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1、,DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则,内容,DNA提取原则1：DNA片段长度,没有严格要求 常规PCR,严格要求产物纯度 存档、产物长期保存 Southern杂交 荧光定量PCR SNP Microarray CGH(比较基因组杂交),DNA提取原则2：DNA产物纯度,DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则,内容,基因组提取方法,溶液盐析法：无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸磁珠法：独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力
2、，而当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目的。传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害身体健康。,DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则,内容,样本保存和前处理抗凝血液,保存 柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或EDTA处理血样。加入抗凝剂混匀后2-8保存一周；20保存一个月；70长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理 1.冻存的抗凝血液使用前溶解应在37水浴迅速溶解。2.抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所
3、需的体积。,样本保存和前处理非抗凝血,保存 非抗凝血即血凝块。-20保存一个月；-70长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理1.冻存的血凝块使用前应在37水浴溶解，轻柔颠倒混匀。2.血凝块取出后先采取机械破碎的方法（例如：放入无粉橡胶手套中捏碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。,血凝块前期破碎程度越高，提取基因组就越容易！,样本保存和前处理白膜层,保存 全血分离得到的白膜层放置-20或-70长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理 1.白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解红细胞后得到的沉淀。2.冻存的白膜层使用前应在37水浴溶解
4、，轻柔颠倒混匀。3.虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液 还是必要的，但用量减半。4.采用白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行操作。即：1ml全血得到的白膜层提取时需要加入提取1ml全血的试剂量。,样本保存和前处理血清/血浆,保存 现在很多科研者使用血清/血浆提取游离核酸进行研究，例如：肿瘤研究。分离得到的血清/血浆放置-70保存。尽量避免样本反复冻融。样本前处理1.冻存的血清/血浆使用前溶解应在37水浴溶解，轻柔颠倒混匀。2.血清/血浆核酸提取时无需红细胞裂解。3.只需100-200ul样本，基本能满足下游常规PCR或荧光定量PCR检测。,样本保存
5、和前处理微量血液/干血点/羊水/胸水,保存 微量血液：抗凝血液-20或-70保存；干血点：干燥后室温或4保存；羊水：-20或-70保存。样本前处理1.微量血液处理同抗凝血液，不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。2.干血点加入缓冲液直接进行提取。3.羊水/胸水提取时先离心得到沉淀，再进行裂解提取核酸。,样本保存和前处理口拭子/漱口水,保存 口拭子：干燥后室温保存漱口水：4保存或离心得到沉淀-20或-70保存样本前处理1.拭子将拭子棉头剪入到离心管里，加入缓冲液直接进行提取。2.有些拭子的棉头剪不下来，可以将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心得到沉淀再进行核酸提取。3.漱口水先进行离心得到沉淀再进行核酸
6、提取。,DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则,内容,基因组提取流程,溶液法（盐析法）,吸附柱法,红细胞裂解,哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞对核酸提取非常重要。红细胞裂解有两种方式：采用红细胞裂解液进行裂解（通常红细胞裂解液按照3倍全血体积加入进行裂解).采用细胞裂解液进行裂解（TIANGEN的细胞裂解液CL是按照2.5倍全血体积），细胞裂解液将红细胞裂解的同时可以裂解白细胞，得到的为细胞核沉淀，更方便基因组DNA的提取。,红细胞裂解充分的现象：得到的沉淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进行两次裂解，
7、注意第二次加入裂解液后需要将沉淀votex彻底混匀。,核细胞裂解,如果有裂红的步骤，请尽量将上清去除再加入裂解液。加入裂解液（如：TIANGEN试剂盒中的GB或FG）和蛋白酶K需要彻底混匀。将沉淀打散混匀后再进行水浴。水浴时看到溶液变清，没有粘稠物或沉淀时即可进行下步操作，通常水浴时间10-30min.若采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，动作要轻柔。离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时注意不要吸取到中间层及有机相。,核酸吸附或沉淀,硅胶膜吸附法1.加入乙醇颠倒混匀后可能会出现絮状沉淀，动作要轻柔。2.将裂解的溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱里，此时的溶液应是高盐低pH值的。通
8、过硅胶膜特异吸附核酸的特性将裂解溶液中的核酸吸附到硅胶膜上。溶液法1.当沉淀时间有限时，用预冷的异丙醇沉淀，沉淀会更充分。2.加入异丙醇颠倒混匀后应出现丝状沉淀，动作要轻柔，避免基因组因过于猛烈的外力而降解。3.分离沉淀的方法：a.用枪头小心地将丝状沉淀挑出；b.离心分离，应保证一定的转速和时间。,核酸洗脱或溶解,硅胶膜吸附法1.用去蛋白液、漂洗液将膜上的核酸漂洗后，将不加溶液的吸附柱离心以去除残留的液体及挥发乙醇成分。加入适量洗脱液TB buffer（或自己配制的buffer）后放置5-10 min后再进行离心得到基因组DNA。溶液法1.使用70-75乙醇对核酸沉淀进行洗涤。溶解DNA前需要
9、室温或37放置几分钟晾干核酸（使乙醇挥发），然后再加入适量的TB buffer（或自己配制的buffer）溶解DNA。,DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则,内容,浓度：100300ng/ul纯度：任何杂质都可能导致DNA在储存过程中的降解，因此要确保纯化得到的核酸的纯度。温度：纯化得到基因组DNA之后需将DNA溶液分装保存到-20，反复冻溶会导致DNA的降解。溶解DNA Buffer：纯化得到的基因组DNA最好溶解在TB Buffer(TIANGEN)或者Tris缓冲液里，因为大片段的基因组DNA在酸性水溶液中不稳定，易水解。,核酸保存
10、,纯度（OD260-320/OD280-320）紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.11.0之间，通常离心柱法稀释45倍；溶液裂解法稀释2030倍）OD260-320/OD280-320 1.9 说明有部分降解或有RNA污染得率 紫外分光光度计进行测量Yield OD26050ng/ul稀释倍数,DNA检测方法紫外分光光度法,Tiangen 产品提取得率,产品详细细节请直接点击产品名称,DNA检测方法电泳检测,取2l 洗脱液1%琼脂糖凝胶电泳,检测DNA分子大小，纯度以及完整性,TIANamp 血液基因组DNA提取试剂盒提取相同血样不同起始体积的DNA电泳图,电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象，影响正确判断。如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明书基因组DNA有降解。,TIANamp微量样本基因组DNA提取试剂盒样本来源一致，分别取1l，10l，50l，100l为起始样本提取基因组。各取2l基因组DNA为模板，扩增GAPDH基因，荧光定量PCR分析实验结果。,DNA检测方法荧光定量PCR检测,微量样本基因组DNA的检测通常采用荧光定量PCR检测，例如：干血点、微量血液等。,DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则,内容,试剂选择指南,
