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1、,Protein Biosynthesis(Translation),蛋白质的生物合成(翻译),第十二章,医学检验系 李林梅,蛋白质的生物合成过程就是将mRNA分子中由碱基序列组成的遗传信息，通过遗传密码破译的方式转变成为蛋白质中的氨基酸排列顺序，因而称为翻译（translation)。,（1）氨基酸的活化（2）肽链的生物合成（3）肽链形成后的加工和靶向输送,反应过程,（1）维持多种生命活动（2）适应环境的变化（3）参与组织的更新和修复,生物学意义,第一节蛋白质合成体系Protein Biosynthesis System,20种氨基酸作为原料 酶及蛋白因子，如IF、eIF等 ATP、GTP、
2、无机离子,参与蛋白质生物合成的物质包括：,三种RNA mRNA rRNA tRNA,1961年，Nirenberg 证明了mRNA的模板作用。,一、翻译模板mRNA及遗传密码,细菌矾土颗粒,轻轻研磨,细菌液,离心，去除细胞壁和膜,提取液（DNA、mRNA、tRNA、核糖体、酶、离子）,DNA水解酶，20种氨基酸等,蛋白质,DNase,蛋白质合成量,时间,mRNA是遗传信息的携带者,遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为顺反子（cistron）。原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位，转录生成的mRNA可编码几种功能相关的蛋白质，为多顺反子（polycistron）。真核生物一个mRNA只编码一
3、种蛋白质，为单顺反子（single cistron）。,5“帽子”,PolyA 3,顺反子(cistron),AAAAAAA-OH,原核生物的多顺反子,真核生物的单顺反子,mRNA结构简图,mRNA上存在遗传密码,mRNA分子上从5至3方向，由AUG开始，每3个核苷酸为一组，决定肽链上某一个氨基酸或蛋白质合成的起始、终止信号，称为三联体密码（triplet codon）。,ORF,从mRNA 5端起始密码子AUG到3端终止密码子之间的核苷酸序列，称为开放阅读框架(open reading frame,ORF)。,保温,蛋白质合成停止,poly U，ATP，GTP，氨基酸,多聚苯丙氨酸（UUU是
4、Phe的密码子）,同样方法证明了CCC是Pro的密码子，AAA是Lys的密码子。,提取液（DNA、mRNA、tRNA、核糖体、酶、离子）,遗传密码的破译,起始密码子(initiation codon)：AUG终止密码子(termination codon)：UAA、UAG、UGA,起始密码子和终止密码子：,遗传密码表,1.方向性(directional),遗传密码的特点,连续阅读从mRNA5 3 肽链合成N端 C端,2.连续性（commaless）,编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间隔也无重叠。,重叠密码,非重叠连续的密码,不连续的密码,基因损伤引起mRNA阅读框架内的
5、碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变(frameshift mutation)。,由于对mRNA外显子的加工，造成mRNA与其DNA模板序列之间不匹配，使同一mRNA前体翻译出序列、功能不同的蛋白质。这种基因表达的调节方式称为mRNA编辑（mRNA editing)。,mRNA编辑,3.简并性（degeneracy）,遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有24个或多至6个密码子为之编码。,一个AA有多个密码；密码上第一、二位上碱基不变，第三位碱基可改变。如：UCU UCC UCA UCG 都代表Ser。,遗传密码的简并性,密码子简并性的生物学意义：减少有害突变。遗传密码的
6、特异性主要取决于前两位碱基。GCU ACUGCC ACCGCA ACAGCG ACG,Ala,Thr,4.通用性（universal）,蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。密码的通用性进一步证明各种生物进化来自同一祖先。,已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。,5.摆动性（wobble）,tRNA上反密码子的第1位碱基与mRNA密码子的第3位碱基配对时，可以在一定范围内变动，即并不严格遵循碱基配对规律，这一现象称为摆动性。,密码子、反密码子配对的摆动现象,摆动配对,密码,mRNA,5,3,3,5,反密码,tRNA,G,C,U,C,G,I,C,A,tRNA的反密码子
7、与mRNA分子上的密码子摆动配对,1,2,3,1,2,3,自由度的大小由tRNA反密码子第一位碱基的种类决定,二、核蛋白体是蛋白质合成的场所,核蛋白体又称核糖体，是由rRNA和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒，是蛋白质生物合成的场所。,核蛋白体的组成,原核生物翻译过程中核蛋白体结构模式:,A位：氨基酰位(aminoacyl site),P位：肽酰位(peptidyl site),E位：排出位(exit site),目 录,30S小亚基：有mRNA结合位点50S大亚基：E位：排出位（Exit site）转肽酶活性大小亚基共同组成：A位：氨基酰位(aminoacyl site)P位：肽酰
8、位(peptidyl site),三、tRNA,反密码环,氨基酸臂,tRNA在翻译过程中起接合体（adaptor）作用，又是氨基酸的运载体。,三、tRNA,运载氨基酸：一种氨基酸可有几种对应的tRNA，氨基酸结合在tRNA 3-CCA的位置；充当“适配器”：每种tRNA的反密码子决定了所携带的氨基酸能准确地在mRNA上对号入座。,二级结构,三级结构,反密码环,氨基酸臂,tRNA的构象,四、酶类、蛋白质因子等,（一）重要的酶类,氨基酰-tRNA合成酶转肽酶转位酶,（二）蛋白质因子,起始因子（initiation factor，IF）延长因子（elongation factor，EF）释放因子（r
9、elease factor，RF）,蛋白质生物合成的能源物质为ATP和GTP;参与蛋白质生物合成的无机离子有Mg2+、K+等。,（三）能源物质及离子,第二节氨基酸的活化 Activation of Amino Acids,氨基酸+tRNA,氨基酰-tRNA,ATP,AMPPPi,氨基酰-tRNA合成酶,（一）氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase),氨基酸的活化,第一步反应,氨基酸ATPE 氨基酰-AMP-EAMP PPi,第二步反应,氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰-tRNA AMP E,tRNA与酶结合的模型,tRNA,氨基酰-tRNA合成酶,ATP
10、,氨基酰-tRNA合成酶对氨基酸和tRNA都有高度特异性。氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性(proof-reading activity)。氨基酰-tRNA的表示方法：丙氨酰-tRNA：Ala-tRNAAla 丝氨酰-tRNA：Ser-tRNASer 蛋氨酰-tRNA：Met-tRNAMet,tRNA,氨基酸的活化形式：氨基酰tRNA氨基酸的活化部位：羧基氨基酸与tRNA连接方式：酯键氨基酸活化耗能：2个P,真核生物：Met-tRNAiMet原核生物：fMet-tRNAifMet,（二）起始肽链合成的氨基酰-tRNA,fMet-tRNAifMet的生成：,第三节蛋白质生物合成过程The Pr
11、ocess of Protein Biosynthesis,蛋白质合成中mRNA模板的方向：5 3；蛋白质的合成方向：N端 C端。蛋白质合成过程：起始延长终止,起始(initiation)延长(elongation)终止(termination),一、原核生物的肽链合成过程,（一）肽链合成起始,指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物(translational initiation complex)。参与起始过程的蛋白质因子称起始因子（initiation factor，IF）。,参与起始过程的蛋白质因子称起始因子（initiation factor，IF）。原
12、核生物起始因子有三种：IF-1：占据A位防止结合其他tRNA。IF-2：促进起始tRNA与小亚基结合。IF-3：促进大小亚基分离，提高P位对结合起始tRNA敏感性。,原核生物各种起始因子的生物功能,原核生物翻译起始复合物形成,核蛋白体大小亚基分离；mRNA在小亚基定位结合；起始氨基酰-tRNA的结合；核蛋白体大亚基结合。,IF-3,IF-1,1.核蛋白体大小亚基分离,IF-3,IF-1,2.mRNA在小亚基定位结合,S-D序列：在原核生物mRNA起始密码AUG上游，存在49个富含嘌呤碱的一致性序列，如-AGGAGG-，称为S-D序列。又称为核蛋白体结合位点（ribosomal binding
13、site，RBS),S-D序列,小亚基中的16S-rRNA 3-端有一富含嘧啶碱基的短序列，如-UCCUCC-，通过与S-D序列碱基互补而使mRNA与小亚基结合。,mRNA序列上紧接S-D序列后的小核苷酸序列，可被核蛋白体小亚基蛋白rpS-1识别并结合。,IF-3,IF-1,3.起始氨基酰tRNA与小亚基结合,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,4.核蛋白体大亚基结合,IF-3,IF-1,IF-2,-GTP,GDP,Pi,起始过程消耗1个GTP。,（二）肽链的延长,指按照mRNA密码序列的指导，依次添加氨基酸从N端向C端延伸肽链，直到合成终止的过程。,肽链的延长是在核蛋白体上连
14、续性循环式进行，又称为核蛋白体循环（ribosomal cycle)，每次循环增加一个氨基酸，分为以下三步：进位（entrance）成肽（peptide bond formation）转位（translocation）,肽链合成的延长因子,1、进位,指根据mRNA下一组遗传密码指导，使相应氨基酰-tRNA进入核蛋白体A位。,延长因子EF-T催化进位（原核生物）,Tu,Ts,GTP,GDP,Tu,Ts,GTP,成肽是在转肽酶(peptidase)的催化下，核蛋白体P位上起始氨基酰-tRNA的N-甲酰甲硫氨酰基或肽酰-tRNA的肽酰基转移到A位并与A位上氨基酰-tRNA的-氨基结合形成肽键的过程。
15、,2、成肽,成肽的反应过程,转位是在转位酶的催化下，核蛋白体向mRNA的3-端移动一个密码子的距离，使mRNA序列上的下一个密码子进入核蛋白体的A位、而占据A位的肽酰-tRNA移入P位的过程。,转位需要延长因子EF-G参与。,3、转位,EF-G有转位酶（translocase）活性，可结合并水解1分子GTP，促进核蛋白体向mRNA的3侧移动，使起始二肽酰-tRNA-mRNA相对位移进入核蛋白体P位，而卸载的tRNA则移入E位。,fMet,fMet,成肽转位下一轮进位,肽链合成延长(核蛋白体循环)过程,（三）肽链合成的终止,当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，
16、mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止。,终止相关的蛋白因子称为释放因子(release factor,RF),识别终止密码，如RF-1特异识别UAA、UAG；而RF-2可识别UAA、UGA。诱导转肽酶改变为酯酶活性，使肽链从核蛋白体上释放。,释放因子的功能,原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3,原核肽链合成终止过程,RF,原核生物蛋白质合成的能量计算氨基酸活化：2个PATP起始：1个GTP延长：2个GTP终止：1个GTP结论：每合成一个肽键至少消耗5个P。,二、真核生物的肽链合成过程,（一）起始,核蛋白体大小亚基分离；起始氨基酰-tRNA的结合；mRNA在小亚基定位结合
17、；核蛋白体大亚基结合。,真核生物翻译起始复合物形成过程,真核生物肽链合成的延长过程与原核生物基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。,（二）延长,（三）终止,真核生物翻译终止过程与原核生物相似，但只有1个释放因子eRF，可识别所有终止密码子，完成原核生物各类RF的功能。,原核生物与真核生物肽链合成过程的主要差别,真核生物翻译起始的特点核蛋白体是80S；起始因子种类多；起始tRNA的Met不需甲酰化；mRNA的5帽子和3poly A尾结构与mRNA在核蛋白体就位有关；起始tRNA先与核蛋白体小亚基结合，然后再结合mRNA。,（四
18、）多聚核蛋白体（polysome)一个mRNA分子可同时有多个核蛋白体在进行同一种蛋白质的合成，这种mRNA和多个核蛋白体的聚合物称为多聚核蛋白体。,电镜下的多聚核蛋白体现象,第 四 节蛋白质翻译后修饰和靶向输送,Posttranslational Modification and Targeting Transfer of Protein,从核蛋白体释放出的新生多肽链不具备蛋白质生物活性，必需经过不同的翻译后复杂加工过程才转变为天然构象的功能蛋白。,主要包括,多肽链折叠为天然的三维结构 肽链一级结构的修饰空间结构修饰,一、多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质,新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后进
19、行，新生肽链N端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模体、结构域到形成完整的空间构象。大多数天然蛋白质折叠都需要其他酶和蛋白质的辅助。,几种有促进蛋白折叠功能的大分子,1.分子伴侣(molecular chaperon)2.蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)3.肽-脯氨酰顺反异构酶(peptide prolyl cis-trans isomerase,PPI),（1）热休克蛋白(heat shock protein,HSP)HSP70、HSP40和GreE族（2）伴侣蛋白(chaperon
20、ins)GroEL和GroES家族,1.分子伴侣,分子伴侣是细胞中一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。,热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用：结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠。形成HSP70和多肽片段依次结合、解离的循环。,HSP40结合待折叠多肽片段,HSP70-ATP复合物,HSP40-HSP70-ADP-多肽复合物,ATP水解,GrpE,ATP,ADP,复合物解离，释出多肽链片段进行正确折叠,大肠杆菌中的HSP70 反应循环,伴侣素的主要作用:为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。,当待折叠肽链进入Gro EL的桶状空腔
21、后，Gro ES可作为“盖子”瞬时封闭Gro EL空腔出口。封闭后的桶状空腔提供了能完成该肽链折叠的微环境。,Gro EL-Gro ES复合物,伴侣素系统促进蛋白质折叠过程,2.蛋白二硫键异构酶（PDI）,二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。,3.肽-脯氨酰顺反异构酶,多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象明显差别。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，可使多肽在各脯氨酸弯折处形
22、成准确折叠。,二、蛋白质一级结构修饰主要是肽键水解和化学修饰,（一）肽链末端的修饰（二）个别氨基酸的共价修饰,1糖基化 2羟基化 3甲基化 4磷酸化 5二硫键形成 6亲脂性修饰,鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰,N,C,信号肽,PMOC,KR,KR,（三）多肽链的水解修饰,三、空间结构的修饰,（一）亚基聚合（二）辅基连接,蛋白质合成后需要经过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。,四、蛋白质合成后的靶向输送,蛋白质的靶向输送（protein targeting）,所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要是N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移
23、到细胞的适当靶部位，这类序列称为信号序列(signal sequence)。,（一）靶向输送的蛋白质N-端存在信号序列,N-端含1个或几个带正电荷的碱性氨基酸残基，如赖氨酸、精氨酸；中段为疏水核心区，主要含疏水的中性氨基酸，如亮氨酸、异亮氨酸等；C-端加工区由一些极性相对较大、侧链较短的氨基酸（如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸）组成，紧接着是被信号肽酶(signal peptidase)裂解的位点。,信号肽有以下共性：,信号肽的一级结构,N端侧碱性区,疏水核心区,C端加工区,靶向输送蛋白的信号序列或成分,靶向输送到细胞核的蛋白质其多肽链内含有特异信号序列，称为核定位序列(nuclear localiz
24、ation sequence,NLS)。NLS为含48个氨基酸残基的短序列，富含带正电荷的赖氨酸、精氨酸和脯氨酸，可位于肽链的不同部位，而不只在N末端。,核定位序列,核蛋白体上合成的肽链先由信号肽引导进入内质网腔并被折叠成为具有一定功能构象的蛋白质，在高尔基复合体中被包装进分泌小泡，转移至细胞膜，再分泌到细胞外。,（二）分泌型蛋白质由分泌小泡靶向输送至胞外,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,（三）蛋白质6-磷酸甘露糖基化是靶向输送至溶酶体的信号,内质网蛋白质多肽链的C-端含有滞留信号序列，可与相应受体结合。在高尔基复合体上，内质网蛋白质通过其滞留信号序列与受体结合后，随囊泡输送回内质网。,（四
25、）靶向输送至内质网的蛋白质C-端含有滞留信号序列,（五）质膜蛋白质的靶向输送由囊泡转移到细胞膜,机制与分泌型蛋白质的跨膜机制相似，但质膜蛋白质的肽链并不完全进入内质网腔，而是锚定在内质网膜上。不同类型的跨膜蛋白质以不同的形式锚定于膜上。,（六）线粒体蛋白质以其前体形式在胞液合成后靶向输入线粒体,绝大部分线粒体蛋白质是由核基因组编码、在胞液中的游离核蛋白体上合成后释放、靶向输送到线粒体中的。,线粒体蛋白的靶向输送,（七）细胞核蛋白质在胞液中合成后经核孔靶向输送入核,蛋白质生物合成的干扰和抑制Interference&Inhibition of Protein Biosynthesis,第 四 节
26、,蛋白质生物合成是很多天然抗生素和某些毒素的作用靶点。它们就是通过阻断真核、原核生物蛋白质翻译体系某组分功能，干扰和抑制蛋白质生物合成过程而起作用的。,抗生素(antibiotics)是微生物产生的能够杀灭或抑制细菌的一类药物。,一、抗生素类,影响翻译起始的抗生素影响翻译延长的抗生素,干扰进位的抗生素引起读码错误的抗生素 影响肽键形成的抗生素 影响转位的抗生素,四环素族,抗生素抑制蛋白质生物合成的原理,嘌呤霉素作用示意图,二、其他干扰蛋白质生物合成的物质,毒素(toxin)干扰素(interferon),白喉毒素(diphtheria toxin)的作用机理,一是干扰素在某些病毒双链RNA存在
27、时，能诱导特异的蛋白激酶活化，该活化的蛋白激酶使eIF-2磷酸化而失活，从而抑制病毒蛋白质合成；二是干扰素能与双链RNA共同活化特殊的2-5寡聚腺苷酸（2-5A）合成酶，催化ATP聚合，生成单核苷酸间以2-5磷酸二酯键连接的2-5A，经2-5A活化核酸内切酶RNase L，后者可降解病毒mRNA，从而阻断病毒蛋白质合成。,干扰素的作用机理,复习思考题：1.概念：（1）翻译（2）遗传密码（3）密码的摆动性（4）氨基酸活化（5）SD序列（6）信号肽（7）分泌性蛋白质（8）靶向输送（9）多聚核蛋白体2.简述RNA在蛋白质合成中的作用。3.简述蛋白质生物合成的大体过程。,4.原核生物和真核生物的翻译起始复合物的生成有何异同？5.简单介绍信号肽假说的具体内容。6.按下列DNA单链5TCGTCGACGATGATCTTCGGCTACTCGA3试写出：（1）DNA复制时另一条链的碱基顺序；（2）以此为模板，转录成mRNA的碱基顺序；（3）所合成肽链的氨基酸顺序。,
