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1、动物实验基本技术和方法,广东药学院实验动物中心,主要内容,一、实验前准备二、实验动物抓取与固定三、年龄的大致判断四、性别、发情、与妊娠鉴定五、编号和标记六、分组七、去毛八、给药途径与方法九、采血方法十、其他体液采集十一、麻醉方法十二、处死方法十三、动物病理检查,一、实验前准备,理论准备：了解动物实验基础知识 制定研究计划和方案 查阅关于实验方法的参考文献条件准备：仪器、器械、药品 运输 动物实验和饲养场所,二、实验动物抓取和固定,（一）小鼠,小鼠固定器固定,（二）大鼠,大鼠固定盒固定,（三）豚鼠,（四）家兔,兔子固定器固定,狗钳,狗的抓取固定,（五）犬,犬嘴固定方法,猫的抓取,犬固定,（六）猴
2、抓取与保定,猴徒手固定,三、年龄的大致判断,（一）大、小鼠1、根据形态鉴定日龄（大、小鼠情况基本一样）,2.根据体重鉴定日龄 小鼠日龄与体重的对应,大鼠日龄与体重的对应,（二）豚鼠一般老年豚鼠牙齿和趾爪长，被毛稀疏无光泽，眼神呆滞，行动迟缓。而年轻豚鼠牙齿短白，爪短软，眼睛圆亮，行动敏捷，被毛有光泽，且紧贴身体。同样，也可根据体重来推断大致年龄。同日龄豚鼠，雌性体重略高于雄性。与大鼠一样，其体重受多种因素的制约。实验对年龄要求比较严格时，必须由卡片记录提供准确年龄。,（三）家兔 家兔的门齿和爪随年龄增长而增长，是年龄鉴别的重要标志。青年兔门齿洁白，短小，排列整齐；老年兔门齿暗黄，厚而长，排列不
3、整齐，有时破损。白色家兔趾小基本呈红色，尖端呈白色。1岁家兔红色与白色长度相等；1岁以下，红多于白；1岁以上，白多于红。还可根据趾爪的长度与弯曲度来区别。青年兔趾爪较短，直平，隐在脚毛中，随年龄的增长，趾爪露出于脚毛之外，而且爪尖钩曲。另外，家兔皮薄而紧，眼神明亮，行动活泼的为青年兔；皮厚而松，眼神颓废，行动迟缓的为老年兔。,（四）犬犬的年龄主要以牙齿的生长情况、磨损程度、外形颜色等情况综合判定。仔犬在出生后十几天即开始生出乳齿，2个月以后开始由门齿犬齿臼齿顺序逐渐更换为恒齿，8l0个月齿换齐。但犬齿需要1岁半以后才能长坚实。饲养场饲养的品种犬，可以根据记录，明确了解年龄，而收购的杂种犬就无法
4、知道确切年龄。实际中，可根据犬齿更换和磨损情况，估计犬的年龄。,四、性别、发情、与妊娠鉴定,（一）大、小鼠的性别鉴定,初生兔仔如阴部孔洞扁圆而略大于肛门，且与肛门相向、距离较近的是母兔；孔洞呈圆形而略小于肛门，孔洞向前而距肛门较远的是公兔。三月龄以上的兔子，只要看有无阴囊即可区别公母。,（二）兔的性别鉴定,Female,Male,（三）大、小鼠发情鉴定,小鼠性周期阴道分泌物涂片变化,（四）妊娠鉴定,1、阴道栓法（大、小鼠、豚鼠）2、外部检查法3、摸胎法4、阴道检查法5、直肠检查法6、超声波检查法7、孕酮含量测定法,阴道栓,五、编号和标记,1、染色法：浅色动物 3.5-5苦味酸溶液（黄色）0.5
5、%中性红或碱性品红溶液（红色）煤焦油酒精溶液（黑色）龙胆紫溶液（紫色）,2、打耳孔法：小型动物,3、剪趾法：小型动物,4、剪尾法：大、小鼠，仅限与两组间区分5、烙印法：刺号钳，中、大型动物6、针刺法：中、大型动物7、号牌法：耳标签、项圈、腿圈，中、大型动物8、剪毛法：大动物9、笼子标号,六、分组,随机化分组：避免人为影响例：将14只小鼠随机分成两组。先将小鼠编为I14号，在随机数字表上任点一数，按任意方向连续抄14个随机数字。编排如下：,动物编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14随机数字 16 22 77 94 39 49 54 43 54 82 17 37 9
6、3 23归 组 B B A B A A B A B B A A A A奇数代表A织，偶数代表B组A组：3 5 6 8 11 12 13 14 B组：1 2 4 7 9 10调整分组：接刚才随机数字23继续抄表得随机数字78，用78除以8（因为需要把A组的8个数字调整掉一个），得余数6，所以把A组的第6个动物，即12号动物调整到B组,最终分组A组：3 5 6 8 11 13 14B组：1 2 4 7 9 10 12,例：12只大鼠随机分为3组大鼠编号112在随机数字表上任点一数，按任意方向连续抄12个随机数字。每个数分别用3除，记录余数，根据余数分组大鼠编号：1，2，3，4，5，6，7，8，9，
7、10，11，12随机数字：08，27，01，50，15，29，39，39，43，79，69，10余数：2，0，1，2，0，2，0，0，1，1，0，1组别：B，C，A，B，C，B，C，C，A，A，C，A,A：3，9，10，12 B；1，4，6 C：2，5，7，8，11调整分组：接刚才随机数字10继续抄表得随机数字61，用61除以5（因为需要把C组的5个数字调整掉一个），得余数1，所以把C组的第1个动物，即2号动物调整到B组。最终分组 A：3，9，10，12 B；1，2，4，6 C：5，7，8，11,七、去毛,1、剪毛：弯头剪毛剪。2、拔毛：大小鼠尾静脉、家兔耳缘静脉注射。3、剃毛：将剃毛部位先用
8、剪刀粗剪一遍，蘸温肥皂水润湿，用剃刀顺着被毛方向剃毛，用电动剃毛推剪，则逆被毛向剃毛。,4、化学脱毛：常用脱毛剂8%硫化钠水溶液硫化钠3份，洗衣粉1份、淀粉7份，加水调成糊状硫化钡50克，氧化锌25克，淀粉25克，加水100毫升调成糊状硫化钠10克，生石灰15克，加水到100毫升，适合犬和其他大动物。,八、给药途径与方法,（一）自动口服：加入饲料或饮水（二）投喂药片：掰开口，放到舌根部,（三）灌胃（i.g),1、小鼠、大鼠、豚鼠 灌胃时将灌胃针按在注射器上，吸入药液。左手抓住鼠背部及颈部皮肤将动物固定，右手持注射器，将灌胃针插入动物口中，沿咽后壁徐徐插入食道。动物应固定成垂直体位，针插入时应无
9、阻力。若感到阻力或动物挣扎时，应立即停止进针或将针拔出，以兔损伤或穿破食道以及误入气管。一般当灌胃针插入小鼠34cm，大鼠或豚鼠46cm后可将药物注入。常用的灌胃量小鼠为0.2 1ml，大鼠14ml，豚鼠为15ml。,2、狗、兔、猫、猴 灌胃时，先将动物固定，再将特制的扩口器放入动物口中，扩口器之宽度可视动物口腔大小而定，如狗的扩口器可用木料制成长方形，长约1015cm，粗细应适合狗嘴，约23cm，中间粘一小孔，孔的直途为510cm。灌胃时将扩口器放于上述动物上下门牙之后，并用绳将它固定于嘴部，将带有弹性的橡皮导管（如导尿管），经扩口器上的小圆孔插入，沿咽后壁而进入食道，此时应检查导管是否正确
10、插入食道，可将导管外口置于一盛水的烧杯中，如不发生气泡，即认为此导管是在食道中，未误入气管，即可将药液灌入。灌胃管插入长度狗为20cm，兔子为12-15cm。,动物最大灌胃量,（四）直肠给药（五）呼吸道给药（六）滴鼻（七）点眼（八）经皮肤给药：常用于检测药物、毒物、化妆品等的透皮吸收、局部作用、至敏作用等。家兔和豚鼠选择脊柱两侧皮肤，大小鼠常采取浸尾方式。（九）皮内注射(i.d)：一般用于接种或过敏实验。将药液注射在真皮和表皮之间。皮内注射时需将注射的局部脱去被毛，消毒后，用左手拇指和食指按住皮肤并使之绷紧，在两指之间，用注射器连4(1/2)号细针头，紧贴皮肤表层刺入皮内，然后再向上挑起并再稍
11、刺入，即可注射药液，此时可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。,（十）皮下注射(s.c)：注射时以左手拇指和食指提起皮肤，将连有5（1/2）号针头的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般狗、猫多在大腿外侧，豚鼠在后大腿的内侧或小腹部；大白鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。蛙可在脊背部淋巴腔注射。（十一）肌肉注射(i.m)：股部肌肉,（十二）腹腔注射(i.p)：用大、小白鼠做实验时，以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推0.51.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。若实验动物为家兔，进针部位为
12、下腹部的腹白线离开1cm处。,（十三）静脉注射(i.v)：,1、小鼠：尾静脉2、大鼠：尾静脉、阴茎静脉、舌下静脉、浅背侧跖静脉,大小鼠有上、左、右3根尾静脉，成品字型,小鼠尾静脉注射,大鼠阴茎静脉注射,大鼠舌下静脉注射,大鼠浅背侧跖静脉注射,3、豚鼠：浅背侧跖静脉、耳静脉注射4、家兔：耳静脉注射5、猪：耳缘静脉6、猴：前肢桡静脉、后肢隐静脉注射,猪耳缘静脉注射,7、猫、狗：前肢内侧头静脉、后肢外侧小隐静脉注射,狗前肢内侧头静脉,狗后肢外侧小隐静脉,猴的后肢皮下静脉注射,（十四）脑腔注射：1、小鼠 小指夹鼠尾，拇指和是指置小鼠头两侧固定，中指和无名指压住鼠身，在注射处消毒后，右手持注射器，以食指
13、固定针芯，垂直刺入针头深度约57mm。2、兔 将兔用固定器固定好，剃去头顶的被毛，左手将头皮绷紧，消毒后，右手持锥子，自头顶正中稍偏一侧部位，锥穿头骨，即换以左手固定锥子，右手持注射器，使针头沿锥尖刺入，慢慢拔出锥子，即刻将针头刺入约1020mm，即可推液。,（十五）关节腔注射：（十六）椎管内注射：注射入蛛网膜下腔（十七）淋巴囊内注射：蛙和蟾蜍,（十八）小脑延髓池注射：,几种动物不同给药途径的常用注射量（毫升）,九、采血方法,（一）大、小鼠：1、眶静脉丛（窦）：少量多次采大小鼠血。小鼠0.20.3ml，大鼠0.40.6ml2、摘眼球：用于一次大量采小鼠血，可得到45体重的血量3、尾静脉：用于少
14、量多次采大小鼠血,尾静脉采血,4、剪头：用于一次性大量采小鼠血，可得到0.51.0ml的血量5、大血管：包括颈动脉（静脉），股动脉（静脉），腋下动脉（静脉），腹主动脉，此方法不常用于小鼠采血，而多用于大鼠一次性大量采血。可得5ml左右血量。6、心脏采血：小鼠少用，可用于大鼠一次性（开胸）或多次采血（不开胸）。,心脏采血,（二）家兔：1、耳缘静脉：中等血量的采集，可反复采血，每次510ml。2、耳中央动脉：可反复采血，每次1015ml。,3、心脏采血：可用于 一次性（开胸）或 多次采血（不开胸）。一次性开胸采血可 得到80100ml血量4、颈动静脉采血：用于一次性采血，需要手术，可得血量8010
15、ml。,（三）豚鼠：1、心脏采血：可用于一次性（开胸）或多次采血（不开胸）。一次性开胸采血可得到510ml血量。2、背跖静脉采血：用于少量反复采血。3、耳缘剪口采血,（四）犬猫：和静脉注射部位相同，前肢内侧头静脉、后肢外侧小隐静脉。也可颈静脉（动脉）或心脏采血。,（五）猪：前腔静脉或耳大静脉采血（六）羊：颈静脉采血（七）猴：前肢头静脉、后肢皮下静脉或耳缘静脉等。（八）禽类：翼下静脉,仔猪前腔静脉采血,采血注意事项,（一）采血场所有充足的光线；室温夏季最好保持在2528，冬季，1520为宜；（二）采血用具有采用部位一般需要进行消毒；（三）采血用的注射器和试管必须保持清洁干燥；（四）若需抗凝全血，
16、在注射器或试管内需预先加入抗凝剂。（五）注意不同动物的采血量采血。,、取少量血,、取中量血,、取大量血,4、最大安全采血量与最小致死采血量,常用抗凝剂：1、肝素：抑制凝血酶活力，阻止血小板凝集。纯品肝素1mg125U，10U20U抗1ml血凝集，但通常应用23倍剂量。用法：可配成1%肝素溶液，用时取0.1ml于试管内，100烘干，每管可抗凝510ml血。或用1%肝素溶液湿润采血注射器。肝素可改变蛋白质等电点，当用盐析法分离蛋白作分类测定时，不可用肝素抗凝。,2、枸橼酸钠：使凝血必需的钙离子失活。常用35%水溶液，碱性较强。3、草酸盐合剂：草酸铵1.2g，草酸钾0.8g，福尔马林1.0ml，加蒸
17、馏水至100ml。使凝血必需的钙离子失活。每毫升血加草酸盐合剂0.1ml。4、氟化钠：每毫升血加6mg。,十、其他体液采集,1、胸水、腹水采集：穿刺2、消化液采集：唾液，胃液，胰液，胆汁3、精液采集：中、大动物用假阴道，小动物穿刺附睾来采集精液。4、脑脊液采集：手术或小脑延髓池抽取5、骨髓采集：大动物活体穿刺，小动物处死后取股骨或胸骨骨髓。,6、尿液采集：代谢笼收集导尿管采集膀胱穿刺压迫排尿,十一、麻醉方法,（一）麻醉方法：1、全麻 吸入麻醉，静脉注射、腹腔注射。2、局麻 浸润麻醉。根据手术，按皮下、筋膜、肌肉、腹膜、骨膜等顺序逐步深入注射到术野周围。,（二）麻醉前准备：1、禁食812h，防止
18、呕吐，可饮水。2、根据实验部位和种类，给动物脱毛。3、犬、猪、猴等大动物可在麻醉前给予一些药物以减少动物紧张，减少支气管分泌。,（1）阿托品：减少支气管和唾液腺分泌，防止气管阻塞。副作用：加快心率。用量：肌肉或皮下注射0.04mg/kg（2）安定：产生镇静作用，加强麻醉效果，使骨骼肌松弛。用量：2.55mg/kg（3）吗啡：产生镇静作用。副作用：抑制呼吸中枢。用量：皮下注射12mg/kg，肌肉注射1020mg/kg。,（三）麻醉药物：1、全麻药物（1）乙醚：强挥发性、易燃。乙醚是最常用的吸入麻醉剂，各种动物适用。机制：抑制中枢神经系统。特点：安全范围大，肌肉完全松弛，对肝肾毒性小，麻醉诱导期和
19、苏醒期较长。副作用：局部刺激大，引起上呼吸道黏膜分泌增加，导致呼吸道阻塞，可用阿托品对抗解救。,（2）巴比妥类：种类很多，有巴比妥钠，戊巴比妥钠，硫喷妥那，苯巴比妥钠等。适用于各种动物。如实验中大小鼠常用3戊巴比妥钠溶液腹腔注射进行麻醉。特点：安全范围广，毒性小，麻醉潜伏期短，麻醉维持时间长。可腹腔或静脉给药。机理：阻断神经冲动传递到大脑。副作用：过量使用可导致呼吸肌麻痹而死亡，同时抑制末梢循环，导致血压降低，并影响基础代谢，导致体温降低。,（3）氯胺酮：常用其盐酸盐。特点：麻醉潜伏期短，麻醉维持期仅1020min，麻醉浅，安全性高，可重复给药。机制：阻断大脑联络途径。副作用：兴奋心血管系统，
20、使血压升高，心率加快，偶尔引起呕吐。（4）水合氯醛：作用特点和巴比妥类相似。但安全范围小，麻醉剂量和中毒剂量接近，对皮肤和黏膜有较强刺激。,2、局麻药物（1）普鲁卡因：是无刺激性的局麻药物。特点：麻醉速度快，注射后13分钟就可产生麻醉。可以维持3045分钟。对皮肤和黏膜穿透力很弱，需要注射给药才能产生局麻效果。它可以使血管舒张，易被吸收入血液而失去效果。在其溶液中加入肾上腺素（每100ml加入0.1%肾上腺素0.20.5ml）可以使麻醉时间延长12小时。,（2）利多卡因：效力和穿透力比普鲁卡因强。（3）的卡因：化学结构和普鲁卡因类似，效力和穿透力比普鲁卡因强。,（四）实验动物的急救,动物实验过
21、程中，可因麻醉药过量、出血过多、分泌物或血块堵塞气管造成窒息以及某种药物原因引起动物血压、呼吸不规则等现象，此时应立即进行急救处理措施。急救处理措施首先要迅速排查原因，并中断诱因（如止血、停药、排除分泌物等），然后对症实施急救措施。,1、呼吸、心跳（血压）的改变 动物实验过程中，需密切观察实验动物的呼吸、心跳及血压的变化，一者它们是实验反应的数据指标，二者是实验动物状态的主要指征。尤其对呼吸的观察，因为动物的死亡首先是呼吸的停止。（1）诱发原因 麻醉给药速度过快或过量：实施静脉给药麻醉，可因给药速度过快或过量导致呼吸停止。因此，为防止麻醉剂过量，注射速度一定不要过快，严密观察动物状况，若需追加
22、麻醉剂，一次不宜超过总量的1/5。,气道不畅或堵塞：常见于麻醉后，因为气管分泌物增多或气管切口的出血凝块堵塞气管，动物呼吸不规则、呼吸困难甚至引起的窒息。大失血：如因大动脉插管的松脱所造成的大失血。实验药物的作用：如静脉注射乙酰胆碱过量或动物对其反应过强，引起心搏减弱减慢，继而出现呼吸、心跳的停止。,2、急救措施（1）迅速排查、中断、排除诱因。如应用棉签清除干净气管、气管插管内的分泌物及血凝块。必要时拔出气管插管冲洗后再行气管插管术。（2）根据下列不同情况采取相应的急救措施：呼吸极慢、不规则，但心跳正常时：给予人工呼吸-压胸法，适当给予苏醒剂。呼吸停止仍有心跳时：实施人工呼吸，必要时可使用人工
23、呼吸机或吸氧（吸入气中O2占95%，CO2占5）；注射50葡萄糖液510ml；给肾上腺素及苏醒剂。呼吸、心跳均停止时：用l：10000肾上腺素溶液心内注射，其余同。,3、大失血（1）诱发原因 多因动脉插管结扎不牢、动物挣扎，导致大动脉插管的松脱，或在进行动脉插管术时，因未放置动脉夹或动脉夹夹闭不全而剪切动脉引起。（2）急救措施 立即止血：应迅速手指压迫或捏住出血处（尽量不要用止血钳，以防损伤动脉和神经），然后仔细检查分离出血点，于近心端放置动脉夹，再行动脉插管术。补充血容量：若失血太多，适当加快输液(生理盐水)速度，增加血容量。注射强心剂：静脉注射110000肾上腺素0.5ml。,十二、处死方
24、法,1、颈椎脱臼法：小鼠、大鼠2、空气栓塞法：兔、猫、犬等大动物3、放血法：心脏放血或大血管放血4、断头法：小鼠、大鼠5、吸入二氧化碳6、麻醉法：如注射巴比妥类药物,十三、动物病理检查,（一）一般病理检查,1、实验动物不明原因死亡或实验需要时必须进行尸检以查明死亡原因。2、对动物进行尸检应该在动物死亡后立即进行，不能立即进行的需在冷冻的条件下保存动物尸体，以尽量保持病变与死亡前状态一致。3、外观检查：检查动物的发育状况、营养状况、精神状态、感觉器官、呼吸系统、消化系统、皮肤及被毛等指标。4、病理剖检：主要观察组织器官的大小、色泽、质地、切面和粘膜等指标。,（二）组织病理学检查,1、取材：按要求切取相应的组织器官，并用固定液进行固定。2、制片：按程序将切取的组织器官制作成组织切片。3、读片：在显微镜下观察动物的心、肝、脾、肺、肾、脑等重点器官。尸体需要做无害化处理：高压、焚烧、深埋等。,谢谢！,
