第六讲RNA的生物合成与转录后加工课件.ppt

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1、第六讲 RNA的生物合成与转录后加工,执行生命功能、表现生命特征的主要物质是蛋白质分子。DNA贮存着决定生物特征的遗传信息，只有通过蛋白质才能表达出它的生命意义，直接决定蛋白质合成及蛋白质特征的不是RNA而是DNA，因而人们确定DNA是遗传信息贮存者后就推测DNA是通过RNA去决定蛋白质合成的。50年代末RNA聚合酶的发现开始证实了这一推测。,以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription）。转录是生物界RNA合成的主要方式，是遗传信息即DNA向RNA传递过程，也是基因表达的开始（图6-1）。转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP）

2、。转录产生初级转录物为RNA前体，它们必须经过加工过程变为成熟的RNA，才能表现其生物活性。,图 6-1 DNA转录的基本过程,主 要 内 容,RNA合成的酶学基础 RNA合成的基本过程 RNA转录后的加工与修饰,真核和原核细胞内都存在有DDRP，迄今发现的DDRP的有以下特点：以DNA为模板:在DNA的两条多苷酸链中只有其中一条链作为模板，这条链叫做模板链，又叫反义链。DNA双链中另一条不做为模板的链叫做编码链，又叫有意义链，编码链的的序列与转录本RNA的序列相同，只是在编码链上的T在转录本RNA为U，由于RNA的转录合成是以DNA的一条链为模板而进行的，所以这种转录方式又叫做不对称转录。,

3、1、RNA合成的酶学基础,5G C A G T A C A T G T C33 c g t c a t g t a c a g5,5G C A G U A C A U G U C3,N Ala Val His Val C,DNA,转录,mRNA,翻译,肽,DNA模板、转录产物mRNA 和氨基酸序列之间的关系,编码链,模板链,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,都以四种三磷酸核苷酸的底物为原料；都遵循DNA与RNA之间的碱基配对原则，A=U，T=A，C=G，合成与模板DNA序列互补的RNA链；RNA链的延长方向是53的连续合成；需要Mg2+或Mn2+离子；并不需要引物。RNA聚

4、合酶缺乏35外切酶活性，所以没有校正功能。,（1）RNA聚合酶所催化的反应,（2）大肠杆菌RNA聚合酶,表 6-1 大肠杆菌RNA聚合酶,核心酶(core enzyme),全酶(holoenzyme),RNA聚合酶,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,亚基组成：a2bbws=a2bbw+s 全酶 核心酶,RNA聚合酶的组成,a亚基 解开前方的DNA双螺旋、恢复后面的DNA双螺旋b亚基 催化磷酸二酯键的形成b亚基 与DNA的非模板链结合,（3）真核生物RNA聚合酶,表 6-2 真核生物的RNA聚合酶,真核生物RNA聚合酶的共同特征,3种聚合酶都由2个大亚基，12个以上的小亚基组成；在3种聚合酶之

5、间，最大2个亚基，至少5个小亚基的基因编码区具有同源性；4-7种小亚基为各种RNA聚合酶特有；都具有原核RNA 聚合酶核心2同源的亚基；最大亚基与相似，次最大亚基与相似；,RNA 聚合酶的羧基末端结构域（CTD）,RNA 聚合酶II最大亚基的羧基端,存在着一种6个氨基酸的重复序列:Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser,在哺乳类中重复52次，在酵母中重复26次，称为CTD。转录起始时：Ser、Thr的羟基非磷酸化，易与DNA结合；转录延伸时，磷酸化，松弛与DNA的结合。,2、转录的基本过程（图6-2）,（1）RNA合成的识别（2）RNA合成的起始与延伸过程（3）RNA合成的终止

6、阶段,图6-2转录的主要过程,原核生物：Pribnow框和Sextama框（图6-3）真核生物：TATA框和CAAT框（图6-4）,（1）转录的识别 启动子,图6-3原核生物启动子的结构示意图,转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。常把起点前面，即5末端的序列称为上游(upstream)，而把其后面即3末端的序列称为下游(downstream)。在描述碱基的位置时，一般用数字表示，起点为+1，下游方向依次为+2、+3，上游方向依次为-1、-2、-3。,Pribnow 框：,10区，保守序列为 TATAAT。Pribnow 框是RNA聚合酶的牢固结

7、合位点，简称结合位点。,的存在保证原核生物RNA聚合酶只能与启 动子区而不是其它区域形成稳定的二元复合物。,Sextama 框：,35区，保守序列为TTGACA。Sextama 框是RNA聚合酶中 的识别位点，也是RNA聚合酶的初始结合位点。,Pribnow 框与Sextama 框之间的碱基序列 并不重要，但两个序列之间的距离十分重要；天然启动子这段距离多为1520bp，距离的 大小可能是决定启动子强度的因素之一。实验表明：两个序列之间的距离为17bp时，转录效率最高。,图6-4真核生物的启动子序列,（2）转录的起始,转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DN

8、A双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,4.10区DNA双链解开1217bp，形成开放的二 元启动子复合物（模板酶）。,2.RNA聚合酶全酶(2)与模板35序列结合，形成闭合的二元闭合启动子复合物。,转录起始过程,1.因子辨认转录起始点（-35区的TTGACA序列）,3.RNA聚合酶向10区转移，并与之牢固结合。,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH 3,转录起始复合物:,5-pppG-OH+NTP 5-pppGpN-OH 3+ppi,5.在RNA聚合酶亚基催化下形成第一个磷酸二酯键，形成三元复合物（模板酶RNA）。,6.当三元复合物中RNA长69个核苷酸时，因子 从全酶解离下来

9、，进入延长阶段。,RNA聚合酶有两个核苷酸结合位点：一个是起始核苷酸位点；一个是延长核苷酸位点。一般只有嘌呤核苷酸填充了起始位点，才能形成第一个磷酸二酯键。,RNA合成的第一个核苷酸总有GTP或ATP，以GTP常见，此时因子从全酶解离下来，靠核心酶在DNA链上向下游滑动，而脱落的因子与另一个核心酶结合成全酶反复利用。,真核生物转录起始十分复杂，往往需要多种蛋白因子的协助，已经知道，在所有的细胞中有一类叫做转录因子的蛋白质分子，它们与RNA聚合酶形成转录起始复合物，共同参与转录起始的过程。,真核生物基因中，有专门为蛋白质编码的基因，这些基因由RNA聚合酶负责进行转录起始关键性作用。根据这些转录因

10、子的作用特点可大致分为以下二类：,第一类为普遍转录因子：它们与RNA聚合酶共同组成转录起始复合物，转录才能在正确的位置上开始。普遍转录因子是由多种蛋白质分子组成的，其中包括特异结合在TATA盒上的蛋白质，叫做TATA盒结合蛋白，还有形成一组复合物叫做转录因子D。TFD再与RNA聚合酶结合完成转录起始复合物的形成（图6-5）。,图6-5转录起始复合物的模式图,第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子或者叫可诱导性转录因子：这类TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素，生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时才需要的一类转录因子。,RNA链的延长靠核心酶的催化，在起始复合物上第一个GT

11、P的核糖3-OH上与DNA模板能配对的第二个三磷酸核苷酸起反应形成磷酸二酯键。聚合进去的核苷酸又有核糖3-OH游离，这样就可按模板DNA的指引，一个接一个地延长下去。因此RNA链的合成方向也是5-3。由于DNA链与合成的RNA链具有反平行关系，所以RNA聚合酶是沿着DNA链3-5方向移动。,（3）转录的延伸,整个转录过程是由同一个RNA聚合酶来完成的一个连续不断的反应，转录本RNA生成后，暂时与DNA模板链形成DNARNA杂交体，长度约为12个碱基对，形成一个转录泡（图6-6）。转录速度大约是每秒钟30-50个核苷酸，但并不是以恒定速度进行的。,图6-6转录的延伸过程,原核生物RNA转录的延长

12、过程,图 6-7 原核生物转录过程中的羽毛状现象,依赖因子的转录终止非依赖因子的转录终止,（4）转录的终止和新生RNA链的释放,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类,依赖 因子的转录终止（图6-8）,1969年，Roberts发现了能控制转录终止的蛋白质，即因子。它由相同的6个亚基组成六聚体，分子量200kD。,因子具有NTP酶活性和解螺旋酶活性，是促使转录三元复合物解离的根本原因。因子的NTP酶活性依赖于单链RNA的结构。,因子依赖性终止子含有一个反向重复序列，使 RNA末端形成一个发夹结构，导致转录延宕，因子得以发挥作用，终止转录。,

13、图 6-8,非依赖 因子的转录终止（图6-9）,DNA模板接近转录终止的区域内，有较密集 的A-T配对区或G-C配对区，且G-C配对为回 文结构。转录产物RNA的3-末端有若干个连续的U。连续U区的5-端前方碱基形成茎环结构或发 夹结构。这种二级结构是阻止转录继续向下 游推进的关键。,图6-9 不依赖 因子的转录终止,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；密集A-U 配对使转录复合物趋于解离，释放RNA。,转录与复制的相似之处：都是酶促的核苷酸聚合过程；都以DNA为模板；都需依赖DNA的聚合酶；聚合过程都是核苷酸之间生成磷酸二酯键；都从5至3 方向延伸成新链多聚核苷酸；都遵从

14、碱基配对规律 但转录忠实性要低于DNA复制。转录与复制都受到严格的调控,转录与复制的异同点,转录和复制的区别,引物 有 无高度进行性 中途不停止 可一段一段进行,A,-,U,，,T,-,A,，,G,-,C,A,-,T,，,G,-,C,配对,mRNA,，,tRNA,，,rRNA,子代双链,DNA,（,半保留复制）,产物,RNA,聚合酶（,RNA,-,pol,）,DNA,聚合酶,酶,NTP,dNTP,原料,模板链转录（不对称转录）,两股链均复制,模板,转录,复制,A,-,U,，,T,-,A,，,G,-,C,A,-,T,，,G,-,C,配对,mRNA,，,tRNA,，,rRNA,子代双链,DNA,（

15、,半保留复制）,产物,RNA,聚合酶（,RNA,-,pol,）,DNA,聚合酶,酶,NTP,dNTP,原料,模板链转录（不对称转录）,两股链均复制,模板,转录,复制,3、转录后加工过程及其机制,mRNA的前体加工 rRNA的前体加工 tRNA的前体加工 RNA的剪接和RNA催化活性 RNA编辑,真核细胞每种转录产物都是各种RNA的前身，即无活性，亦无功能。真核初级转录产物必须在胞核内经过适当加工，使之变成具有活性的成熟RNA后，由胞核运至胞 质才能执行翻译功能。真核细胞转录作用和翻译作用无论在空间上还 是时间上都是彼此分开进行的。原核细胞mRNA不需加工，tRNA和rRNA加工。,真核细胞与原

16、核细胞转录产物的区别：,3.1 mRNA的前体加工,5端形成 帽子结构(m7GpppNp)3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail)中部剪接除去内含子 链内部核苷酸的甲基化,hnRNA转变成mRNA的加工过程包括：,修饰的化学反应：,5-端的修饰在核内完成，且先于中段剪切。,5帽子分Cap0、Cap1、Cap2。,5-端加上帽子结构(mGpppNp）,帽子 0 结构,图5-9 帽子 p161,mRNA帽子的生理功能：,促进某些RNA的合成。,帽子结构参与翻译起始，帽0结构是核糖体识别 mRNA所必需的；核糖体上有帽结合蛋白。,帽子结构增加mRNA的稳定性，保护mRNA防 止其受5核酸外切

17、酶的降解。,3-端加上多聚腺苷酸尾巴(polyA),polyA的出现不依赖DNA模板。加尾信号：3-末端出现AAUAAA及下游的 GU丰富区。在两序列之间由特异的核酸内 切酶切除多余的核苷酸，然后加上poly A。尾部修饰和转录终止同时进行。3-端修饰也在核内完成，并先于mRNA中段 的剪接。polyA的有无及长短是维持mRNA作为翻译模 板的活性，以及增加mRNA本身稳定性的因素。,mRNA3-端的多聚腺苷酸化可被冬虫夏草素（3-脱氧胸苷）所阻止；即冬虫夏草素是多聚腺苷酸化的特异抑制剂。,3.2 rRNA前体的加工,原核细胞与真核细胞的rRNA前体都需加工：,大肠杆菌共有7个转录单位，每个转

18、录单位 由16S rRNA、23S rRNA、5S rRNA及 一个或几个tRNA基因组成。,图5-10 p163,大肠杆菌 rRNA 前体加工过程,真核细胞 rRNA 基因为串联重复序列：由18S rRNA、28S rRNA、5.8S rRNA基因 组成一个转录单位，彼此被间隔区分开。,每个重复单位之间的间隔DNA序列不转录，称为非转录间隔序列。,真核生物 5S rRNA基因也是成簇排列的，中间隔以不被转录的区域，它由RNApol 转录，加工成熟后构成核糖体大亚基。,不同生物的 rRNA 前体大小不同：哺乳动物为45S；果蝇38S；酵母37S；四膜虫35S,18S,5.8S,28S,18S-

19、rRNA,5.8S和28S-rRNA,内含子,45S转录产物,剪 接,终产物,rDNA,基因间隔,哺乳动物细胞 rRNA 前体加工过程,tRNA前体,3.3 tRNA前体的加工,原核与真核tRNA基因大多成簇存在,tRNA前体的加工包括：剪切内含子 核酸外切酶修剪3末端，逐个切去附加序列；加上CCA-OH的3末端，完成柄部结构。碱基修饰,tRNA的加工酶系包括：tRNA核苷酸转移酶、RNaseP、RNaseD、RNase等。,型：有CCA 序列基因，原核生物绝大部分；型：没有CCA序列基因，为真核生物。,tRNA基因有两种：,原核生物与真核生物都有tRNA核苷酸转移酶，负责给型tRNA加上CC

20、A3-OH末端，或修复发生损伤的型 tRNA 3-OH末端。,RNaseP、RNaseD RNase连接酶,剪切内含子：属于酶促反应，需要酶及ATP,tRNA核苷酸转移酶,加上CCA-OH的3末端，完成柄部结构。,碱基修饰,3.4 RNA的剪接,真核不连续基因的初级转录产物中，外显子 与内含子交替出现；转录后把内含子切除而把外显子连接起来产 生成熟RNA分子的过程，叫RNA剪接（RNA splicing）。,内含子5端与3端都存在保守序列，分别 称为5剪接点（GU）和3剪接点（AG）。,rRNA的自我剪接,四膜虫rRNA剪接由鸟苷酸发动第一次亲核 攻击，经过两次连续的转酯反应，将两个 外显子连

21、接起来，释放出线形内含子序列。,释放出的线形内含子序列再经过两次连续的 转酯反应，释放出15 核苷酸和 4 核苷酸的 两个小片段，最终形成稳定的线形产物L-19。（linear minus 19 intervening sequence）,L-19是四膜虫35S rRNA剪接的最终产物，仍具有酶的活性和特征。,RNA的催化功能,L-19具有酶的主要特征：专一性强，加快反 应速度，反应前后酶分子保持不变，这种由 RNA构成的酶称之为核酶。,核酶首先是美国 Colorado 大学Cech在研究 四膜虫rRNA剪接机制时发现的。他一方面证明了四膜虫rRNA的剪接机制；另一方面证明了L-19 分子的催

22、化活性。,继而在1983年，耶鲁大学Sidney Altamn 发现了第二个核酶，参与 tRNA 前体加工的 RNaseP。1992年，加州大学的Harry Noller 又证明了核糖体大亚基rRNA的催化活性。,四膜虫rRNA内含子的二级结构,四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式,5-端核苷酸序列,核酶研究的意义,核酶的发现，对中心法则作了重要补充；核酶的发现是对传统酶学的挑战；利用核酶的结构设计合成人工核酶。,人工设计的核酶,粗线表示合成的核酸分子细线表示天然的核酸分子X 表示一致性序列箭头表示切断点,tRNA的剪接,tRNA分子的内含子首先由核酸内切酶（RNase）剪去。最后由RNA连接

23、酶完成连接。,mRNA的自我剪接,除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,snRNP与hnRNA结合成为剪接体，进行剪接；参与mRNA剪切的snRNP包括U1、U2、U4、U5、U6,内含子上有3个保守性序列剪接位点：5端起始序列GU；3端AG;距3端1840个核苷酸处有一个“分支点”，一定含A，由A发动第一次转酯反应。剪接过程是两次转脂反应。与类内含子相似。,顺式和反式剪接,内含子剪接一般都是发生在同一基因内，切 除内含子，相邻的外显子彼此连接，这种剪 接称为顺式剪接（cis-splicing）。,反式剪接（trans-splicing）则是指发生在不 同基因之间的外显子的剪接。,反式剪接

24、发现于几种锥虫和线虫中。都是在 mRNA 5端存在前导序列，称剪接前导RNA（splicing leader RNA，sl RNA）。sl RNA的反式剪接表现了核内剪接系统的进化。,概念：RNA编辑是指在转录产物RNA前 体的编码区内发生核苷酸插入、丢失或转 换等现象。,3.5 RNA编辑（mRNA editing）,近年发现某些mRNA前体的核苷酸序列需加 以改编，才能变成正确的有翻译活性的模板。mRNA的这种编辑作用广泛存在于原生动物及 植物细胞的线粒体。,6666位,哺乳动物载脂蛋白-B基因的转录产物即存 在mRNA编辑作用。,RNA编辑的生物学意义：,校正作用；调控翻译；如Apo-B

25、基因在肠道的表达。扩充遗传信息：按照基因信息传递的理论，这种mRNA的编辑作用无疑是对传统分子 生物学原理的挑战。,转录是以DNA为模板合成RNA的过程,经过转录DNA分子中的贮存信息传递到RNA分子中,再由mRNA做为模板合成蛋白质分子,转录也是从DNA的一个特定位置开始的,以DNA分子中的一条链为模板,在RNA聚合酶作用下,以四种单核苷酸为原料,合成方向仍是53,完成RNA的合成。,小 结,大肠杆菌的RNA聚合酶由五个亚基构成,2构成核心酶，再加上因子是全酶。RNA聚合酶识别并特异结合的DNA一段区域叫做启动子，启动子的序列中-10区和-35区很保守，决定了启动子的强度是转录正确起点的关键

26、，真核生物中位于-25的TATA盒和-75区域的元件是控制真核生物RNA的转录的关键。,真核生物的RNA聚合酶有、和Mt几种，它们分别催化rRNA、mRNA、tRNA以及线粒体RNA的合成。转录作用停止于DNA模板的终止信号，蛋白质因子可识别此信号，终止区常常转录出一段反向重复序列。,转录生成的RNA分子为前体RNA，必须经过必要的加工修饰，才能成为有功能的RNA分子，但真核生物的RNA转录后加工修饰比原核生物复杂的多。原核生物转录生成的mRNA属于多顺反子形式，由于原核生物没有核膜，转录与翻译的过程没有明显的屏障。,而真核生物转录生成的mRNA为单顺反子，而且具有复杂的转录加工修饰，包括5端

27、加帽，3端加尾，剪切内含子，连接外显子等。人们在研究rRNA前体的加工过程中发现了具有催化作用的RNA分子，称为酶RNA，从而打破了酶的本质是蛋白质的传统观念。,复 习 题,1、解释概念：启动子、Pribnow框、Sextama框、TATA框、增强子、RNA剪接、顺式剪接、反式剪接、核酶、RNA编辑。,2、简述转录与复制的异同点。3、试述原核生物RNA聚合酶的组成及作用。4、简述真核生物RNA聚合酶的种类、特点、及其转录产物。5、何谓终止子？比较原核生物两类终止子的异同。,6、试比较原核生物与真核生物转录的区别。7、mRNA前体与tRNA前体的加工包括哪些内容？8、试述mRNA的自我剪接机制及参与的因素。9、何谓核酶？核酶研究的意义如何？目前发现的重要核酶有哪些？,1、请简要阐述RNA生物合成的基本过程,并比较原核生物与真核生物之间的主要区别。2、请简要阐述不同类型RNA转录后的加工过程。,作 业,