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1、第二章 氨基酸与蛋白质的一级结构（5学时）,第一节：氨基酸，2学时第二节：氨基酸的分离分析，0.5学时第三节：肽及其性质，0.5学时第四节：蛋白的分离，0.5学时第五节：一级结构测定，1.5学时,蛋白质种类与功能的多样性 1010-1012,结构蛋白,贮藏蛋白,收缩蛋白,转运蛋白,第一节 氨基酸,180多种天然AA，大多数是不参与蛋白质组成的。这些AA被称为非蛋白质AA。参与蛋白质组成的AA为蛋白质AA，常见的只有20种 基本氨基酸，标准氨基酸 表达方式：三字母或单字母的简写符号,（一）-氨基酸的结构通式,除脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。,各种氨基酸的区别在于侧链R基的不同。,-氨基酸,可
2、变部分,不变部分,一、基本氨基酸,(二)常见的标准AA20种,1,按侧链R基的化学结构，分为三类脂肪族氨基酸15种C2:1 C3:3 C4:3 C5:4 C6:4芳香族氨基酸3种杂环族氨基酸2种,脂肪族氨基酸,芳香族氨基酸3种,杂 环 族 氨 基 酸,Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Tyr,Trp,Cys,Met,S,S,氨基酸的R基大小,2，根据酸碱性分类:酸性氨基酸:2 个COOH、1个-NH2 Asp，Glu 碱性氨基酸:1 个COOH、2个碱性基团（氨基、胍基、咪唑基）Arg，Lys，His 中性氨基酸:1 个COOH、1个-NH2,3，按R基的极性性质,分为4类：非极
3、性氨基酸：9 极性不解离：6极性氨基酸 解离带负电荷：2酸性 极性解离 解离带正电荷：3碱性,POLAR,NON-POLAR,Tyr,His,Gly,酸性,中性,Basic,Asp,Glu,Gln,Cys,Asn,Ser,Thr,Lys,Arg,Ala,Val,Ile,Leu,Met,Phe,Trp,Pro,氨基酸的极性分类,极性或非极性，是影响蛋白质结构与性质的关键。,有大有小,有正有负,有极性非极性,形形色色的氨基酸側基,特殊氨基酸,含硫氨基酸含羟基氨基酸-C带分支氨基酸二羧基一氨基氨基酸二氨基一羧基氨基酸亚氨基酸,二、非标准氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为非标准氨
4、基酸。由相应的基本氨基酸衍生而来的。,三、氨基酸的旋光性和构型,*,手性C；手性分子；有两种不同的排布方式，对应D，L两种构型。旋光方向不同。左或右旋。旋光仪测定。,20 种天然氨基酸除甘氨酸外，都带一个不对称碳原子碳原子，都有光学异构体（镜映体）。已知 19 种天然氨基酸均为 L型氨基酸。比旋光度D25(单位浓度、单位长度下的旋光度，/c*l)是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。,四 氨基酸的酸碱性质,一）氨基酸的兼性离子形式：氨基酸的两个重要性质：氨基酸晶体的熔点高（200C）；氨基酸使水的介电常数增高。,AA是两性电解质,COOH,NH2 H+,酸性环境,中性环境,碱
5、性环境,+1,-1,0,等电点,6.0,等电点pI：所带净电荷为零。电场中不移动。,此氨基酸在 pH 2 或 9 附近，有缓冲作用。,赖氨酸的解离及等电点计算,H,A2+,A+,A0,A-,等电点(isoelectric point,pI)：分子呈电中性时溶液的pH值。为兼性离子两侧解离基团的算术平均值。中性氨基酸：酸性和碱性基团的算术平均值：pI=(pK-COO-+pK-NH2)/2，pI6 酸性氨基酸：两个酸性解离基团的算术平均值pI=(pK-COO-+pKR-COO-)/2，pI2碱性氨基酸：两个酸性解离基团的算术平均值pI=(pK-NH2+pKR-NH2)/2，pI7,不同pH值时所带
6、电荷,pH=pI 氨基酸呈电中性，电泳不移动 pHpI 氨基酸带负电荷，向阳极移动 在一定pH范围中，溶液的pH离AA等电点愈远，AA带净电荷愈多，泳动速度越快。,补充：化学性质,亚硝酸反应烃基化反应酰化反应脱氨基反应西佛碱反应,成盐成酯反应成酰氯反应脱羧基反应叠氮反应,侧链反应,茚三酮反应成 肽 反 应,除Pro生成黄色化合物外,其它AA生成蓝紫色化合物（570nm）;,与茚三酮反应(28),用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。,茚三酮,水合茚三酮,补充：特征光吸收,在近紫外区(200-400nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max275nm，苯丙氨酸的max257n
7、m色氨酸的max280nm,补充：含氮量稳定,氨基酸的结构通式为氨基酸。蛋白质除含C,H,O外，还含有N。AA平均分子量为110。不同蛋白的含氮量皆在16%左右。只需测定N含量，N含量/16%即为蛋白含量。-凯氏定氮法的理论基础,第二节、氨基酸的分离分析,根据R基的极性。原理：分配层析。滤纸层析：薄层层析：根据氨基酸的净电荷及R基的极性：离子交换层析：阴离子交换树脂-N(CH3)3OH，阳离子交换树脂-SO3H根据氨基酸的净电荷及质点大小：电泳：,分配层析的一般原理,层析法色层分析法（色谱）系统的组成固定相（静相）流动相（动相）分配定律当溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定的温度下达
8、到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数.此比值即分配系数（kd）。,一）纸层析,固定相：纤维素上吸附的水流动相：展层溶剂，有机相层析时，混合AA在两相中不断分配，疏水性强的AA在固定相水中溶解度较小，与水的作用力也较小，随展层剂的展层（移动）也移动较远距离（迁移率Rf大）。极性强的Rf值小，疏水性强的Rf大。分离、鉴定AA混合物的方法。,将下列每组混合物分别用正丁醇-醋酸-水进行纸层析，指出每组的相对迁移率。(1)Val和Lys;(2)Phe和Ser;(3)Leu、Ala、Ser,第三节 肽（peptide）,一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称
9、为肽。,一、肽、肽键与肽链,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由几个到几十个氨基酸组成的肽称为寡肽，由更多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成肽链的氨基酸单元称为氨基酸残基。,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。方向性：一条多肽链有两个末端，自由-氨基，称为氨基端或N-端；游离-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序：N-端C-端如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Glu 丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酸,肽单位,主链：,侧链,二、肽的理化性质,熔点高。这说明它和氨基酸一样，是以偶极离子形式形成离子晶格而存在的。2.具有酸碱两性性质和等电点。肽的酸碱性质
10、主要来自游离末端-NH2和游离末端-COOH以及侧链R上可解离的基团。每一种肽都有其相应的等电点。末端-NH2,-COOH比游离氨基酸的酸碱度降低。,3.具有旋光性。这是由于肽中有不对称C原子存在。4.具双缩脲颜色反应（三肽以上）。双缩脲（H2N-CO-NH-CO-NH2）是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物。肽和蛋白特有，氨基酸无。一般含有两个或两个以上肽键的化合物与CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物。用途：测定肽或蛋白质含量。,三、天然存在的重要多肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存
11、在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。部分肽中含有D-氨基酸。,CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH,CH2,CH2,CHNH2,COOH,CH2,SH,GSH+GSH-GSSG,第四节、蛋白的分离,根据：所要提取的蛋白（目的蛋白）与其它蛋白（杂蛋白）的不同进行分离。溶解度不同:反相柱层析；盐析 分子量不同:透析；凝胶过滤法 所带电荷不同:电泳；离子交换层析 特有的亲和力：亲和层析,一）盐析法：溶解度不同,不同的蛋白质溶解度不同。且溶解度随外界条件如盐浓度，pH值，温度等而变。,盐对蛋白质浓度的影响,盐溶 Sa
12、lting-in:加少量盐使蛋白质溶解度变大 盐析 Salting-out:加大量盐使蛋白质由溶液中沉淀出來,蛋白质溶解度和pH值及盐浓度有关,0.001,0.005,0.01,0.02,NaCl(mol/L),pI,4.8 5.0 5.2 5.4 5.6pH,溶解度,蛋白的稳定因素：（1）带电层（2）水化层,加入少量盐：增加带电层，促进溶解。-盐溶,Aggregate,蛋白质分子表面的疏水性区域，聚集許多水分子，当加入盐时，這些水分子被抽出，暴露出來的疏水性区域互相结合，形成沉淀。,盐析 Salting-out：,Ammoniumsulfate,Sodiumsulfate,A little
13、salting-in effect,不同蛋白的溶解度曲线,硫酸铵分级沉淀,二）凝胶过滤法：分子量不同,又称为分子筛层析。依蛋白质分子量的差异，通过具有分子筛性质的凝胶而分离。葡聚糖凝胶G10-G200琼脂糖凝胶2B,4B,6B聚丙烯酰胺凝胶S100S600,凝胶颗粒,小分子进入凝胶分子内，被滞留,大分子在凝胶颗粒间移动，较快流出,溶剂流动方向,按分子量从大到小依次流出,问 题：已知下列蛋白的分子量。问以凝胶过滤法洗脱时蛋白质的洗脱顺序如何？（凝胶分级范围为5000400，000）,三）亲和层析法：特定亲和力,如两分子间有专一性亲和力（特别的结合和识别能力，具有针对性），以其中一种作为“鱼饵”，
14、可把另外一种“钓”出来。其它蛋白不被吸引而结合不上。,亲和层析法的作用机理：,固相载体,(1),(2),(3),A,B,Sample,Washing,Elution,四）蛋白电泳,在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质有各自的等电点。在非等电点时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷。蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v）取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f，即颗粒大小及形状)。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质中的氨基酸残基按大约1 2比例结合，使蛋白以一条无构型的长条分子存在，
15、且分子表面均匀结合一层负的SDS的电荷，蛋白质分子原有电荷间的差别则可以忽略。用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。,第五节 蛋白质一级结构的测定,一、蛋白质结构概述二、一级结构测定方法三、同源蛋白质及结构进化四、镰刀型血红蛋白分子病,一级结构,一、蛋白质的结构层次,四级结构,二级结构,三级结构,氨基酸,二、蛋白一级结构测定,定义 1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。前提：样品均一、纯度97%以上、已知分子量,F.Sanger(1953,Cambridge U)Insulin 胰岛素
16、(A,B chains),以传统氨基酸定序法决定蛋白质序列,B-chain,A-chain,一级结构(Primary structure),如何定出一级结构：蛋白质的氨基酸顺序,(1)直接测定氨基酸测序：Edman degradationF.Sanger(Cambridge U.)Insulin 胰島素(A,B chains),(2)由 cDNA 序列反推氨基酸序列：,一）、Edman degradation降解法测定氨基酸顺序的一般测定步骤,（1）测定多肽链的数目，拆分多肽链，分析多肽链的N末端和C末端残基（2）断裂多肽链内、间的二硫键（3）测定每条多肽链的AA组成（4）多肽链断裂成小肽段（
17、5）测定各个肽段的AA顺序（6）确定肽段在多肽链中的次序（7）确定原多肽链中二硫键的位置,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-肽）。酸解，得黄色DNP-氨基酸，用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,（一）N末端分析法,二硝基氟苯（DNFB）法,是游离氨基酸、多肽及蛋白共有的一个反应,用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸.,DNS+,AA 多肽 蛋白,弱碱,DNS-,AA 多肽 蛋白,酸,DNS-AA+游离AA,（乙醚抽提，有荧光）,丹磺酰氯法,(二)二硫键的断裂,在可用8mol/L尿素或6m
18、ol/L盐酸胍（使蛋白变性，亚基分开）存在下，使用过量的-巯基乙醇，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,(三)氨基酸组成的分析：酸，碱解后氨基酸分析仪测定,（四）多肽链的部分水解,1、酶裂解法 胰蛋白酶蛋白水解酶（蛋白酶）：糜蛋白酶（肽链内切酶）嗜热菌蛋白酶胃蛋白酶,Trypsin：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。,水解位点,1)胰蛋白酶,2)糜蛋白酶,专一性胰蛋白酶断裂Phe,Trp,Tyr等芳香族AA的羧基所形成的肽键断裂键邻近的基团 碱性：裂解能力 酸性：裂解能力,3）胃蛋白酶,专一性糜蛋白酶要求被断裂键两侧的残基都是
19、疏水性AA如phe-Phe最适pH2。可用来确定二硫键的位置。,2、化学法：(Cyanogen bromide),溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,五）氨基酸序列的测定,1、Edman化学降解法Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸.亦称Edman反应,弱碱,AAPITC+多肽 蛋白,AAPTC多肽 蛋白,无水甲酸或HF,PTH-AA+少一个AA的多肽或蛋白,（乙酸乙酯抽提）,苯异硫氰酸酯（PITC）法：,此反应可
20、循环进行 进行n轮反应，可测出n个残基顺序一次：6070个残基的肽段顺序,(六)肽段的次序重叠肽法,采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,示例(十肽的水解),A法水解得到四个小肽：A1 Ala-Phe A2 Gly-Lys-Asn-Tyr A3 Arg-Tyr A4 His-ValB法水解得到三个小肽：B1 Ala-Phe-Gly-Lys B2 Asn-Tyr-Arg B3 Tyr-His-Val,三、蛋白质与生物进化,（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化 1、同源蛋白
21、质在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。同源蛋白质含有不变残基和可变残基。2、细胞色素C 细胞色素C是真核细胞线粒体内膜上一种含Fe的蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。作用：传递电子，即Fe3+e-Fe2+,血红素结合部位,酶结合部位,一条链(104Aa)+铁卟啉 Fe3+e-Fe2+,通过植物、动物和微生物等数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明：（1）亲缘关系越近，AA顺序的同源性越大。不同生物与人的细胞色素C相比较AA差异数目 黑猩猩 0 鸡、火鸡 13 牛猪羊 10 海龟 15 狗驴 11 小麦 35 粗糙链孢霉43 酵母菌 44（2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞
22、色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处，即保守顺序不变。,3、系统树说明物种之间进化关系的图解,五、血红蛋白分子病（54）,分子病指蛋白质分子中由于AA排列顺序与正常蛋白质不同而发生的一种遗传病(基因突变造成的)。镰刀状细胞贫血病：病人体内血红细胞的量及红蛋白的含量都较正常人少，且红细胞的形状为新月形，即镰刀状。病因：血红蛋白AA顺序的细微变化 正常人HbAN6Glu 病 人 HbSN6Val,镰刀型血红蛋白分子,镰刀状细胞血红蛋白的治疗性矫正,CH3CH3,CH-CH-C-+N C O-,NH3+,O,CH3CH3,CH-CH-C-,NHCNH2,O,O,N-末端缬氨酸残基,氰酸钾（KCNO）治疗,
