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1、免疫血液学基础知识,主要内容,临床输血发展简史免疫血液学基础概念红细胞血型抗原系统红细胞血型血清学检测技术医院血库的工作职责,人类历史上早期输血尝试,1667年法国御医Jean用羊血治疗精神病患者,1818年英国产科医生James 首次用人血输治患者,早期的床边直接输血,血型之父,1901发现ABO血型又发现MN，P，Rh等血型，赢得了“血型之父”的誉称。1930年因发现人类ABO血型系统而获得诺贝尔奖金,Karl Landsteiner(1868.0),真正使输血变得容易的人卢因森（1915年1月）,纽约的卢因森博士发明了实用的柠檬酸钠抗凝剂方便献血方便输血方便保存方便运输使建立血库成为可能
2、,临床输血发展简史,1901、1940年奥地利科学家Landsteiner等人先后发现了ABO和RH血型系统，使输血治疗有了牢固的科学基础，从而极大地提高了临床输血的安全性1937年世界上第一个血库在芝加哥Cock County医院建立，标志着输血开始成为临床医学的重要组成部分和常规治疗手段现在输血已经发展成一门涉及多学科的独立的边缘学科-输血医学,二战促进了输血医学的发展,失血是战场死亡的主要原因朝鲜战场上90的士兵死于没有及时输血输血的早期实践者之一 白求恩,在二战中战场输血非常普遍,1944年 我国第一个冻干血库中心在昆明建立。1947年 我国第一个医院血库在南京建立。1953年 我国第
3、一个大型中心血库在沈阳建立。,我国输血事业的发端,免疫血液学,免疫血液学（Immunohematology，IH），是一门研究人体血型抗原及抗体，并通过输血前测试血型抗原-抗体反应，找到合适的血液源，从而达到安全输血目的的实验室医学分支学科。,血型抗原,存在于红细胞表面化学结构：蛋白质 蛋白质上的糖类抗原 糖蛋白或脂类（糖脂）,ABO A、BRh(Rhesus)D、C、E、c、eK(Kell)K、k(cellano)Fy(Duffy)Fya、FybJk(Kidd)Jka、JkbLe(Lewis)Lea、LebMNS系统P1,血型抗原系统举例,当某种抗原分子进入不含该决定簇的机体时，刺激机体产生
4、相应抗体的能力免疫原=抗原D抗原：强免疫原Fya抗原：弱免疫原免疫原性的强弱与以下因素有关抗原分子的氨基酸序列(一级结构)及空间构象(二级结构及三、四级结构)红细胞上该抗原分子的表达数量,血型抗原的免疫原性,只识别相对应的红细胞抗原并与之结合与红细胞上相对应的抗原结合后，可引起红细胞的破坏、溶解(溶血反应)两种表现形式“天然抗体”：机体自然产生的抗体 如：抗-A、抗-B（可用于反定型）“免疫性抗体”-“不规则抗体”：经免疫原刺激后而产生的应答性抗体 如：抗-D、抗-K，等等,血型抗体,自身抗体(Auto-antibody)可凝集或致敏机体自身的红细胞，常见于自身免疫性溶血性贫血、药物性溶血性贫
5、血或各种自身免疫病同种抗体(Allo-antibody)可凝集或致敏机体外来的红细胞，常见于各种输血引起的溶血性疾病,血型抗体,免疫性抗体根据应答机制又可分为两大类:,IgM=“完全抗体”=室温下发生发应=如：抗-A、抗-B、抗-M、抗-Lea、抗-P1=大部分的血型分析试剂及“冷”抗体是IgM类抗体IgG=“不完全抗体”=37oC下反应=如：抗-D、抗-K、抗-Jka、抗-Fya，等=几乎所有临床有意义的不规则抗体都是IgG抗体,血型抗体,IgM,IgG,血型抗体模式图,完全抗体可以直接凝集红细胞,IgM分子的跨度可达34nm,不完全抗体不能直接凝集红细胞,IgG分子的跨度仅为14nm,抗-
6、A抗体破坏A型红细胞缩短红细胞寿命破坏红细胞溶血死亡,抗-A抗体,血型抗原-抗体反应,目前所发现的人类最重要的血型抗原系统ABO血型系统的“天然抗体”几乎存在于不含相对应抗原所有人的外周血中“天然抗体”临床上可用于反定型ABO血型系统亚型A：A1、A2、A3、Ax、Am，等B：B2、B3、Bx、Bm，等,ABO血型系统,ABO血型系统,ABO以外重要的血型系统及其抗体,2005年，29个红细胞血型系统274个抗原,除ABO外与输血有关的最重要的血型系统之一最重要的五种抗原C、c、D、E、e根据D抗原是否存在，一般将Rh系统定义为Rh阳性：D抗原阳性Rh阴性：D抗原阴性,Rh血型系统,Rh阴性知
7、多少,15,4,0.4,Rh血型对输血影响有多大？,ABO血型发现后40年才发现Rh血型无数Rh阴性人输了Rh阳性血后无反应,Levine,landsteiner,wiener,输血死亡主要原因分析(美国，1980),免疫血液学能解决什么问题,保证人们用血（输血）,包括血液、血液成分或血液制品的安全、有效。输血是一项广泛应用且十分重要的治疗手段恢复及维持机体的氧(O2)供应治疗临床上严重的失血性疾病 治疗血液系统紊乱性疾病新生儿溶血病的治疗,如何保证输血安全有效,检测献血员和用血者血液中的抗原和抗体，选择抗原，抗体尽可能相容的血液进行输血：红细胞定型血浆（血清）抗体筛查/抗体鉴定，红细胞的直接
8、抗人球蛋白试验和吸收放散试验献血员与受血者之间的交叉配血制备用于输血的成分血 献血员的筛查：肝功能，传染性疾病评价溶血性贫血母婴相容性检测,我国的采供血程序及输血前检测,志愿献血员,血液中心（中心血站）,初检,复检,医院,输血,筛选合格献血员,问卷 快速测试,传染病检测：HBs Ag,HCV,HIV,ALT,Syphilis红细胞定型（正定）,采血,进口或国产试剂,随机检测,输血前检测（1）住院患者血型定型（正定）（2）用血患者血型在此定型（正反定型），（3）交叉配血，抗体筛查，抗体鉴定多数医院输血前不再进行传染病检测,红细胞血型血清学检测技术,盐水凝集法低离子强度盐水法酶技术凝聚胺技术抗人球
9、蛋白检测法柱凝集技术检测法,一、盐水凝集法,红细胞和抗血清在盐水溶液中直接反应特点是操作简便，设备简单，缺点是影响因素多，灵敏度低,孵育30分钟,二、低离子强度盐水法,通过降低介质溶液的离子强度，减少红细胞外围离子云的强度，促进IgG分子在两个红细胞间桥联，而促进凝集特点是缩短抗原抗体反应时间，提高反应灵敏度,孵育1分钟,三、酶技术,利用木瓜酶或菠萝酶破坏红细胞表面唾液酸，使红细胞失去电荷，缩小细胞间距离同时改变红细胞膜表面结构，使某些隐蔽的抗原暴露，从而增强凝集反应主要用于一些不完全抗体的检测,四、凝聚胺技术,利用多聚季胺盐在介质溶液中产生大量正电荷中和红细胞表面的负电荷，减少红细胞间排斥，
10、促进凝集,五、柱凝集技术检测法,是微柱凝集技术与上述所有技术相结合的产物1986年由法国人Dr.Yves Lappierre发明1994年获得美国FDA认证，目前在许多发达国家已经作为常规技术应用于临床,柱凝集技术原理,六、抗人球蛋白试验Coombs试验,在盐水凝集法或低离子强度盐水法的基础上，加入抗人球蛋白抗体，通过抗人球蛋白抗体的特异性桥连作用，促进红细胞的凝集,加入抗人球蛋白试剂后形成肉眼可见的凝集反应,抗人球蛋白实验,抗人球蛋白实验,直接抗人球蛋白实验(DAT)红细胞在体内(in vivo)即被不规则抗体所致敏，因此直接加入抗人球试剂即可进行测定；如某些过敏性药物及引起溶血性输血反应的
11、抗体、自身抗体等间接抗人球蛋白实验(IDAT)红细胞在体外(in vitro)首先被不规则抗体或抗血清试剂所致敏，然后再加入抗人球试剂进行测定；如抗体筛查、抗体鉴定、交叉配血等,抗人球蛋白实验,医院输血科的主要职责,提供临床所需的血液成份提供血型相符或配合的血液为临床提供血型相关的检测诊断,输血前测试流程,常用输血前测试方法,1.平板法-细胞浓度适宜，避免交叉污染，及时观察结果2.试管法-加样顺序，反应条件，洗涤细胞注意事项3.微量板法-加样和振荡避免交叉污染4.柱凝集法-避免假阳性，使用前观察凝胶板,ABO血型鉴定 Rh血型鉴定 红细胞血型抗体筛查/鉴定 交叉配血试验 HDN血型血清学检查,
12、常用输血前检测项目,方法:红细胞凝集试验 正定型 用已知抗-A或抗-B定型试剂来测定红细 胞上有无相应的A抗原或/和B抗原 反定型 用已知A1型细胞和B型细胞来测定血清中 有无相应的抗-A或/和抗-B 正反定型结果不一致或有疑问，需进一步行ABO血型确认试验。,ABO血型鉴定,ABO血型鉴定正常反应结果,Rh血型鉴定,原理:Rh血型系统最常见的抗原主要有C,c,D,E,e 5种。可分别用抗C、抗c、抗D、抗E、抗e这5种Rh 定型试剂通过血凝试验来检查红细胞上是否存 在相应抗原。在临床输血中，一般只做D抗原 的鉴定。凡被检红细胞和抗D试剂凝集者为 RhD阳性，不凝集者为RhD阴性。,检测目的
13、对受血者的血清或血浆做常规的抗体筛查试验，发现有临床意义的不规则抗体。实验方法 让受检的血清/血浆与特殊的试剂红细胞组（已知抗原表型的筛选红细胞）一起反应，以发现样品中可能存在的不规则抗体。,抗体筛查/抗体鉴定,测定结果 反应阳性：抗体存在 反应阴性：抗体不存在抗体鉴定 抗体一旦被检出，应作抗体鉴定,抗体筛查/抗体鉴定,检测目的 分析受者和供者血液是否完全相符反应原理主侧：受者血清/血浆+供者红细胞次侧：受者红细胞+供者血清/血浆,交叉配血,新生儿溶血病血型血清学检查,新生儿溶血病(HDN)是由母婴血型不合引起,胎儿和新生儿红细胞被来自母体的 IgG抗体致敏,并在其自身网状内皮系统受到免疫性破
14、坏。,方法:婴儿及其父母ABO/RH血型鉴定 婴儿及母亲血清中血型抗体鉴定(盐水介质法、酶法、抗球蛋白法等)婴儿红细胞上 血型抗体鉴定(抗球蛋白法、放散试验),新生儿溶血病血型血清学检查,谢谢各位！,强生OCD免疫血液学产品发展历程,1937：Philip B.Hofmann在新泽西创建Ortho公司；1944：Philip Levine博士加入Ortho研究基金会；1947：推出第一个Rh血清凝集试剂及抗人血清；1956：建立、推广全球第一个标准化交叉配血方法及程序；1960：在美国成立了第一家正规的血型技术学院；1968：第一个防止新生儿Rh系统溶血的药物RhoGAM上市；1985：Bio
15、Clone抗人球蛋白试剂及抗A、抗B试剂上市；1992：更简便及标准化操作的柱凝集技术（CAT）血型及交叉配血试剂开发成功；1997：全球第一台全自动血型分析系统AutoVue问世。2000：AutoVue第二代产品AutoVue Innova面世,强生OCD全球最大的免疫血液学产品供应商,强生OCD提供全面的免疫血液学解决方案,手工,自动,Ortho BioVue系统工作站,离心机孵育器工作架移液器,Ortho AutoVue Innova,Ortho AutoVue Ultra,Ortho AutoVue,BioVue 柱凝集系统,BioVue：与血型诊断试剂卡配套的手工工作站AutoVu
16、e Innova：使用血型诊断试剂卡的全自动分析系统,临床检测项目,血型抗原测定(Blood Typing)抗体筛查(Antibody Screening)抗体鉴定(Antibody Identification)交叉配血(Cross Match)抗人球蛋白实验(Anti-Human Globulin Test),Ortho Biovue血型诊断试剂卡,条形码,效期,批号,实验结果,病人ID,试剂卡名称,六个反应柱 合成塑料卡结构 标准微孔板孔间距 条形码识别 锡箔纸封口,试剂成份,微 柱,空气柱,玻璃珠,反应舱,试剂,微 柱,椭圆型设计，较大的结果观测区240l大容量反应舱锥型底部设计以增加
17、灵敏度预装载BioClone试剂及密度梯度稀释液225保存,TOP,FRONT,SIDE,特点：,玻璃珠,球状外形 直径7080um 批间稳定无差异 惰性物质，理化性质稳定 耐受高速离心 功能类似过滤器,密度梯度稀释液,离心力作用,未结合的血清蛋白（低密度）停留在密度梯度稀释液上面 血清与红细胞的混合物（中间密度）在密度梯度稀释液中 红细胞（高密度）移动进入玻璃珠中,反应结果示意图,注：玻璃珠的作用象一个过滤器，可以将凝集的红细胞“阻挡”在玻璃珠上面；未凝集的红细胞则可自由通过玻璃珠而到达柱的底部,阳性反应,阴性反应,结果判读,Ortho BioVue 试剂卡操作示意图,加样,离心,孵育,读卡,
