根据待分离物质的分子量，选择特定的凝胶过滤基质；凝胶过滤层析不仅可用于亲水性分子的分离，也可
