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1、,第 七 章 酶 及 其 动 力 学,定义：酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。,酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。,生物学意义,能在体内十分温和的条件下高效率地起催化作用，并通过自我调节使生物体内各种物质处于不断的有序的代谢之中。,一、酶的概念,第一节 概述,有关概念 酶促反应 底物（S）产物（P）途径 循环 原始底物 中间产物 最终产物,表示方法,酶具有一般催化剂的特征 1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。,二、酶作用的特点,2.专一性：酶对
2、底物具有严格的选择性。,3.敏感性：对环境条件极为敏感，易于失活。,4.可调性：酶活性的调节和酶合成速度的调节。,酶的催化特点,1.高效性：通常要高出非生物催化剂催化活性的1061013倍。,1mol过氧化氢酶 5106molH2O21mol离子铁 610-4molH2O2,1、酶的化学本质,蛋白质,1926年首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。,酶是蛋白质的证据：其组成、结构、性质与蛋白质一样,三、酶的化学本质与组成,2、化学组成,酶,单纯酶,结合酶,（全酶）=酶蛋白+辅因子,辅因子,辅酶,：与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。,辅基,：与酶蛋白结合得紧
3、密的小分子有机物。,金属激活剂,：金属离子作为辅助因子。,酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。,3、单体酶、寡聚酶和多酶复合物,单体酶（monomeric enzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。,寡聚酶(oligomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。,多酶复合物(multienzyme system)：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。例如,丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（E）、硫辛酰转乙酰酶（
4、E）和二氢硫辛酰脱氢酶（E）。,碱性,1、酶的分类,1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：,1.氧化还原酶类：主要催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。,AH2+B（O2）,A+BH2（H2O2，H2O）,（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。,AH2+B,A+BH2（需辅酶或辅酶）,四、酶的分类与命名,（2）氧化酶类,催化底物脱氢，氧化生成H2O2：,AH2+O2,A+H2O2（需FAD或FMN）,催化底物脱氢，氧化生成H2O：,2AH2+O2,2A+2H2O,（3）过氧化物酶,ROO+H2O2,RO+H2O+O
5、2,（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）,（顺，顺-已二烯二酸）,RH+O2+还原型辅助因子,ROH+H2O+氧化型辅助因子,（又称羟化酶）,2.转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。,AX+B,A+BX,根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。,3.水解酶类：催化加水分解作用。,AB+H2O,AOH+BH,4.裂解酶类：催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。,CC键,+CO2,CO键,+H2O,CN键,+NH3,5.异构酶：催化 各种异构体之间的互变。,常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。,6.合成酶类：催化有ATP参加的
6、合成反应。,编号,EC：n1.n2.n3.n4,EC 国际酶学委员会 n1 据反应性质分六大类 n1=16 n2 n1下再分亚类 n2=1i n3 n2下再分亚亚类 n3=1i n4 在亚亚类中的排行 n4=1i,EC：1.1.1.x催化的反应都是-C-OHNAD（P）-CO-HNAD（P）HH,2、酶的命名 有两种方法：系统名、惯用名。,系统名：底物名称：底物名称反应类型酶,乳酸+NAD+,丙酮酸+NADH+H+,乳酸：NAD+氧化还原酶,惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型，有的加来源。,乳酸：NAD+氧化还原酶,乳酸脱氢酶,对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。,蛋白质
7、水解酶,（胰、胃、木瓜）蛋白酶,1、酶作用的专一性,酶作用的专一性,结构专一性,立体异构专一性,族（基团）专一性,绝对专一性,相对专一性,五、酶作用的专一性,族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。,绝对专一性：只能作用于某一底物。,2NH3+CO2,立体异构专一性,旋光异构专一性几何异构专一性,D-、L-；、,顺、反,2、专一性机理 锁钥学说 诱导契合学说 见下章,1、酶活力的测定,（1）活力 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。,用在一定条件下所催化的某一化学反应的速度来表示。,速度测定原则 测初速度（S/S05%）S/P易测者，但以P为佳 SE，条件最适，无抑制激活剂,六、酶活力测
8、定及分离纯化,（2）酶（活力）单位：（U，IU）在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。,国际单位 在最适的反应条件（25）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即 1IU=1mol/min,卡达尔 在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位，即 1kat=1mol/s,1kat=6107IU,自定义,（3）比活力 单位酶制剂中的活力单位数 活力单位数/毫克或摩尔酶制剂,（4）测定方法,求出速度，除以活力单位，即为单位数,速度测定常用方法 分光光度法 荧光光度法 同位素标记法 电化学法,最常用分光光度法 直接比色分析法
9、化学偶联分析法 酶偶联分析法,2、分离纯化工业上大多采用微生物发酵的方法来获得大量酶制剂。,优点：不受气候、地理条件的限制，动、植物体内的酶大多可从微生物体内找到，微生物繁殖快，产酶量丰富。还可以通过选育菌种来提高酶的产量和用廉价原料大量生产。,酶分离纯化的三个基本步骤：抽提，纯化，结晶或制剂。,方法：1.根据溶解度不同（盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法）；2.根据酶与杂蛋白分子大小的差别（凝胶过滤法、超离心法）；3.根据酶和杂蛋白与吸附剂之间吸附与解吸附性质的不同（吸附分离法）；4.根据带电性质（离子交换层析法、电泳分离法、等电聚焦层析法）；5.根据酶与杂蛋白的稳定性差别（
10、选择性变性法）；6.根据酶与底物、辅因子或抑制剂之间的专一性亲和作用（亲和层析法）。,酶的纯化倍数与产率计算：比活力=活力单位数/毫克蛋白（氮）,酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法等,酶的保存：1、低温（04，-20）；2、高浓度较稳定；3、加入稳定剂；4、固定化；5、干燥。,1、核酶 具有催化功能的RNA。,2、抗体酶 具有催化功能的免疫球蛋白（抗体）。,3、同工酶 催化相同反应但组成、结构、调节、分布 等不同的一组酶,乳酸脱氢酶（LDH）,七、核酶、抗体酶、同工酶,酶工程,研究酶的生产、纯化、固定化、修饰和改造以及在工、农、医、科学等领域的应用的技术。,1、化学酶工程,通过
11、对酶的化学修饰、固定化处理，改善其性质以提高酶效率和降低成本，甚至人工合成酶的技术。,天然酶,修饰酶,固定化酶,人工模拟酶,提取、纯化的酶,给酶加减基团后性能改变的酶,不溶于水而保持活性的酶,人工合成的有催化活性的有机分子。,八、酶工程简介,2、生物酶工程,用基因重组技术生产或对酶基因修饰或设计新基因，从而生产性能稳定、具有新的生物活性及催化效率更高的酶的技术。,克隆酶,突变酶,新酶,用基因重组技术由受体生物合成的酶,对酶基因修饰后导入受体生物合成的酶,人工设计的基因导入受体生物合成的酶,工业上酶应用的优点：酶的催化效率高，专一性强，不发生副作用。酶作用条件温和。酶及其反应产物大多无毒性。,九
12、、酶的应用,酶的固定化就是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）或化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。,吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。,包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。,偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。,交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成“网状”结构。,1、酶促反应速度,反应速度 单位时间内底物或产物的变化量,单分子反应 仅有一个底物分子参加的反应,v=dc/dt=dc/dt=kc,双分子反应 有两个底物分子参加的反应,v=dc/dt=kc1c2,第二节 动力学
13、有关概念,2、反应级数,一级反应 反应速率只与底物浓度的一次方成正比的反应,即单分子反应速度,二级反应 反应速率与底物浓度二次方或两种底物浓度 积成正比的反应 即双分子反应速度 但有些双分子反应的级数是一级。如水解反应，水是介质，参与反应的忽略。,零级反应 反应速度与底物浓度的反应,3、影响酶促反应速度的因素,影响酶促反应速度的因素有酶浓度、底物浓度、抑制剂、激活剂、温度、pH值,研究某一因素的条件同测定反应速度的条件,底物浓度对酶反应速度的影响,一级反应 v=k S,零级反应 v=k E,第三节 底物浓度对酶促反应速度的影响,1、中间产物学说 Henri和Hurtz提出,当底物浓度很低时，有
14、多余的酶没与底物结合，随着底物浓度的增加，中间络合物的浓度不断增高。,当底物浓度较高时，溶液中的酶全部与底物结合成中间产物，虽增加底物浓度也不会有更多的中间产物生成。,k1,k3,2.米氏方程式（Michaelis-Menten equation）,（kmS，v=kS；km S，v=Vmax）,k2,米切尔、曼顿 平衡态米氏方程推导,k3,设酶总浓度为E0，底物总浓度为S，游离酶浓度为E=E0ES，剩余底物浓度为S=SES=S v1=K1ES=K1（E0ES）S v2=K2ES v3=K3ES1913年Michaelis-Menten认为反应1、2迅速建立平衡，即 K1（E0ES）S=K2 E
15、S整理得,=,k2,k1,定义K2/K1为Ks，命名为中间产物解离常数,即,Ks=,解出ES得,ES=,反应速度v=K3 ES,v=,K3 E0=Vmax v=,伯瑞格斯、哈尔丹 稳态米氏方程推导,k3,设酶总浓度为E0，底物总浓度为S，游离酶浓度为E=E0ES，剩余底物浓度为S=SES=S v1=k1ES=K1（E0ES）S v2=K2 ES v3=K3 ES1925年Briggs-Haldane认为反应中ES不变，即稳态,K1（E0ES）S=K2 ES K3 ES整理得,k2,k1,定义K2K3/K1为Km，命名为米氏常数,即,Km=,解出ES得,ES=,反应速度v=K3 ES,v=,K3
16、 E0=Vmax v=,米氏方程是双曲线的推导,上式变换为,vKmvS=VmaxS,两边各加 Vmax Km 得,v KmvSVmax Km=VmaxSVmax Km,v KmvSVmax KmVmaxS=Vmax Km,v（KmS）Vmax（KmS）=Vmax Km,（v Vmax）（SKm）=Vmax Km,（xa）（yb）=c,3.米氏常数的意义,v=Vmax/2，则：km=S Km=(Vmax/v-1)S,意义：,（1）km是酶的一个基本的特征常数。其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改变。,（2）从km可判断酶的专一性和天然底物。Km最小的底物，通常
17、就是该酶的最适底物，也就是天然底物。,（3）当k2k3时，km的大小可以表示酶与底物的亲和性。,km=（k2+k3)/k1,Km k2/k1,km可以看作ES的解离常数ks：,当km大，说明ES容易解离，酶与底物结合的亲和力小。,（4）从km的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度。也可以算出某一底物浓度时达最大反应速度的倍数,从米氏方程中求得：当反应速度达到最大反应速度的90%，则,90%V=100%VS/(km+S),即 S=9km,在进行酶活力测定时，通常用4km的底物浓度即可。,反应速度达最大反应速度的百分率也近似地表示酶被底物饱和的百分率,v=K3 ES Vmax=K3 E v
18、/Vmax=ES/E,（5）km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。,丙酮酸,乳酸,乙酰CoA,乙醛,乳酸脱氢酶（1.710-5）,丙酮酸脱氢酶（1.310-3）,丙酮酸脱羧酶（1.010-3）,当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于km最小的酶。,4、Vmax的意义,是一个基本常数。在一定酶浓度下，与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改变。,5、K3的意义,当底物浓度很大时，v=K3ES=K3E=Vmax K3即为转换数，用Kcat表示。转换数 一定条件下，每秒钟每个酶分子（mol、mol）转化底物的分子（mol、mol）数。它表示酶的催化效率,6、Kcat/Km的意义 单
19、位亲合力的转换数，也表示催化效率。常用来比较不同酶的效率高低。,7、Km和Vmax的求法,米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测定不同底物浓度的反应初速度，从v与S的关系曲线求得V，然后再从1/2V求得相应的S即为km（近似值）。,（1）（Lineweaver-Burk）双倒数作图法,（y=ax+b）,斜率=km/Vmax,1/Vmax,-1/km,（2）Eadie-Hofstee作图法,v Kmv S=Vmax S,v S=Vmax S v Km,v=Vmax Km v/S,y=ax b,v,v/S,Vmax,（3）Hanes-Woolf作图法,双倒后同乘S,y=axb,S,Km,（4）
20、Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图法,把（2）所得方程,v=Vmax Km v/S移相得,Vmax=v Km v/S 可见无论底物浓度和速度如何变化，Vmax 是一个常数，在v对S图上是一个点。把S标在横轴负侧，v 标在纵轴上，各直线交叉点为Km和Vmax的坐标。,v,S,Vmax,Km,多底物的酶促反应动力学,1、酶促反应按底物数分类 单底物 异构酶 单向单底物 裂合酶 假单底物 水解酶 双底物 氧化还原酶 转移酶 三底物 连接酶,2、双底物反应按动力学机制分类,（1）序列反应或单-置换反应,a、有序：,E,EA,EAB,EPQ,b、无序：,E,EA/B,EAB,E
21、PQ,（2）乒乓反应或双-置换反应,E,A,EA,EP,EP,B,EB,EQ,EQ,与酶结合使酶活力降低甚至丧失的物质，称为抑制剂（I）。抑制剂使酶活性降低或丧失的作用，称为抑制作用。,不可逆抑制剂,可逆抑制剂,与酶必需基团共价结合不能被透析或滤掉。酶活性不能自己恢复,与酶必需基团非共价结合可被透析或滤掉酶活性能自己恢复,专一 与一种酶结合,不专一 与一类酶结合,竞争性,非竞争性,反竞争性,与结合部位结合,与非结合部位结合,与ES结合,一、抑制作用的类型,第三节 酶的抑制作用,1 抑制剂分类,2、可、不可的鉴别,透析、过滤、测速度曲线,E,v,1,2,3,1.反应体系中不加I。,2.反应体系中
22、加入一定量的不可逆抑制剂。,3.反应体系中加入一定量的可逆抑制剂。,I,I,二、抑制作用,1.不可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的。,+IEI,ESH+ICH2COOH ESCH2COOH+HI,2、可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合是可逆的。,抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。,竞争性抑制作用：抑制剂和底物竞争与酶结合。,特点：1）抑制剂和底物竞争酶的结合部位,+IEI,ki=EI/EI,V/2,km,2）抑制程度取决于I和S的浓度以及与酶结合的亲和力大小。,km,无 I,有 I,3）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似。,Vmax不变,Km
23、变大,非竞争性抑制作用：底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的EIS不能进一步转变为产物。,无 I,V/2,km,有 I,(),Vmax变小,Km不变,反竞争性抑制作用：抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成ESI复合物。,km,km,Vmax变小,Km变小,Vmax,Vmax,看图辨类型,竞争性抑制剂,非竞争性抑制剂,反竞争性抑制剂,三、重要抑制剂举例,1、不可逆抑制剂,（1）非专一,有机磷化合物 有机汞化合物重金属、烷化剂、氰化物、CO、青霉素等,（2）专一性,Ks型 亲和标记试剂 如 对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮是胰蛋白酶的,Kcat型 自杀性底物 如 别嘌呤醇是黄嘌呤氧化酶的 卤代-D-
24、丙氨酸是细菌丙氨酸消旋酶的,2、可逆抑制剂,竞争性 抗代谢物或代谢类似物 如 5-氟脲嘧啶等抗癌 磺胺类药杀菌,叶酸合成酶,抑制作用的机制：,1.抑制剂与酶结合成极稳定的络合物，从而减低或破坏酶的活性。,2.破坏酶或辅基的活性基团或改变活性位的构象。（如重金属（Ag+、Hg2+）和类金属（As3+）破坏SH）,3.夺取酶与底物结合的机会，从而减少酶的作用。（竞争性抑制剂）,1、温度对酶作用的影响,两种不同影响：1.温度升高，反应速度加快；原因是分子热运动2.温度升高，反应速度降低；原因是热变性,最适温度,第五节 温度、pH值、激活剂 对酶促反应的影响,2、pH对酶作用的影响,pH,v,最适pH,1.最适pH,2.pH稳定性,表现出酶最大活力的pH值,在一定的pH范围内酶是稳定的,pH对酶作用的影响机制：1.环境过酸、过碱使酶变性失活；2.影响酶活性基团的解离；3.影响底物的解离。,3、激活剂对酶作用的影响,凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。,v,激活剂,返回近似值,
