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1、1,无菌工艺验证 培养基灌封试验,吴军 2011.2,2,目录,主题1：为什么要进行培养基灌装验证？主题2：相关GMP法规对培养基灌装验证的要求主题3：培养基灌封实验的常规要求主题4：特殊剂型的培养基灌装验证方法主题5：培养基灌装验证设计、执行与文件编制主题6：培养基灌装验证的关键点分析主题7：培养基灌装验证检查要点,3,主题1：为什么要进行培养基灌装验证？,4,为什么需要进行培养基灌封试验？,5,几个概念,无菌状态Asepsis(FDA指南)：通过使用无菌工作区及防止暴露的无菌产品受到微生物污染的方式进行操作所达到的一种控制状态 无菌工艺Aseptic processing(PDA TR22
2、)：在对空气、物料、设备、人员进行微生物和颗粒物污染严格控制的环境下，对无菌物料进行加工。无菌灌装Aseptic filling(PDA TR22)：将预先灭菌的产品灌和/或装入无菌容器中并密封，属于无菌工艺的一个组成部分。关键区Critical area(PDA TR44)：通过设计使产品、容器、封装件和设备能够保持无菌性的一个区域。,6,概况,洗瓶机,干热隧道,隔离柜,冻干机,轧盖机,转移瓶塞,灌装机,容器,7,来自生产工艺的要求,对产品进行最终灭菌，是降低微生物污染风险的常用办法。但有大量药品不适用于最终灭菌而只能采用无菌生产工艺方法。无菌生产工艺是制药领域中最难的工艺之一，确保产品无菌
3、是该工艺最大的难点。减少无菌工艺药品污染风险的两项重要措施,人员培训无菌工艺验证,8,最终灭菌工艺与无菌生产工艺的差异,最终灭菌工艺在高洁净净环境下进行灌装和密封通常，产品、容器和密封件的微生物污染水平很低在密封容器中进行最终灭菌无菌生产工艺产品、容器和密封件分别进行灭菌，然后进行灌封在极高洁净环境下进行灌装和密封产品在最终容器中不再做进一步的灭菌处理对各个组成部分的灭菌工艺需要进行严格验证和监控在灌封前和灌封过程中的操作会带来污染风险,空瓶,灭菌隧道,密封件,蒸汽灭菌釜,除菌过滤,人员,半压塞瓶,冻干机,全压塞瓶,9,无菌生产系统,9,10,ISPE：无菌设施设计规范P16,11,USP注射
4、剂无菌测试结果,试验目的：不合格的可能性(%)试验批量：60,000支试验方法：按美国药典无菌测试方法,12,无菌工艺产品的无菌保证,无菌工艺产品,Personnel,Environment,工艺验证,人员,原料,环境,无菌检验,13,注射剂生产的风险分析,内源性的影响因素系统设备工艺过程物料和中间体的质量外源性的影响因素人员,14,作业环节与风险,15,厂房/房间,人员,无菌工艺 生产线,工艺 人流 物流 布局,HVAC/公用工程*,日常无菌保证,培养基灌装,QA/QC,消毒操作,偏差&环境控制趋势,Richard L.Friedman,M.S.药物评价及研究中心 法规办公室，美国FDA,*
5、包括设计及维护,16,为什么要进行无菌工艺验证,证明采用无菌工艺生产无菌产品的能力无菌工艺人员资格和保证符合现行的GMP要求,17,无菌工艺的意义,无菌工艺试验仅证明无菌工艺系统（环境、设备、程序和人员）能力在某一个时间点的表现。并不保证生产程序在同一个生产线不同时间段表现出相同的微生物质量水平。通过控制和验证所以的相关工艺，如环境监测、人员确认和清洁、灭菌程序的验证，维持工艺模拟验证时的无菌水平。,18,主题2：相关GMP法规对培养基灌装验证的要求,19,来自FDA和USP的要求,FDA CGMP 无菌工艺药品指南（2004年版）An aseptic processing operation
6、 should be validated using a microbiological growth medium in place of the product.This process simulation,also known as a media fill.USP 31 洁净室和其它控制环境的微生物学评价 To assure that minimal bioburden is achieved,additional information on the evaluation of the microbiological status of the controlled environ
7、ment can be obtained by the use of media fills.An acceptable media fill shows that a successful simulated product run can be conducted on the manufacturing line at that point in time.,20,来自EU GMP和国内的要求,EU GMP 附件1 无菌药品的生产（2008年2月新版）Validation of aseptic processing should include a process simulation
8、test using a nutrient medium(media fill).中国药品生产质量管理规范附录（1998年修订）SFDA 化学药品注射剂基本技术要求（试行）培养基灌装验证是对设备、环境以及人员操作的一种系统验证,是判断无菌保证水平的关键手段 采用无菌生产工艺的粉针剂，应能保证SAL不大于10-3,21,附录一：无菌制剂,第四十七条 无菌生产工艺的验证应包括培养基模拟灌装试验。应根据产品的剂型以及培养基的选择性、澄清度、浓度和灭菌的适用性选择培养基。应尽可能模拟常规的无菌生产工艺，包括所有对产品的无菌特性有影响的关键操作，及生产中可能出现的各种干预和最差条件。培养基模拟灌装试验的
9、首次验证，每班次应连续进行3次合格的试验。空气净化系统、设备、生产工艺及人员重大变更后，应重复进行培养基模拟灌装试验。培养基模拟灌装试验通常应按生产工艺每班次半年进行1次，每次至少一批。,22,培养基灌装容器的数量应足以保证评价的有效性。批量较小的产品，培养基灌装的数量应至少等于产品的批量。培养基模拟灌装试验的目标是零污染，应遵循以下要求：（1）灌装数量少于5000支时，不得检出污染品；（2）灌装数量在5000至10000支时：1.有1支污染，需调查，可考虑重复试验；2.有2支污染，需调查后，进行再验证。（3)灌装数量超过10000支时：1.有1支污染，需调查；2.有2支污染，需调查后，进行再
10、验证。（4）发生任何微生物污染时，均应进行调查。,23,主题3：培养基灌封实验的常规要求,24,定义与目的,目的证明生产线采用无菌工艺生产无菌产品的能力对人员进行资格确认符合GMP的要求,使用培养基模拟药品进行无菌灌封，对无菌工艺进行验证。又称为“工艺模拟试验”.,25,工艺模拟试验的通常流程,将培养基暴露于设备、容器胶塞密封系统的表面和关键环境条件中，并模拟实际生产完成工艺操作。,对装有培养基的密闭容器进行培养以检查微生物的生长。,评价结果，确定实际生产中（如灌装前的调试、加入无菌原辅材料、无菌连接、灌装和密封）产品污染的可能性。,26,工艺模拟的过程,从灭菌开始到完全灌装结束的全过程。如处
11、方混合阶段采用的无菌过程必须作为验证的一部分。配制后除菌、原液的保存。如取样、保存时间、物料的循环等操作。灌装操作。如容器、设备的CIP和SIP；设备依照设定的速度和包装规格包装容器等，正常与异常干扰等。冻干工艺过程,27,模拟条件-最差条件,最差条件的目的是有意对工艺、系统、设备在更高的挑战条件下进行验证。使用的原料、组件和密封在无菌工艺区域保存时间超出控制要求；增加灌装人员的数量，超过正常灌装生产所需的人员数量；在工艺模拟实验中使用促生长培养基，而不是使用有抑制性或保护性的处方。HACCP、FEMA、FAT方法确定最差条件,28,培养基灌封试验的时机：初始验证与再验证,初始验证需要重复多次
12、，以确保结果的一致性和有效性。,有差异的多次实验结果,工艺过程失控的象征,定期再验证定期进行，评估无菌工艺的受控情况。应综合考虑每一班次及班次变化过程中有代表性的活动及干预。对人员的资格再确认应纳入到定期再验证中。,29,培养基灌封试验的时机：增补性培养基灌封试验,变更及其评估对产品或生产线的每一种变更，均应根据书面的变更控制系统进行评估。如果通过评估认为此项变更会影响到无菌生产工艺产品的无菌保证水平，则需要进行增补性培养基灌封实验。比如，设施或设备的变化、生产线配置的变动、人员重要变动、环境监控结果异常、容器-胶塞系统变更、停车时间延长、无菌检查结果阳性等。,30,实验用培养基和培养温度的选
13、择,选择时的注意事项适应广谱微生物生长，包括细菌和真菌较好的澄明度，较小的粘度易于除菌过滤常用培养基：3大豆胰蛋白肉汤（TSB）厌氧培养基仅在特殊情况下使用培养温度FDA-20-35，目标值2.5，不少于14天；如选择两个温度，则每一温度下至少培养7天，从低温开始。PIC-20-25下至少14天，或，先20-25下7天，然后30-35下7天。,31,培养基的选择试验,培养基的配制和灭菌培养基验证分装到若干数量的无菌小瓶或试管制备三种微生物（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的混悬液，菌液浓度控制在100-1000个菌/ml分别加入菌悬液各0.1ml,每份至少2瓶（支）培养：30-35（枯
14、草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）20-25（白色念珠菌）观察：如果在7天内，每种微生物培养据至少有50%长菌，则可认为培养基可用于无菌工艺验证。,32,灌装体积与数量,灌装体积每只容器的灌装体积不少于总容积的1/3同样，灌装体积也不宜过大既要考虑到瓶倒转或旋转时，培养基能充分接触到容器和密封件的内表面，又要保证容器内有足够的氧气支持微生物生长。灌封数量综合考虑统计学要求和实际生产批量。FDA(5000瓶)：如果正常生产的批次量低于5000瓶，则培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。PIC(3000瓶)：如果正常生产的批次量低于3000瓶，则培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。,33,灌封
15、时间与批次量控制,灌装时间对于初始性验证，培养基灌封实验应安排在一周内的不同时间进行。对于再验证，可选择在一周结束或其它最差条件下进行。灌封时间要涵盖实际生产班次。批次量控制初次验证，至少要连续成功灌封3个批次。再验证至少需要成功灌封1个批次。,34,培养基灌封实验的合格标准,FDA指南（2004版）与EU GMP 附件1标准统一灌封量10000瓶时，若有1瓶污染，需彻底调查；若有两瓶污染，必须进行彻底调查，并重新验证（3批）。注：欧盟标准将自2009年3月起执行。,35,培养基灌封实验的合格标准,2009年3月以前欧盟通用标准：污染率低于0.1%计算公式：实际污染率=(95%置信限值)/(灌
16、封容器数)100%,污染瓶数与95%置信限值间的关系,36,培养基灌封实验的合格标准,SFDA 化学药品注射剂基本技术要求（试行）,培养基灌装试验的批量与判断合格的标准,37,主题4:特殊剂型的培养基灌装验证方法,38,冻干制剂对培养基灌封的要求,冻干制剂的典型生产流程配制灌装冻干加塞轧盖,第一种方式，模拟装载/卸载过程，缩短放置时间（首选）容器内灌封好培养基，以半压塞状态装入冻干机冻干机内部分抽真空（500mbar），在室温放置一定的时间，不得冷冻。用无菌空气破真空（不使用惰性气体），全压塞轧盖 缺点:真空度不能过高，不能照成培养基沸腾。注意，若所使用的容器透明度不高，应将内容物倒出进行检查
17、。,冻干制剂培养基灌封试验的特殊性对产品在冻干机内放置步骤的模拟,39,冻干制剂对培养基灌封的要求,第二种方式，模拟冻干时间半压塞产品在冻干机腔室内的放置时间同于正常工艺。缺点：耗时长,第三种方式，以经稀释的培养基模拟冻干过程容器内灌封好经稀释的培养基（diluted medium），以半压塞状态装入冻干机模拟冻干过程，直到容器内的培养基大致达到正常浓度（full strength）为止。缺点：耗时长，需开发特殊的冻干程序，营养支持性不均一，影响微生物的存活力。,40,粉针剂对培养基灌封的要求,第一种方法在灌装线上直接灌装液体培养基，灌装后压塞-轧盖或熔封。第二种方法先灌装干粉培养基，再加入注
18、射用水第三种方法先灌装惰性剂，再加入液体培养基要点采用第二、三种方法时，所用惰性剂或干粉培养基需事先经过辐射灭菌。常用惰性剂有聚乙二醇8000、羧甲基纤维素、乳糖。,41,混悬剂/半固体制剂对培养基灌封的要求,悬浮剂需要模拟搅拌或循环流动的过程。如果有无菌添加过程，也应进行模拟。半固体制剂需要将液体培养基增稠到适当粘度。可选用琼脂或羧甲基纤维素作为增稠剂，也可选用其它试剂，但要证明其没有抑制细菌或真菌的作用。在培养结束后，需将培养基从塑料或金属管中挤出检查其混浊度和真菌菌落，也可进行无菌检查实验。如果选择显色培养基遇到污染物变色的方法，则需要对其进行验证。,42,主题5：培养基灌装验证设计、执
19、行与文件编制,43,制订培养基灌封实验方案的考虑因素（一）,生产线最长运行时间及其造成的相关风险干预的次数、类型和复杂程度是否有冻干工序设备的无菌装配总人数和所从事的操作无菌加入和无菌转移的次数班次更换、暂停和必要的更衣无菌设备的拆卸与连接环境监测,44,制订培养基灌封实验方案的考虑因素（二）,生产线的配置和运行速度产品重量检查容器/密封系统与无菌操作相关的各种特殊规定总人数和所从事的操作,总的原则综合考虑生产线可能造成污染的各种因素 尽可能模拟实际生产的无菌操作 可能时，应包括最差条件的模拟测试,45,验证开始前的准备工作,设备确认通风系统（HVAC）的确认设备的在线清洗和灭菌CIP,SIP
20、灭（除）菌工艺验证湿热、干热灭菌工艺除菌过滤空气过滤器的完好性检测容器/胶塞密封完好性测试人员培训洁净室环境达到设计要求,46,培养基灌封实验方案的内容举例,定义被模拟的工艺定义使用的房间，灌封线和设备使用的容器和密封件的类型灌装线的速度灌封数量模拟过程中的干扰和中断的数目和类型参与的人员数目使用的培养基,灌封到容器内培养基的体积选择的最差条件及其原理培养条件，培养温度，培养时间所进行的环境监测批记录复印件职责说明所有工作的合格标准列举最终报告中需要的文件本次模拟的持续时间,47,方案的执行与记录（一）,培养基灌封的日期和时间使用的房间和设备容器胶塞的型号和尺寸培养基种类和灭菌方式每容器中的灌
21、装体积灌装速度灌封的瓶数，灯检丢弃的瓶数和原因培养的瓶数，阳性的数量培养时间和温度,48,方案的执行与记录（二）,环境监测的数据参与培养基灌封的人员培养基灵敏度检查的结果有无阳性结果。如有，要给出微生物鉴定的结果。如发生异常情况，需给出调查报告。,49,培养基灌封实验中的环境监测,环境监测按照相应的规程进行，包括：空气粒子数沉降碟浮游菌表面监测人员监测对无菌生产区环境的评估,50,培养基灌封实验中的灵敏度检查实验,培养基灵敏度检查实验：使用完成14天培养的灌封前期培养基样品用枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉和环境菌作为阳性菌将每个菌种准备含100cfu/0.1m
22、l的菌液，每个菌种接种2支培养基样品，同时并平板计数（双份）对真菌在20-25C下培养，对细菌在30-35 C下培养，每天检查，5天内需有生长迹象,51,再验证与增补性验证的要求,再验证对每条生产线，每年进行两次再验证，间隔时间为5-7个月。人员至少每年参加一次再验证，以进行资格再确认。每条生产线轮流使用最大和最小规格的容器，变换生产线的速度。增补性验证根据风险程度决定培养基灌封实验的批数。通常为1-3批。,52,培养基灌封实验的总结报告,最终报告中应包括以下内容模拟的最差条件事件清单环境监测结果微生物鉴别结果培养基的营养检查实验结果培养条件、结果读取日、结果读取人、每位参与者的灌装瓶数等信息
23、。结论（结果是否可以接受）合格证书工艺验证/再验证合格证书人员资格确认证书,53,培养基灌封实验阳性结果的调查(一),调查的范围应包括环境微生物监测数据，空气悬浮粒子监测数据CIP设备，清洁、消毒程序的执行情况培养基、设备和零件的灭菌工艺，灭菌釜的校正情况高效过滤器检测(空气悬浮粒子水平，过滤器检漏，风速测量，密封系统检查，使用年限等)除菌过滤器完好性房间气流型式与压差人员操作技术培训情况,54,培养基灌封实验阳性结果的调查(二),调查的范围还应包括以往产品无菌检查实验结果人员卫生状况监测数据培养基灌装实验中的干预方式分析该区域近期是否有过维修活动，生产线的改造情况该生产线培养基灌封实验历史数
24、据已灭菌物品的储存条件培养基灌封过程中的异常事件阳性污染菌与环境监测污染菌的鉴别,55,培养基灌封实验阳性结果的调查(三),调查结论与风险评估培养基灌封实验结果有效暂停生产，直至确定污染来源并采取有效的纠偏措施。再验证合格后，产品方可放行。对培养基灌封实验后和此前所生产的产品，进行风险评估培养基灌封实验结果无效重新进行培养基灌封实验条件1无菌灌装区的物理条件不满足要求条件2人员未按照正常生产程序操作,56,污染 率,灌装过程(时间或灌装量),在灌装过程中污染率上升,这表明污染可能来源于液体培养基(如与培养基贮罐非无菌连接，在循环管路中受到污染)。很重要的是，在灌装结束后，保持培养基贮罐处于无菌
25、状态，当等到培养基灌装结果时，可以核实这样的假设。,57,污染率,灌装过程(时间或灌装量),在灌装过程中污染率下降,这表明污染发生于生产设备中（胶塞容器/轨道,计量泵/针头)，在灌装过程中污染被部分或全部“清洗掉”。,58,污染率,灌装过程(时间或灌装量),在灌装过程中污染率出现尖峰,一个尖峰（在短时段的一些产品被污染）可能与在灌装过程中不正确操作导致的关键失误有关。对于这个原因，很关键的是必须知道被污染产品灌装的准确时间，以及当时实施的干预措施（灌装操作过程的录像是非常有用的）,59,污染率,灌装过程(时间或灌装量),污染率出现尖峰后，呈上升趋势,与前面的例子相同，但如果错误的干预措施能够影
26、响到液体的管路/回路时（如培养基贮罐的变化，泵或针的替换）,60,污染率,灌装过程(时间或灌装量),孤立事件(试验中少数污染),不幸的是，这些现象是最普通的，也是最难调查的。如果这种现象在多次试验中反复出现，可能说明这个工艺存在“环境噪声”，所以需要根本的措施（如 更衣/着装、消毒剂和气流模式的改变),61,主题6：培养基灌装验证的关键点分析,62,培养基灌封后的生产,培养基灌封后可以进行生产，但要等培养基灌封合格后产品才能放行（产品有报废的风险）。无效的培养基灌封后可以进行生产，但所生产的批次要在成功培养基灌封后方可放行。培养基灌封失败 生产线不能用来生产，根据调查结果决定培养基灌封的次数和
27、数量，培养基灌封合格后，才能生产。,63,讨论：最差条件 Worst Case,最差条件高于或低于正常范围的条件限度，与正常生产条件相比最有可能造成工艺或生产失败的条件。注意如果某些做法会带来污染的风险，则不允许用培养基灌封的结果为它的不合理的进行辩护,64,最差条件的设计（1）,储存时间Holding time灌封设备、灌封部件、储罐、无菌物料、药液在实际灌封前能够放置的最长时间1.灌封设备、灌封部件、储罐、无菌物料需要再灭菌（除菌）的时间间隔Worst case:用超出保存时间的灌封设备、灌封部件、储罐、无菌物料参与培养基灌封2.产品从无菌过滤到灌封加塞完成所需要的时间Worst case
28、：无菌过滤后存放在储罐内的培养基模拟实际生产时产品的最大储存时间后再灌封产品在灌装后的储存时间应在培养基灌封中验证,65,最差条件的设计（2）,灌封的持续时间Duration of runs最保守的设计：在培养基灌封试验中，模拟用时最长的瓶子满批量生产所需要的时间，其中包括正常的干扰时间（换班、设备维修）。其他的设计：1.在生产完成后接着进行培养基灌封实验2.为了减少灌封瓶数，在每批实验刚开始及结束前均灌装培养基，中间空运行灌封机以达到所需要的时间在任何情况下模拟了与实际生产不相同的情况，都要有记录，并解释原因在正常生产过程中所需的最长时间，包括可能发生的事件，人员的换班等，应予以模拟,66,
29、最差条件的设计（3）,灌封数量灌封数量没必要总是满批量惯例：小批量，至少要满批量 大批量，一般至少5000瓶在模拟无菌生产时间时会超过5000瓶,67,最差条件的设计（4）,灌封速度与瓶子规格灌封速度和瓶子规格的关系最慢的速度，最大的瓶子规格最小的瓶子规格，最快的速度,68,最差条件的设计（5）,人员培养基灌封时模拟无菌区可能容纳最多的人数无菌区工作人员至少每年参与一次培养基灌封不是每个人员都要参与最差条件的模拟看，不是参与,69,最差条件的设计（6）,设备装配动作多对灌封区环境产生直接影响,70,最差条件的设计（7）,干预正常的（灌封线装配，称量调节，加胶塞，处理倒瓶，取样，环境监测）非正常
30、的（设备故障，灌封线堵塞，轨道调节，拆卸/替换破损的部件）SOP中应列出哪些干扰是容许的，非正常的干扰至少每年模拟一次干扰的次数应该等于正常生产时发生的次数不应挑战干扰而应避免干扰,71,综合理解,培养基灌封实验的条件应充分体现生产操作的实际情况采取特别的生产控制和预防措施，或在环境条件特别好时进行工艺模拟，会造成良好工艺条件的假象。选取SOP范围内的苛刻条件，能证明其有效性挑战条件不是人为的创造特别环境缺陷样品的处理有密封性缺陷的样品应在培养前剔除。对培养过程中发现损坏的样品处理。培养基灌封实验中断续出现微生物污染，是无菌生产线呈现不良趋势的征兆。,72,无菌工艺验证的CAPA,增加培养基的
31、灌装数量和环境监测数据已查明污染源；加强无菌生产环境的洁净和消毒措施；增加灌装前静态下的环境监测数据以检查无菌环境条件下的可靠性；用培养基中污染菌对消毒剂进行挑战性实验，以检查污染菌是否对消毒剂有耐受性；分别于灌装前、灌装时及灌装后，增加对操作人员的卫生监控；增加培养基的灌装批次，以检查所出现的偏差是否具有偶然性。,73,主题7：培养基灌装验证检查要点,74,检查项目,无菌灌装的基本信息产品类型、剂型正常生产批量与批量变化生产设备与灌装线培养基的选择验证的频率培养基灌装的数量,无菌灌装验证设计灌装设计的依据验证条件生产线与人员速度包装容器规格恶劣条件的设计验证时机验证灌装时间设计正常干扰与非正常干扰多班生产,75,检查项目,培养基控制培养基选择（类型与浓度）培养基配制与除菌工艺培养基生长性检验,特殊产品的培养基工艺验证冻干制剂冻干过程的模拟粉针制剂固体培养基的选择培养基的灌装过程,76,检查项目,验证结果的控制灌装的数量与灌装过程中不合格样品的处理培养基的培养温度与观察记录观察的标准不合格的调查与结论,77,谢谢,我的联系方式：电话：139 8087 6901Email：QQ:732 050 423,
