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1、蜡样芽胞杆菌检测,Examination of,Bacillus cereus,蜡样芽胞杆菌,(,Bacillus cereus,),?,是芽胞杆菌属（,Bacillus,）的一种，属于土壤细菌,。,?,在自然界广泛分布于尘土、污水、河流和食品中，在蔬菜、,谷类等农作物和食品原料中主要以芽胞状态存在。,?,已从多种食品中分离出该菌。涉及的食品有米、肉、乳制品、,蔬菜、鱼、糊、调味汁、布丁、汤、糕点、沙拉等。在食品,混合物如酱油、布丁、汤、红烧蔬菜炖肉中也发现该菌。,?,1950,年首次在挪威明确报告其致病作用。,蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒,?,蜡样芽胞杆菌食物中毒以夏季（,6,10,月）最高。
2、,?,引起中毒的食品往往由于食前保存温度不当，放置时间较,长或食品加热不彻底而导致中毒。,蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒,?,该菌引起的食物中毒发病率较高,?,有可能在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌,?,一般认为该菌为条件致病菌，中毒是产生肠毒素所致,?,进食其中污染菌量,10,5,g,的食物时，就可能发生食物中,毒。,引起食物中毒的原因肠毒素,?,呕吐毒素：,一种环形，小分子量、热稳定多肽，,100,30min,不能被破坏，为引起呕吐型中毒的致病因素，,常在米饭中形成。,?,腹泻毒素：,一种大分子量蛋白，水样腹泻、腹部痉挛和疼,痛，呕吐很少见。能在各种食物中形成,;,引起食物中毒的主要食物种类,?
3、,美国,炒米饭,?,欧洲,甜点、肉饼、色拉、奶和肉制品,?,中国,米饭、淀粉类制品,?,在国内，于,1973,年首次报告了南京某托儿所儿童因进,食泡饭引起呕吐型蜡样芽胞杆菌食物中毒后，至今除西藏,外，每个省、自治区、直辖市已经都有报，有些地区甚至,占细菌性食物中毒的首位。,临床表现,?,“呕吐型”：潜伏期为,0.5h,5h,，是由于人摄入,本菌在食品中产生的毒素引起的，原因食品主要为,米饭类、面类（挂面、荞麦面饼）等。症状以恶心、,呕吐为主，病程不超过,24h,。,?,“腹泻型”：潜伏期为,8h,16h,，是由于本菌在肠,道内增殖过程中产生肠毒素引起的，原因食品主要,为肉类、肉汤和其它食物。症
4、状为水泻、腹痛、腹,痉挛为主，病程约,24h,。,芽胞杆菌属,?,70,个种，临床上可以分离到的有一下种类：,蜡样芽胞杆菌分类为芽胞杆菌属的第,I,群。,蜡样芽胞杆菌生物学特性,革兰氏阳性大杆菌，,需氧或兼性需氧,芽胞位于菌体的中心或次末端，不突出菌体,菌体两端较平整，多呈链状排列,生长温度,25,37,，最佳,30,35,?,在营养肉汤中,32,培养,3d,后，芽胞形成率在,90,以,上，,80,-85,水浴,5min-10min,可刺激芽胞萌发。,新国标编制说明,背景,现行标准不足处,重新修订的意义,新国标编制说明,?,为了在食品中有效开展蜡样芽胞杆菌检测，以保障食品安,全，降低蜡样芽胞杆
5、菌感染的风险，,防止食源性蜡样芽胞,杆菌疾病的发生，我国在,1984,年制定了食品卫生微生物,学检验,蜡样芽胞杆菌检验（,GB/T 4789.14-1988,）标,准，该标准的颁布为蜡样芽胞杆菌的规范检测，为蜡样芽,胞杆菌病的监测、预防、控制起到了重要的作用。,背景,?,在以后的二十年时间里，食品中蜡样芽胞杆菌检测标准,经过,1994,年、,2003,年二次修订，但内容可以说完全与,1984,年版相同。,现行,GB/T 4789.14-2003,标准不足处,?,1.,对蜡样芽胞杆菌含量少于,1000cfu/g,的样品计数效果差。,?,2.,采用的361培养温度并非是蜡样芽胞杆菌最适生长,条件。
6、,?,3.,检验结果与现行的其它国家的标准存在一定差异。,重新修,订的意,义,提高检,出率,扩大检,测范围,与国际,接轨,适用性,和可操,作性,提高检出率,?,蜡样芽胞杆菌的最佳生长温度为,30,32。,?,经标准修订协作组验证：,?,30 1 培养,48h,，平均生长率,93.69%,。,?,30 1 培养,24 h,，平均生长率,92.28%,。,?,36 1 培养,24 h,。平均生长率,82.32%,。,提高检出率,?,经统计学分析，30 1 培养温度的生长率显著,高于36 1(P0.05），但在培养温度相同,的情况下，培育时间,24h,和,48h,蜡样芽胞杆菌生长,率无显著差异（P0
7、.05）。,表,1 MYP,培养条件选择结果,比对单位,菌量,（,cfu/,皿）,MYP,平板计数结果,30 1 24h,30 1 48h,36 1 24h,36 1 48h,计数结果,c,fu/,皿,生长率,（,%,）,计数结果,c,fu/,皿,生长率,（,%,）,计数结果,cfu/,皿,生长率,（,%,）,计数结果,cfu/,皿,生长率,（,%,）,吉林省,CDC,86,88,102.33,88,102.33,64,74.42,64,74.42,湖北省,CDC,40,48,120.00,48,120.00,45,112.50,45,112.50,江苏省,CDC,67,25,37.31,26
8、,38.81,50,74.63,50,74.63,浙江省,CDC1,70,73,104.28,73,104.28,64,91.43,64,91.43,广东微生物研,究所,59,81,137.29,88,149.15,61,103.38,71,120.34,浙江省,CDC2,91,65,71.42,59,64.84,59,64.84,50,54.95,浙江省,CDC3,34,37,108.82,37,108.82,25,73.53,25,73.53,平均值,63.86,59.57,92.28,59.86,93.69,52.57,82.32,52.71,82.54,扩大检测范围,?,在定量检测方面
9、，美国,FDA,、,ISO,、以及,SN 0176-92,标准,除采用平板计数外，还采用了,MPN,法。,?,新标准增加,MPN,法，以弥补样品中蜡样芽胞杆菌带菌量少,于,10,3,cfu/mL,时用平板计数法计数不准的问题；,?,该方法操作与现行大肠菌群的操作类似，容易推广使用。,便于与国际接轨,?,随着经济全球化的发展，食品贸易不断扩大，食,品安全问题越来越到受各国政府的重视，为了保护,我国消费者健康，避免贸易摩擦，急需对原标准进,行修订，使其与国际接轨。,提高方法的适用性和可操作性,?,新标准将考虑我国的实际情况，使蜡样芽,胞杆菌检测方法具有更好的适用性和可操作,性。并保持与原标准的连续
10、性。,新标准与,GB/T 4789.14-2003,相比主要,修改如下,:,?,-,修改了标准的中英文名称；,?,-,增加了第二法,蜡样芽胞杆菌,MPN,计数法；,?,-,将选择性分离培养基（,MYP,）培养条件由,37,培,12 h-,20 h,改为,30,1,培养,24 h-48 h,；,?,-,增加了根状生长试验和溶菌酶试验。,?,-,增加了附录,A,、附录,B,。,食品安全国家标准,食品微生物学检验,蜡样芽胞杆菌检验,（修订版）,1,范围,?,本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌的检验方法。,?,本标准第一法适用于蜡样芽胞杆菌含量较高的食品,中蜡样芽胞杆菌的计数；第二法适用于蜡样芽胞杆,菌含
11、量较低的食品样品中蜡样芽胞杆菌的计数。,2,设备和材料,?,除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如,下：,?,冰箱：,2,-5,;,?,恒温培养箱：,30,1,、,36,1,;,?,均质器,;,?,电子天平：感量,0.1 g;,?,无菌锥形瓶：,100 mL,、,500 mL;,?,无菌吸管：,1 mL,（具,0.01 mL,刻度）、,10 mL,（具,0.1 mL,刻,度）或微量移液器及吸头,;,?,无菌平皿：直径,90 mm;,?,无菌试管：,18 mm,180 mm;,?,显微镜：,10,倍,-100,倍（油镜）,;,?,L,涂布棒。,3,培养基和试剂,?,3.1,磷酸盐缓
12、冲液（,PBS,）,?,3.2,甘露醇卵黄多黏菌素（,MYP,）琼脂,?,3.3,胰酪胨大豆多黏菌素肉汤,?,3.4,营养琼脂,?,3.5,过氧化氢溶液,?,3.6,动力培养基,?,3.7,硝酸盐肉汤,?,3.8,酪蛋白琼脂,3,培养基和试剂,?,3.9,硫酸锰营养琼脂培养基,?,3.10,糖发酵管,?,3.11 V-P,培养基,?,3.12,胰酪胨大豆羊血（,TSSB,）琼脂,?,3.13,溶菌酶营养肉汤,?,3.14,西蒙氏柠檬酸盐培养基,?,3.15,明胶培养基,蜡样芽胞杆菌平板计数法（第一法）,4,检验程序,5,操作步骤,5.1,样品处理,?,冷冻样品应在45以下不超过,15 min,
13、或在2,8不超过,18 h,解冻。若不能及时检验，应放于,-,15左右保存；,?,非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验。若不能及,时检验，应置于28冰箱保存，在,24 h,内检验。,5.2,样品制备,?,以无菌操作取样品,25 g,（,mL,），加入,PBS 225,mL,，用旋转刀片式均质器以,8000 r/min,10000,r/min,均质,1 min,2 min,，或拍击式均质器拍击,2,min,。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，,然后称取,25 g,（,mL,）置合适的容器中，加,225,mL PBS,，充分振荡混匀。制成,1:10,的样品匀液。,5.3,样品的稀释,?,吸取上
14、述,1:10,的样品匀液,1 mL,加到装有,9 mL PBS,或生理,盐水的稀释管中，充分混匀制成,1:100,的样品匀液。,?,据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递,增系列稀释样品匀液。每递增稀释,1,次，换用,1,支,1mL,无菌,吸管或吸头。,5.4,样品接种,?,根据对样品污染状况的估计，选择,2,个,3,个适宜稀释度的,样品匀液（液体样品可包括原液），以,0.3 mL,、,0.3 mL,、,0.4 mL,接种量分别入三块,MYP,琼脂平板，然后用无菌,L,棒,涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。,?,使用前，如,MYP,琼脂平板表面有水珠，可放在25,50,的培养箱里
15、干燥，直到平板表面的水珠消失。,5.5,分离、培养,?,5.5.1,分离,?,在通常情况下，涂布后，将平板静置,10 min,。如样液不易,吸收，可将平板放在培养箱30 1 培养,1 h,，等样品匀,液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，30 1 培养,24,h,2 h,。,?,如果菌落不典型，可继续培养,24 h,2 h,再观察。,分离,在,MYP,琼脂平板上，,典型菌落为微粉红色,(,表示不发酵甘露醇,),，,周围有白色至淡粉红,色沉淀环（表示产卵,磷脂酶）,。,5.5.2,纯培养,?,从每个平板中至少挑取,3,个典型菌落（小于,3,个全选），分,别划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30 1 培养
16、,24,h,2 h,，进行确证实验。,?,在营养琼脂平板上，典型菌落为灰白色，偶有黄绿色，不,透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，,直径为,4 mm,10 mm,。,营养琼脂平板纯化培养,6,确证实验,?,6.1,形态,?,挑取纯培养的单个菌落，作革兰氏染色镜检。蜡样,芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞大杆菌，大小为（,1,1.3,）,m,（,3,5,）,m,，芽胞呈椭圆形位于菌体,中央或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多,呈短链或长链状排列。,蜡样芽胞杆菌革兰氏染色,蕈状芽胞杆菌革兰氏染色,菌体，游离芽胞,巨大芽胞杆菌,6.2,生化鉴定,?,挑取纯培养的单个菌落，进行过氧化氢酶试验、
17、动,力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶,耐性试验、,V-P,试验、葡萄糖利用,(,厌氧,),试验、根状,生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验。,?,蜡样芽胞杆菌的主要生化特征见表,1,。,表,1,蜡样芽胞杆菌的主要生化特征,项目,蜡样芽胞杆菌,Bacillus cereus,苏云金芽胞杆菌,Bacillus,thuringiensis,蕈状芽胞杆菌,Bacillus,mycoides,炭疽芽胞杆菌,Bacillus,anthracis,巨大芽胞杆菌,Bacillus,megaterium,革兰氏染色,+,a,+,+,+,+,过氧化氢酶,+,+,+,+,+,动力,+/-,b,+/-
18、,-,c,-,+/-,硝酸盐还原,+,+/-,+,+,-/+,d,酪蛋白分解,+,+,+/-,-/+,+/-,溶菌酶耐性,+,+,+,+,-,卵黄反应,+,+,+,+,-,葡萄糖利用（厌氧）,+,+,+,+,-,V-P,试验,+,+,+,+,-,甘露醇产酸,-,-,-,-,+,溶血（羊红细胞）,+,+,+,-/+,-,根状生长,-,-,+,-,-,蛋白质毒素晶体,-,+,-,-,-,a,：,+,表示,90%,100%,的菌株阳性；,b,：,+/-,表示大多数的菌株阳性；,c,：,-,表示,90%,100%,的菌株阴性；,d,：,-/+,表示大多数的菌株阴性。,蜡样芽胞杆菌生化特征,过氧化氢酶；
19、葡萄糖利用（厌氧）；硝酸盐还原；,V-P,试验；,甘露醇产酸；酪蛋白分解；,6.2.1,溶血试验,?,挑取纯培养的单个可疑菌落接种于,TSSB,琼脂平板上，,30 1 培养,24 h,2 h,。,?,蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，,有草绿色溶血环或完全溶血环。苏云金芽胞杆菌和蕈状芽,胞杆菌呈现弱的溶血现象，而多数炭疽芽胞杆菌为不溶血，,巨大芽胞杆菌为不溶血。,蜡样芽胞杆菌完全溶血环（,24h,）,苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈弱溶血现象，巨大,芽胞杆菌不溶血。,6.2.2,根状生长试验,?,挑取单个可疑菌落划线接种于营养琼脂平板上，30,1,培养,24 h,2 h,。,?,
20、蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征。,?,多数蜡样芽胞杆菌菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡状的,菌落。,根状生长,根状生长,30，,24h,培养，,室温放置,3,天后根状,生长观察。,6.2.3,蛋白质毒素结晶试验,?,取经30 1 培养,24 h,2 h,并于室温放置,3 d,4 d,的营养琼脂培养物少许于载玻片上，滴加,蒸馏水混匀并涂成薄膜。经自然干燥，微火固定后，,加甲醇作用,30 s,后倾去，再通过火焰干燥，于载玻,片上滴满,0.5,碱性复红，放火焰上加热（微见蒸,气，勿使染液沸腾,),持续,1 min,2 min,，移去火焰，,再更换染色液再次加温染色,30 s,，倾去染液用洁净,自来水彻
21、底清洗、晾干后镜检。,?,观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、,正方形或其它形状的蛋白结晶体。如发现游离芽胞,形成的不丰富，应将培养物置室温,2 d,3 d,再行检,查。放置,3d,4d,以上的苏云金芽胞杆菌培养物有,大量的结晶体，但是只有在芽胞裂解通过上述染色,方法才能见到。然而，除非见到芽胞，否则培养物,应在室温继续放置几天以重新检查毒素晶体。其它,芽胞杆菌不产生蛋白质毒素晶体。,苏云金芽胞杆菌蛋白质毒素结晶,游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白,结晶体。,苏云金芽胞杆菌蛋白质毒素结晶,蛋白质毒素结晶形态观察,芽孢形成期的菱形晶体蛋白,扫描电镜观察（,20
22、kv,，,9.5mm,15.0k,）,光学显微镜观察,100,倍油镜,6.2.4,溶菌酶耐性试验,?,用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，,36,（,or30,）,1,培养,24h,。蜡样芽胞杆菌在本培养基（含,0.01,溶菌酶）中能生长。如出现阴性反应，应继续培养,24h,。巨大芽胞杆菌不生长。,6.6,生化分型,?,可根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、,V-P,试验,反应、明胶液化试验，将蜡样芽胞杆菌分成不同生化型别。,7,结果计算,?,7.1,典型菌落计数和确认,?,7.1.1,选择有典型蜡样芽胞杆菌菌落的平板，且同一稀释度,3,个平板所有菌落数合计在,20 CFU,20
23、0 CFU,之间的平板，,计数典型菌落数。,?,如果：,?,a,）只有一个稀释度的平板菌落数在,20 CFU,200,CFU,之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典,型菌落；,?,b,）所有稀释度的平板菌落数均小于,20 CFU,且有典,型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；,?,c,）某一稀释度的平板菌落数大于,200 CFU,且有典型,菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数,该稀释度平板上的典型菌落；,?,d,）若所有稀释度的平板菌落数大于,200,CFU,且有典型菌落，应计数最高稀释度平板,上的典型菌落；,?,e,）若所有稀释度的平板菌落数均不在,20,CFU-200 CFU
24、,之间且有典型菌落，其中一部,分小于,20 CFU,或大于,200 CFU,时，应计数最,接近,20 CFU,或,200 CFU,的稀释度平板上的典,型菌落。,?,以上按公式（,1,）计算。,?,f,）若,2,个连续稀释度的平板菌落数均在,20 CFU-200 CFU,之间，按公式,（,2,）计算。,?,4.4.1.2,从典型菌落中至少挑取,5,个典型菌落（小于,5,个全选），划线接种,于营养琼脂平板做纯培养，,30,1,培养,24 h,2 h,。,?,4.4.2,计算公式,?,4.4.2.1,公式（,1,）,?,T=AB/Cd,?,(1),式中：,?,T,样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；,?,A,
25、某一稀释度蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；,?,B,鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；,?,C,用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；,?,d,稀释因子。,公式（,2,）,?,),式中：,?,T,样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；,?,A1,第一稀释度（低稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；,?,A2,第二稀释度（高稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；,?,B1,第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；,?,B2,第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；,?,C1,第一稀释度（低稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；,?,C2,第二稀释度（高稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落
26、数；,?,1.1,计算系数（如果第二稀释度蜡样芽胞杆菌鉴定结果为,0,，计算系数采用,1,）；,?,d,稀释因子（第一稀释度）。,.1d,1,2,2,2,1,1,1,C,B,A,C,B,A,T,?,?,8,结果报告,?,根据,MYP,平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数，按公式计,算，报告每,g,（,mL,）样品中蜡样芽胞杆菌菌数，以,CFU/g(mL),表示；如,T,值为,0,，则以小于,1,乘以最低稀释倍,数报告,。,蜡样芽胞杆菌,MPN,计数法（第二法）,10.1-10.3,样品处理、样品制备和,样品稀释同平板计数法,10.4,样品接种,?,取三个适宜连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原,液
27、），接种于,10 mL,胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中，每一稀,释度接种,3,管，每管接种,1 mL,（如果接种量需要超过,1 mL,，,则用双料胰酪胨大豆多粘菌素肉汤）。,?,于,30,1 培养,48 h,2 h,。,10.5,培养,?,用接种环从各管中分别移取,1,环，划线接种到,MYP,琼脂平,板上，,30,1 培养,24 h,2 h,。如果菌落不典型,可继,续培养,24 h,2 h,再观察。,10.6,确证实验,?,从每个平板选取至少,5,个典型或可疑菌落，划线接种于营,养琼脂平板做纯培养，,30,1 培养,24 h,2 h,，进行确,证实验。,11,结果报告,?,MPN,计数结果报告方式：根据证实为蜡样芽胞杆菌阳性,的试管管数，查,MPN,检索表，报告每,g,（,mL,）样品中蜡样,芽胞杆菌的,MPN,值。,注意事项,?,MPN,法法可以弥补样品中蜡样芽胞杆菌带菌量少于,10,3,cfu/mL,时用平板计数法计数不准的问题，同时该方法操作,与现行大肠菌群的操作类似，容易推广使用。,?,某些不适合用平板计数法的脱水淀粉类食品也可用此法检,验。,谢,谢！,放映结束,感谢各位的批评指导！,让我们共同进步,
