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1、主要内容,乙型肝炎病毒 荧光定量PCR技术 HBV-DNA与临床,什么是乙肝？,乙肝：是指由乙型肝炎病毒引起的，以肝脏损害为主的一组全身性传染病。临床表现：以疲乏、食欲减退、厌油、肝功能异常为主，部分病例呈现黄疸。,一、形态和生物学特性：HBV 感染者血清中存在三种形式的病毒颗粒：大球形颗粒（Dane）：完整的病毒颗粒，含量最少 包膜：HBsAg，糖蛋白，脂质 核心：DNA，DNA聚合酶，HBcAg 是病毒复制的主体。小球形颗粒：仅HBsAg，无核酸，无感染性，含量最多管形颗粒：仅HBsAg，无核酸，无感染性HBV抵抗力很强，在血清中30-32可保存6个月，-20可保存15年。,电镜下HBV颗
2、粒,HBV病毒结构示意图,HBV基因组结构，1979年,二、基因组结构和编码蛋白,根据HBV全基因序列差异8%或S区基因序列差异4%，目前HBV分为A-H八个基因型。各基因型又可分为不同亚型。我国主要是B和C。IFN治疗HBV应答率：AD，BC，A、DB、C基因型是否影响核苷类似物的疗效尚未确定。6510h、煮沸10min或高压蒸气均可灭活HBV。,三、抗原抗体系统,四、分子生物学标记1.HBV-DNA:主要存在于Dane颗粒中，是病毒复制和传染性的直接标志。2.HBV-DNA多聚酶：位于核心部位，血清中HBV-DNA多聚酶活力是判断病毒复制、传染性高低的指标之一。,流行病学,1.传染源：急、
3、慢性乙型肝炎患者，病毒携带者；2.传播途径：母婴传播、血液及血制品传播、破损的皮肤和黏膜及性接触传播，日常工作或生活接触一般不会传染 HBV；经吸血昆虫传播未证实；3.易感人群：抗HBs阴性者。婴幼儿是获得HBV感染的最危险时期。,全球20亿曾感染HBV，慢性HBV感染者3.5亿我国属 HBV 感染高流行区，一般人群 HBsAg阳性率为9.09%，总感染率为57.6%（包括既往感染和现症感染）。接种与未接种乙型肝炎疫苗人群的HBsAg阳性率分别为4.51%和9.51%。男性高于女性，有家庭聚集现象，婴幼儿感染多见。,自然史,4/30/2023,14,急性HBV感染,慢性乙肝,肝硬化,肝癌,失代
4、偿期肝硬化5年病死率70-86%,代偿期肝硬化5年病死率14-20%,青少年和成人期5-10%,12-25%,5年,6-15%,5年,25-30%婴幼儿期,发生肝硬化的高危因素包括：病毒载量高、HBeAg持续阳性、ALT水平高或反复地波动、嗜酒、合并HCV、HDV或HIV感染等。HBeAg阳性患者的肝硬化发生率要高于 HBeAg 阴性者HBV感染是HCC的重要相关因素。肝硬化患者发生HCC高危因素包括：男性、年龄、嗜酒、黄曲霉素、合并HCV或HDV感染、持续肝脏炎症、持续HBeAg阳性及HBV DNA持续高水平等,发病机制,免疫清除期,非活动或低复制期,再活动期,不治疗但应检测,免疫耐受,需治
5、疗,不治疗但应检测,需治疗,HBV携带者HBsAg(+)HBeAg(+)/抗-HBe(-)HBV DNA+ALT 肝活检-,慢乙肝HBsAg(+)HBeAg(+)/抗-HBe(-)HBV DNA+ALT/AST+肝活检+,HBeAg(-)慢乙肝HBeAg(-)/抗-HBe(+)HBV DNA+ALT+肝活检+,非活动状态HBsAg携带者HBeAg(-)/抗-HBe(+)HBV DNA-ALT/AST-肝活检-,（一）携带者 大三阳或小三阳，HBV DNA为阳性或阴性，但 1 年内连续随访 3 次以上 ALT和AST均在正常范围，肝组织学检查无异常（二）慢性乙型肝炎 大三阳或小三阳，HBV DN
6、A阳性，血清ALT持续或反复升高，或肝组织学检查有肝炎病变,(三)隐匿性慢性乙型肝炎-血清HBsAg阴性，但血清和(或)肝组织中HBV DNA 阳性，并有慢性乙型肝炎的临床表现。患者可伴 有血清抗-HBs、抗-HBe和(或)抗-HBc阳性-另约20%隐匿性慢性乙型肝炎患者除HBV DNA阳性 外，其余HBV血清学标志均为阴性-诊断需排除其他病毒及非病毒因素引起的肝损伤,HBsAg和HBeAg均阳性而HBV DNA阴性？干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏
7、。,为什么要检测HBV-DNA？,“大三阳”、“小三阳”、“携带者”等免疫学指标反应的是机体的免疫反应状态，不能反应体内病毒复制水平与感染程度。血清学指标()不能排除HBV感染。因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定。HBV DNA是HBV本身的遗传物质，是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标，也是患者具有传染性的标志。,怎样检测HBV-DNA？,荧光定量PCR技术,荧光定量PCR技术,Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶（
8、TaqDNA聚合酶）的作用，经过高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤在3个小时内反复循环30-40次，把特定的DNA片段扩增1000万倍。每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板引物TaqDNA聚合酶脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）,实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。,PCR反应过程,d.NTPs,Taq 酶,Primers,反应组分,变 性,延 伸,重 复,退 火,循环24个拷贝,循环38个拷
9、贝,TaqMan探针,d.NTPs,Taq酶,Primers,反应体系,变 性,l,退 火,1.链取代,2.水 解,3.聚 合,4.检测荧光,l,每产生一条DNA链，就切断一条探针每切断一条探针，就产生一个荧光信号信号强度与结合探针的DNA分子数成正比,原理图,血清标本采集,一次性无菌注射器抽取受检者静脉血3-5毫升，注入红帽无菌管中室温（2225C）放置3060 分钟血标本使用水平离心机，4000转/分，离心5分钟吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管 严禁使用肝素抗凝血标本，抑制PCR反应,结果分析,实验室检查常用指标？,常用指标,免疫学检查 病毒学检查 肝功能检查,免疫学检查-乙肝五项
10、分析,乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA103copy/ml)乙肝病毒基因型检测 乙肝病毒基因型变异检测,病毒学检查,肝功能检查-ALT、AST：一般可反映肝细胞损伤程度，最常用-血清胆红素(BIL)：通常与肝细胞坏死程度有关-凝血酶原时间(PT)：反映肝脏凝血因子合成功能-胆碱酯酶(ChE)：反映肝脏合成功能，可作参考-白蛋白(ALB)：反映肝脏合成功能，A/G可作参考-甲胎蛋白(AFP)：出现明显升高往往提示发生HCC,如何治疗？,目前极少能治愈！是可以治疗的！病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体,能治愈吗？,谁需要治疗？不论是大三阳还是小三阳，有以下情况者均需治疗：肝功能异常。有明显的肝炎症
11、状：乏力、厌食、黄疸、肝区隐痛不适等。HBV DNA103copy/ml),抗病毒：目前尚无一种能迅速、直接杀死清除乙肝病毒的药物，最好的抗病毒药物疗效也仅能达到50左右。目前国际医学界公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类：干扰素：重组人-1b干扰素、-2a、-2b干扰素等。核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦。调节免疫保肝降酶,乙型肝炎治疗原则,改善症状，恢复肝功能；抗病毒；抗肝纤维化，延缓肝硬化的发生；预防和监控肝癌；无症状携带者无需抗病毒治疗。,如何预防？,疫苗预防阻断母婴传播避免医源性传播,乙型肝炎疫苗预防-自2005年6月，我国新生儿HBV疫苗接种完全免费-乙肝疫苗接种对象
12、主要是新生儿，其次为婴幼儿 和高危人群。全程共3针，按照0、1、6个月程序-新生儿要求在出生后24hr内接种。单用疫苗阻断母婴传播保护率87.8%，联合 HBIG 保护率95-97%-接种后有抗体应答者保护效果一般至少持续12年,传播途径预防：大力推广安全注射(包括针刺的针具)，对牙科器 械、内镜等医疗器具应严格消毒；严格防止医源 性传播；理发、刮脸、修脚、穿刺和纹身等用具 应严格消毒；注意个人卫生，不共用剃须刀和牙 具等用品；进行正确性教育；对HBsAg阳性孕妇，应避免羊膜腔穿刺，并缩短分娩时间，保证胎盘 的完整性，尽量减少新生儿暴露于母血的机会,意外暴露HBV后预防-血清学检测：立即检测H
13、BsAg、抗-HBs、ALT等，并在3和6个月内复查。-主动和被动免疫：如已接种过乙肝疫苗，且已知 抗-HBs10mIU/ml者，可不进行特殊处理。如未 接种过疫苗或虽接种过疫苗但抗-HBs10mIU/ml 或抗-HBs水平不详，应立即注射HBIG200-400IU，并同时在不同部位接种第1针乙肝疫苗20g，于1 和6个月后分别接种第2针和3针乙肝疫苗各20g。,对患者和携带者的管理-对慢性HBV携带者及HBV患者，除不能献血和 国家法律规定不能从事的特殊职业(如服兵役等)以外，可照常生活、学习和工作，但要加强随访。-乙肝患者和携带者的传染性，主要取决于血液中 HBV DNA水平，与血清ALT
14、/AST或胆红素水平无关。,关于乙肝母婴传播？,乙肝母婴传播的三种途径：（1）宫内传播：是分娩以前在宫内通过胎盘等途径传播，这种情况较少。（2）产时传播：发生在分娩过程中，由于母亲产道的血液、羊水和阴道分泌物中带有乙肝病毒，会使婴儿经口吞入或通过破损的皮肤黏膜而受传染，这种情况占绝大多数。（3）产后传染：有可能通过哺乳或密切接触等途径传播，这种传播属于水平传播，比较常见。,乙肝患者怀孕的时机及注意事项：乙肝患者一定要在肝功能正常、HBV-DNA阴性，维持半年以上怀孕。一旦怀孕，应终止使用各种具有肝毒性的药物，定期到医院进行孕期体检。合理调整饮食结构，主张均衡营养，避免体重增长过快，形成脂肪肝或
15、造成肝脏负担。,HBsAg阳性孕妇分娩时应采取的预防措施：分娩后对胎儿复苏动作应轻，防止损伤咽黏膜，造成感染。避免婴儿吞下可被污染的液体。如果孕妇HBsAg阳性，伴有HBeAg者，行剖腹产，避免胎儿经产道时吞入被污染的阴道分泌物。,HBsAg阳性孕产妇儿童应采取预防措施：乙肝表面抗原阳性孕产妇所生的新生儿，在出生后24小时内注射乙肝免疫球蛋白（100国际单位），并按照国家免疫规划要求，完成24小时内及1月龄合6月龄儿童的三次乙肝疫苗接种。等宝宝周岁到医院复查。,乙肝妈妈母乳喂养有何禁忌：肝功能正常、HBV-DNA阴性，孩子注射过乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗的情况才可以喂奶。但若婴儿口腔、咽喉、食道、胃肠粘膜等处有破损、溃疡或母亲乳头破裂者也应该尽可能避免给孩子哺乳。,欢 迎 指 正,
