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1、学校代码： 10184学 号： 2064126415 延 边 大 学 本科毕业论文本科毕业设计（题 目: 软枣猕猴桃果实成熟软化中果胶分解酶活性变化学生姓名： 学 院：农 学 院专 业：园 艺班 级：2006 级指导教师：二 一 年 六 月延边大学本科生毕业论文 摘 要为了研究软枣猕猴桃果实成熟软化中果胶分解酶活性的变化，以软枣猕猴桃为试材，测定了软枣猕猴桃在采后多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，简称PG酶)和b-半乳糖苷酶（-galactosidase，简称-Gal酶）活性变化。结果表明，软枣猕猴桃果实在生长发育初期PG酶活性较高，在成熟前活性最低，但成熟期又急剧增加；软
2、枣猕猴桃果实采后1d，PG酶活性达峰值，说明PG酶在软枣猕猴桃采后前期起主要作用。软枣猕猴桃果实在生长发育过程中b-Gal酶活性除幼果期外持续增加；软枣猕猴桃果实采后b-Gal酶活性继续增加，在采后4d达峰值，说明b-Gal酶在软枣猕猴桃采后后期起主要作用。软枣猕猴桃果实成熟软化中果胶分解酶活性的变化，为软枣猕猴桃果实软化机理研究提供重要的基础数据，对软枣猕猴桃资源的开发利用具有非常重要的意义。关键词：软枣猕猴桃；生长发育；采后；PG酶；b-半乳糖苷酶AbstractIn order to study the changes of pectin decomposition enzyme act
3、ivity in Actinidia arguta fruit during mature and softening, we used Actinidia arguta fruit as materials，determined the changes of Polygalacturonase enzyme (Polygalacturonase, was called the PG enzyme) and -galactosidase (-galactosidase, abbreviation -Gal enzyme) activity. The results indicated that
4、 PG enzyme activity was high in the initial period of growth and lowest before maturity period，but increased largely during maturity period; PG enzyme activity reached a peak in the 1d after picking ，showing that PG enzyme play a leading role in the earlier period after picking. -Gal enzyme activity
5、 increased sostenuto during growth except young fruit stage; -Gal enzyme activity continue increased after picking，reached the peak in the 4d after picking，showing that -Gal enzyme play a leading role in the later period after picking.The changes of pectin decomposition enzyme activity in Actinidia
6、arguta fruit during mature and softening providing important basic status for softening mechanism research. It has the very vital significance to the development and use of Actinidia arguta resources.Key words: Actinidia arguta ；Growth；After picking ；Polygalacturonase；-galactosidase目 录引 言11材料与方法21.1
7、试验材料51.2试验方法52结果与分析72.1 软枣猕猴桃果实生长发育过程中PG酶活性变化 72.2 软枣猕猴桃果实采后PG酶活性变化72.3 软枣猕猴桃果实生长发育过程中b-半乳糖苷酶活性变化82.4 软枣猕猴桃果实采后b-半乳糖苷酶活性变化8结 论10参考文献11致谢词13III 引 言软枣猕猴桃(Actinidia arguta Sieb.et Zucc)，又名软枣子，猕猴梨，藤瓜,属于猕猴桃科(Actinidiaceae)、猕猴桃属(Actinidia)多年生落叶藤本植物，是猕猴桃属中在中国地域分布最广泛的野生果树之一。分布于东北、华北、西北及长江流域各省，朝鲜、日本、俄罗斯亦有分布，
8、以我国东北三省的资源最为丰富，其中，小兴安岭和长白山山区较多见。软枣猕猴桃主要生长在森林深处。果实为椭圆形，长约3cm，直径1.5cm左右，果肉细腻，果味甜美，是难得的野生绿色果品。有水果Vc之王的美称，是第三纪孑遗植物，具有耐寒、耐旱、抗病的良好基因，属长白山山脉特有的野生资源。多在海拔800米以上高山分布，8月末9月初成熟。单果重7g左右，最大果重15g左右。软枣猕猴桃汁具有阻断致癌性亚硝基化合物合成的作用，还含有硫醇蛋白酶的水解酶和超氧化物歧化酶（SOD）,可以嫩化肉类、具有养颜、提高免疫功能、增强抗癌、抗衰老、软化血管、抗肿消炎的功能。营养与保健价值极高，可加工成果酱、果汁、果酒，果脯
9、。李时珍曾在本草纲目中生动地描述过猕猴桃名称的由来“其形如梨，其色如桃，猕猴喜食，故有诸名。”软枣猕猴桃产于长白山区各县，是长白山区著名的经济野果之一。果胶(Pcctin)是一组聚半乳糖醛酸。它具有水溶性,工业上即可分离,其分子量约5万30万。在适宜条件下其溶液能形成凝胶和部分发生甲氧基化（甲酯化，也就是形成甲醇酯）,其主要成分是部分甲酯化的a(l,4)一D一聚半乳糖醛酸。残留的羧基单元以游离酸的形式存在。果胶存在于植物的细胞壁和细胞内层，为内部细胞的支撑物质。不同的蔬菜，水果口感有区别，主要是由它们含有的果胶含量以及果胶分子的差异决定的。果胶是一种天然高分子化合物，具有良好的胶凝化和乳化稳定
10、作用。果胶分高酯、低酯果胶两种。高酯果胶主要用于果酱果冻、凝胶软糖果馅芯及乳酸菌饮料等的稳定剂。低酯果胶主要用于：甜点色拉凋味酱、冰淇淋、酸奶等的稳定剂。果胶与果汁生产时，果汁的粘度，清浊度有关。随着果蔬成熟，果蔬组织逐渐软化，构成细胞壁的多糖质也逐渐变的可溶解。其程度因果蔬种类、品种等不同而有所不同。因此，形成各种类型的肉质，过度软化会使果蔬质量下降，调节保持适宜的软化程度是果蔬贮藏、流通过程中极为重要的问题。果胶及果胶酶对果蔬的软化及贮藏性影响很大。但对于果胶酶的作用及软化机理仍有许多尚未搞清的地方。一般易软化的果蔬，其果胶酶活性高，贮藏性低，不易软化的果蔬，其果胶酶活性低，贮藏性高。因此
11、，对易软化的果蔬，常由于采收早而达不到其成熟时的风味。对于高质量果蔬的开发，不仅需有很好的保藏技术，还需培育保质期长的品种，使其可充分成熟后再采收，这样就可保证果蔬有较好的风味。为了提高果蔬贮藏性和风味的目的，必须进一步研究果蔬软化的机理1。果实的软化与细胞壁结构变化密切相关。影响植物组织软化的较重要的酶有PG酶和Gal酶、果胶甲基酯酶(Pectinmethyl esterase，简称PME)等2。Gal酶是水解果胶支链分子半乳聚糖的酶，PME起到切除果胶的甲基使之转换成果胶酸的作用。总之，在细胞壁分解酶的作用下细胞壁成分分子结构发生变化，意味着果实细胞壁瓦解，也就是果实的软化，所以细胞壁成分
12、分子结构容易发生变化的果实耐贮性差，反之耐贮性强。朴一龙等3进行了梨果实贮藏中可溶性果胶和半纤维素分子结构的变化的实验，结果表明：耐贮性强的苹果梨在贮藏中可溶性果胶分子大小变化不明显，但耐贮性相对较弱的新高梨的可溶性果胶分子明显变小，说明梨的耐贮性与可溶性果胶分子结构变化有关；耐贮性强的苹果梨在贮藏初期半纤维素分子明显大于新高梨，苹果梨的半纤维素分子在贮藏过程中明显变小，但耐贮性相对较弱的新高梨的半纤维素分子大小变化不明显，说明梨的贮藏性与半纤维素的分子大小有关，而与半纤维素的分子结构变化似乎没有直接关系。早在l965年就有学者提出PG酶与番茄果实的软化密切相关4；随后也有许多研究表明PG酶是
13、主要的细胞壁水解酶之一，其主要功能是水解果实细胞壁中果胶酸的1，4-2-D半乳糖苷键，使细胞壁结构解体，导致果实软化。番茄5 、桃6 、猕猴桃7 等果实在软化过程中，其硬度下降，而PG酶活性逐步提高。陈发河等8在对葡萄(Vitis Vinifera Linn)的研究时发现，植物生长调节物质对葡萄浆果脱落的不同调节作用都与PG的表达有关，PG活性表达可引起细胞壁结构的改变及其他细胞壁水解酶的释放，进而加速成熟的后续过程。因此认为，PG酶是引起果实软化的主要原因。PG酶在果实软化过程中起着重要作用，其至少有4个方面的证据： 果实软化进程与PG酶活性升高一致；体外实验中，PG酶能直接水解从未成熟的果
14、实中分离得到的细胞壁材料；未成熟果实的果皮组织用PG酶液处理时，其细胞壁超微结构变化与果实成熟时的一样； 果实不能正常成熟和软化的突变体(rin，nor和Nr)中PG酶的活性很低2。近年来的研究表明，PG酶可能不是唯一调节果实软化进程的关键酶，其它细胞壁降解酶在果实软化过程中也起着重要作用。苹果、芒果、番木瓜、甜樱桃、鳄梨、猕猴桃、青梅等果实的硬度下降与-Gal酶有密切的关系9,10。-Gal酶作用于鼠李半乳聚糖骨架的支链残基，降解果胶聚合体，破坏细胞壁结构，从而使果实软化11。Fische等12认为，-Gal酶在果实软化早期含量丰富，参与降解细胞壁半乳糖苷键，导致细胞壁的完整性下降。Gros
15、s等13报道，细胞壁半乳聚糖的下降先于或伴随着可溶性多聚醛酸的增加，而且-Gal酶在果实成熟的早期先于PG酶出现。但有的学者9.14却认为-Gal酶与果实成熟软化无关。薛炳烨15报道，肥城桃果实中-半乳糖苷酶是一种与细胞壁结合的酶，其活性很高，与果实硬度下降密切相关，但-Gal酶则与之无关。但金美贤等16研究发现桃果实在成熟中PG酶活性增加，而完熟期和贮藏中-Gal酶活性明显增加。猕猴桃的PG和-Gal酶在成熟过程中活性增加17。陈昆松等10研究发现，从成熟中华猕猴桃果实中克隆到了一 个-Gal酶基因 cDNA片段， mRNA在采收时最为丰富，随后下降，并认为-Gal酶可能在猕猴桃果实后熟软化
16、的启动阶段起作用，用外源乙烯处理可诱导-Gal酶基因的表达。Ross等18以苹果为材料也得到相似的结果。罗自生等19研究发现，贮前热处理能显著提高柿果实-Gal酶的活性，从而降低冷害指数，使果实正常软化。中华猕猴桃成熟软化过程中，PE、PG活性越高、协同作用越强，果实软化越快，PG活性在果实软化中的作用更大20。猕猴桃成熟过程中在PG酶和-Gal酶作用下果胶分子量明显减少，水溶性果胶含量增加21。猕猴桃在贮藏期间，后采收的果实比早采收的果实表现出更快的软化速率，经光照处理的果实比遮光处理的果实显示出更大的果肉硬度，冷藏后，在常温下维持一个星期的果实的PG酶活性更高，特别是峰值出现在后采收的果实
17、上；-Gal酶的表现则不同，在后采收的果实上未出现变化，而在早采收的果实经光照和遮光处理后，明显减少22。美味猕猴桃在冷藏条件下，果实软化过程均分为两个明显的阶段，第一阶段果实硬度快速下降，此阶段与淀粉酶活性上升而引起的淀粉迅速水解呈正相关( R=0.99)，第二阶段果实硬度下降趋于缓慢，此时PG酶活性提高，导致非水溶性果胶水解为水溶性果胶23。雷玉山等24研究发现秦美和“Hayward”猕猴桃常温贮藏条件下，PG酶和纤维素酶的活性逐渐上升又下降，而果胶甲酯酶活性呈下降趋势。然而，软枣猕猴桃细胞壁成分和果胶酶活性变化方面尚未见文字报道。长白山地区软枣猕猴桃资源十分丰富，是本地区的优势野生资源和
18、具有广阔开发前景的果树种类，然而至今仍处于自生自灭状态，开发利用迫在眉睫。软枣猕猴桃果实具有极易软化的致命弱点。软枣猕猴桃的耐贮性很大程度上限制了软枣猕猴桃的人工驯化栽培和进一步的开发利用。在不了解软枣猕猴桃果实软化机理的情况下的贮藏加工具有很大的盲目性。为了软枣猕猴桃的开发利用和深加工，迫切需要软枣猕猴桃果实软化机理方面的系统研究。研究长白山地区野生软枣猕猴桃果实成熟软化中果胶分解酶活性变化，为软枣猕猴桃果实软化机理研究提供重要的基础数据。有助于长白山地区的野生软枣猕猴桃果实贮藏和加工乃至资源开发利用，对地区的资源优势转化为经济优势、果品种类多样化、增加农民收入和地方经济的发展具有非常重要的
19、意义。1 材料与方法1.1 试验材料试验于2009-2010年在延边大学农学院进行。试验用果实采自吉林省安图县亮兵台镇新安村。从花后15d（6月28日）起，每隔15d采样作为软枣猕猴桃果实生长发育过程中果胶酶分析材料，选择大小均匀、无机械损伤和病虫害的果实进行品质分析，并把一部分果实在-30冰柜中冷冻贮藏，以备果胶酶分析之用；成熟期（9月5日）采集的果实样品作为贮藏中果胶酶活性变化分析材料。采回的果实样品在室温下，用加湿器保持95%以上相对湿度环境中贮藏，从贮藏当日起，每隔1d选择大小均匀、成熟度一致、无机械损伤和无病虫害的果实进行品质分析，并把部分果实在-30冰柜中保存待用。1.2试验方法1
20、.2.1 PG酶的提取与活性测定在5 g冷冻果实组织中加入20 ml 50 mM的 Na-醋酸缓冲液（pH 6.0，含2.4 M NaCl）和少量石英砂及0.5 g PVP进行研磨，搅拌4 h后在4条件下以15000 rpm离心30 min，上清液利用透析膜（MW cut-off 12800纤维素膜，Sigma）在50 mM Na-醋酸缓冲液（pH4.5，含150 mM NaCl）里透析24 h（透析液更换一次），透析后的上清液即为粗酶液。经酒精精制过的多聚半乳糖醛酸溶解在分析用缓冲液里制作0.2%的溶液作为基质。在0.3 ml基质里加入0.2 ml粗酶液稀释液（稀释5倍）在40条件下反应40
21、 min后利用DNS法测定OD值。把30条件下1 h生成1 mole还原糖的酶活性定为一个酶单位，结果以units.g-1FW（U）表示。对照在终止反应后加入酶液进行测定。酶提取的所有过程在低于4的条件下进行。1.2.2 -Gal酶的提取与活性测定 在5 g冷冻果实组织中加入20 ml 1.4M NaCl（pH 6.0）和少量石英砂及0.5 g PVP进行研磨，在冰池中搅拌1 h后在4条件下以12000 rpm离心20 min，上清液用上述的透析膜在0.1 M 柠檬酸缓冲液（pH 4.0）中透析24 h（透析液更换一次），透析后的上清液即为粗酶液。0.1 ml酶液 + 0.5 ml 0.1M
22、柠檬酸缓冲液（pH 4.0）+ 0.4 ml BSA（0.1% 清蛋白）+ 0.4 ml p-硝基酚半乳糖苷（13 mM 柠檬酸缓冲液中溶解）混合液作为反应液。反应液在37条件下反应15 min，之后加入2 ml 0.2 M的Na2CO3终止反应。在400 nm波长中测定游离的p-硝基酚浓度。把37条件下1 min生成1 mmole的p-硝基酚的酶活性定为一个酶单位，结果以units.g-1FW(U)表示。对照用p-硝基酚。酶提取的所有过程是在低于4的条件下进行。2 结果与分析2.1 软枣猕猴桃果实生长发育过程中PG酶活性变化 图1 软枣猕猴桃果实生长发育过程中PG酶活性变化Fig.1 Cha
23、nges in Polygalacturonase activity in Actinidia arguta fruit during growing process 试验结果表明，在软枣猕猴桃果实生长发育过程中PG酶的活性降低，并在花后75d达最低点，在果实成熟期（花后88d）急剧增加，但仍低于花后30d的PG酶活性。幼果期PG酶活性很高的原因，很可能是幼果期果实水分较少且PG酶活性又以鲜果重为单位测定的结果。2.2 软枣猕猴桃果实贮藏过程中PG酶活性变化 图2 软枣猕猴桃果实采后PG酶活性变化 Fig.2 Changes in Polygalacturonase activity in A
24、ctinidia arguta fruit after picking 试验结果表明，软枣猕猴桃果实在采后PG酶的活性迅速增加，在贮藏1d达活性高峰，然后又缓慢下降。说明PG酶在软枣猕猴桃果实采后前期起主要作用。PG活性高峰与水溶性果胶开始增加的点一致，而且也是淀粉含量大量减少的起点(未发表)，这与李日太等20和陈金印等22在美味猕猴桃上的研究结果相似。说明在PG酶活性峰值点上有大量的果胶分解，PG酶在软枣猕猴桃果实软化过程中起重要作用。2.3 软枣猕猴桃果实生长发育过程中b-半乳糖苷酶活性变化 图3 软枣猕猴桃果实生长发育过程中b-半乳糖苷酶活性变化Fig.3 Changes in -gal
25、actosidase activity in Actinidia arguta fruit during growing process试验结果表明，软枣猕猴桃果实在生长发育过程中的b-Gal酶活性在花后30d较高，花后45d降到最低，然后逐渐递增，在花后88d达最高峰。花后30d b-Gal酶活性高的原因，很可能是幼果期果实水分较少且以鲜果重为单位测定的结果。2.4 软枣猕猴桃果实贮藏过程中b-半乳糖苷酶活性变化图4 软枣猕猴桃果实采后b-半乳糖苷酶活性变化Fig.4 Changes in -galactosidase activity in Actinidia arguta fruit a
26、fter picking 试验结果表明，软枣猕猴桃果实在采后b-Gal酶活性逐步增加，在贮藏4d达峰值，然后又急剧下降。说明b-Gal酶活性在果实软化后期起主要作用。 3 结 论3.1 软枣猕猴桃果实在生长发育初期PG酶活性较高，在成熟前活性最低，但成熟期急剧增加；软枣猕猴桃果实采后PG酶活性在贮藏1d达峰值，说明PG酶在软枣猕猴桃采后前期起主要作用。3.2 软枣猕猴桃果实在生长发育过程中b-Gal酶活性除幼果期外持续增加；软枣猕猴桃果实采后b-Gal酶活性继续增加，在采后4d达峰值，说明b-Gal酶在软枣猕猴桃采后后期起主要作用。 参 考 文 献1 2 Huber D JThe role o
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