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1、第四章 动物细胞的微囊化培养,动物细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素培养过程需氧量少(氧传质系数KLa 大于10 h-1即可满足每毫升107个细胞的生长)培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在原代培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。,动物细胞培养的一般特点,动物细胞大规模培养存在的困难,1、动物细胞生长速率慢，产物的生产率也低，从而造
2、成产物浓度也低。2、动物细胞培养基成分复杂，价格昂贵。3、动物细胞没有细胞壁，易受机械搅拌所引起的剪切力的影响。4、常规的细胞培养方法也不太适用于大规模培养。上述这些限制造成了大规模动物细胞培养所需费用高，技术难度大（规模越大、影响也越大）。,随着生物工程的发展，使得很多原先只有动物体产生的蛋白质可由重组微生物生产，如重组大肠杆菌表达和生产人胰岛素和人生长激素。然而，由于微生物细胞缺乏蛋白质的转录后修饰机制，由重组微生物产生的不少蛋白质分子不具有所期待的生物学功能和活力。动物细胞的大规模的培养确有不小的困难，但它的优点也是很明显的、诱人的，关键是如何提高细胞在反应器内的密度，提高细胞的稳定性以
3、及生产率。动物细胞的固定化以及培养是解决问题的有效途径。,优缺点,优点：可防止细胞在培养过程中受到物理损伤.活性蛋白不能从囊中自由出入半透膜，从而提高细胞密度和产物含量，并方便分离纯化处理.缺点：微囊制作复杂，成功率不高.微囊内死亡的细胞会污染正常产物.收集产物必须破壁，不能实现生产连续化.,微囊化培养,微囊（Microcapsules）技术是一种利用天然的或合成的高分子成膜材料（囊材）把液体或固体（囊心物）包嵌形成直径15000m（通常为5250m）微小胶囊的技术。微囊的制备技术起源于20世纪50年代，在70年代中期得到迅猛发展，并且出现了许多微囊化产品和工艺。微囊技术可广泛用于医药、食品、
4、农药、饲料、化妆品、染料等领域。,微囊制备方法1、人工界面聚合法 此方法是将芯材物乳化或分散在一个有壁材的连续相中，然后在芯材物的表面通过单体聚合反应而形成微囊。参加聚合反应的单体，一种是水溶性的，另一种是油溶性的，它们分别位于囊心液滴的内部和外部，并在囊心液滴的表面上反应形成聚合物薄膜。利用界面聚合法可以使疏水性材料的溶液或分散液微胶囊化，也可以使亲水性材料的水溶液或分散液微胶囊化。,2、定位聚合反应 在定位聚合反应中，高分子单体和预聚物置于油相中，通过提高温度或者使用具有表面活性的酸性催化剂来引发界面聚合反应。如果活性成分为固体，在单体或预聚物加入之前先将固体活性成分溶解在与水不互溶的有机
5、溶剂中。,3、凝聚法 在此工艺中，含有预分散活性物质的阳离子高分子溶液与另一相反电荷的高分子溶液反应。一般使用明胶（阳离子）和阿拉伯胶（阴离子）。首先，在热的明胶溶液中制备好囊芯物质的悬浮液或乳液，接着加人稀释的阿拉伯胶溶液，将pH值降至4.5以下，它促进了作为核芯的分散颗粒周围明胶的凝固，当降低温度时，明胶出现并形成软的胶囊，接着加人醛类交联剂（如戊二醛）使软胶囊硬化，提高pH值至9并加热。硬的胶囊可通过离心、过滤、喷雾干燥或其他方式分离出来。,4、微囊悬浮液喷雾干燥法 微囊的悬浮液可用喷雾干燥制成微囊粒剂，一般需要另外的分散剂来满足在水中再分散的需要。含有活性物质和高分子的料浆也可进行喷雾
6、干燥，使高分子在固体囊芯颗粒周围形成膜或囊壁。活性物质的料浆必须在合适的分散剂作用下先预磨成较细的颗粒。一旦喷雾干燥除去水分，就能得到粉粒状产品，平均粒径在 100-300m之间。粒径大小取决于喷雾干燥器的尺寸、干燥室的喷嘴种类、料浆流量、干燥温度等因素。,5、融解冷却的分散液制微囊法 在此工艺中，囊芯材料分散在融解的石蜡中，低温条件下在水中形成乳液，石蜡固化形成微胶囊壁。冷却速度和搅拌条件决定了胶囊的形状和大小。,6、溶剂蒸发法 需要微囊化的活性物质和形成囊壁材料的高分子同时溶解在具有挥发性、与水不互溶的有机溶剂中，活性物质和高分子也必须互不相溶。高分子和活性成分的溶液在表面活性剂的作用下预
7、先乳化。然后通过加热或减压蒸馏除去溶剂，溶剂蒸发后，高分子被分离出来并在乳液粒子表面形成连续的膜。,细胞的固定化培养方法,一、吸附 1）多孔陶瓷 美国某公司开发了一种完全自动化的细胞培养系统，该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体，可提供一定的生长表面积，既可用于培养悬浮生长的细胞，又可用于培养贴壁依靠性细胞。该系统可以连续化生产蛋白质。由于产物直接分泌到培养基中，给分离纯化带来方便。而且细胞不用从培养基中分离，所以不必考虑梯度问题；当培养基高速循环时，可以保持相对恒定的营养物和氧浓度。增加套数即可实现放大。,2）微载体 微载体细胞培养
8、法是一种用于培养贴壁依赖性细胞的大规模培养技术。这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体)，使细胞在微载体表面附着和生长，并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面，1g微载体其比表面积可达 6000cm2，从而可实现细胞的高密度培养。,微载体的直径在60-250m，由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚合物组成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的粘附特性，在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质，因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。,采用微载体培养具有以下优点：比表面积大，单位体
9、积培养液的细胞产率高；采用均匀悬浮培养，无营养物或产物梯度；可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况；细胞收获过程相对简单，劳动强度小；培养基利用率高，占地面积小；放大容易，国外已有公司以 1000 L 规模培养人的二倍体细胞来生产-干扰素。但其缺点：是搅拌桨及微珠间的碰撞易损伤细胞；接种密度高；微载体吸附力弱，不适合培养悬浮型细胞。,3）大孔微载体 人们为了解决微载体培养系统中细胞易受机械损伤的缺陷以及能最大限度地扩大比表面积，开发了具有完全连通沟回的大孔微载体。大孔微载体将细胞固定在孔内生长，因而与其他方法相比具有一系列优点：,比表面积大，是实心微载体的几倍甚至几十倍；细胞在孔内生长，受到保
10、护，剪切损伤小；与包埋法相比，传质尤其是传氧效果好；两种类型细胞都适用；细胞三维生长，细胞密度是实心微载体10倍以上，有的可108个/mL；适用于长期维持培养，细胞生长情况依然良好；微载体浓度高，实心载体在培养液中浓度增大到一定时，细胞密度反而下降；而大孔微载体在浓度较高时，表面碰撞增加，能促使细胞在孔内生长；最适合于蛋白质生产和产物分泌。因此有人预言，大孔微载体技术将成为动物细胞大规模培养的一种常用方式。,二、包埋 将动物细胞包埋在各种多聚物多孔载体中而制成固定化动物细胞的方法称为包埋法。优点：此法步骤简便，条件温和，负荷量大，细胞泄露少。因细胞嵌入在高聚物网格中而受到保护，细胞能抗机械剪切
11、。但该法也有一定缺点，如扩散限制，并非所有细胞都处于最佳营养物浓度。包埋法一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化。多孔凝胶是最常用的载体，用于动物细胞固定化的凝胶主要有海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等。,1）海藻酸钙凝胶 海藻酸钙凝胶包埋法是将动物细胞与一定量的海藻酸钠溶液混合均匀，然后滴到一定浓度的氯化钙溶液中形成直径约1mm内含动物细胞的海藻酸钙胶珠，分离洗涤后即可用于培养。此法操作时条件温和，对活细胞损伤小。但固定后机械强度不高。为了大量制备海藻酸钙凝胶包埋的固定化细胞，国外已有专门的振动喷嘴设备可供使用。,2）琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶可用二相法制得。将含有细胞的琼脂糖溶液分散到一个水不溶相中(
12、如石蜡油)，形成直径0.2mm凝胶微珠，移去石蜡油后，细胞即可进行培养。同海藻钙一样，琼脂糖更适于培养悬浮细胞。尽管凝胶珠形成过程很复杂，目前放大体积不超过20 L。但琼脂糖凝胶无毒性，具有较大的空隙，可以允许大分子物质自由扩散，因此该法非常适用于蛋白产物的连续生产。有人曾用琼脂糖包埋杂交瘤细胞和淋巴细胞生产单克隆抗体和白细胞介素。,3）血纤维蛋白 将动物细胞与血纤维蛋白原混合，然后加入凝血酶。凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白，将动物细胞固定在其中。血纤维蛋白可以促进细胞贴壁，因此两种类型的细胞都适于培养。而且基质高度多孔，允许大分子物质的自由扩散。但机械强度差，对剪切力很敏感。,
13、三、中空纤维 中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态，利用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统。中空纤维培养技术的优点是无剪切、高传质、营养成分的选择性渗入，使培养细胞和产物密度都可达到比较高的水平。缺点是膜的污染和堵塞，观察困难，细胞生长或过量气体产生会破坏纤维。中空纤维培养技术的发展趋势是让细胞在管束外空间生长，以达到更高的细胞培养密度。目前中空纤维反应器已进入工业化生产，主要用于培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体。,四、微囊化 微囊化培养技术其要点是：在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再
14、将微囊放入培养系统内进行培养。生长介质为1.4%海藻酸钠溶液，半透膜由多聚赖氨酸形成。培养系统可采用搅拌式或气升式反应器系统。实验证实，采用批式和连续灌注式培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体，在7-27 d 微囊内抗体浓度可达1250-5300 mg/L。,利用微囊包裹具有特定功能的组织细胞，形成免疫隔离的人工细胞，以此植入疾病动物或病人体内。1980 年报道了微囊化胰岛移植治疗糖尿病。他们将同种大鼠胰岛用海藻酸-聚赖氨酸-聚乙烯亚胺包埋后植入链脲霉素诱导的糖尿病大鼠体内，在未用免疫抑制剂的情况下，控制大鼠血糖正常达一年左右。,固定化方法的选择一、培养规模 由于各种固定化系统可以获得相同的细胞密度，
15、且细胞的产率主要取决于细胞的扩散，因此反应器的体积是培养规模放大的主要决定因素。虽然微载体系统可以提供最大的单元操作，但其他系统也可以通过增加单元套数而获得放大。,二、培养方式 除了海藻酸钙包埋法外，其他固定化基质都是多孔型的，能允许大分子物质自由出入，因此可实现蛋白质产物的连续生产。在凝胶珠和微囊中可使蛋白产物积聚到很高的浓度，给后续的分离纯化处理带来方便，并大大降低了生产成本。,三、所培养的细胞类型 大多数固定化系统都适用于贴壁型细胞的培养。而在吸附非贴壁型细胞时，由于吸附力弱，易出现细胞泄露。,四、制备方法的难易和成本 由于固定化基质类型比较复杂，因此各种固定化方法的成本很难比较。海藻酸
16、盐和琼脂糖是以化学试剂形式出售；胶原珠是以无菌形式提供给使用者，以便于接种。,固定化培养存在的问题固定化细胞培养的细胞密度较一般悬浮培养高10-100 倍，但同时也带来了如何保证足够的营养物质和氧的传递问题。(2)细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌产物能力的丢失或产物活性的降低依然是细胞培养领域深感棘手的问题。包埋在凝胶或微囊中死亡的细胞会对其他细胞产生污染和毒害作用。(3)培养基及固定化基质价格昂贵，生产成本高居不下。尤其是高效的微载体细胞培养介质，销售价格一直呈上涨趋势。(4)目前对细胞代谢和生长动力学的研究以及在线监测水平还远不足以设计出确定的优化培养系统，从而导致昂贵培养基的浪费。
17、,固定化动物细胞培养的展望 固定化动物细胞培养工程发展的总方向是大型化、自动化、精巧化、低成本、高细胞密度、高目的产品产量。从国际上的发展趋势看，动物细胞培养技术主要有：（1）开发细胞培养反应器和培养系统；（2)开发培养贴壁细胞的载体；（3)开发微囊技术；（4)开发杂交、重组技术；（5)开发无血清和化学合成的培养基；（6)蛋白质浓缩和提纯技术。,第一节 动物细胞的微囊化,微囊化是固定化技术中的一种，是用一层亲水性的半透膜将酶、辅酶、蛋白质等生物大分子或动植物细胞包围在珠状的微囊里，从而使得酶等生物大分子和细胞不能从微囊里逸出，而小分子的物质、培养基的营养物质可以自由出入半透膜，达到催化或培养的
18、目的。,微囊化的神经组织细胞,一、微囊化概述,人工细胞的概念由加拿大马吉尔（McGill）大学教授于1957年首次提出并应用具有半渗透性薄膜的微胶囊固定活体细胞或组织取得成功。由于微胶囊膜起到了类似细胞膜的作用,且固定后体系的形态和功能酷似活性细胞,所以称之为“人工细胞”。,微囊化细胞的模式图,80 年代初,Lim 等人将微囊化技术与组织细胞移植相结合,制备了具有良好生物相容性的海藻酸钠/聚赖氨酸(APA)微胶囊作为免疫隔离工具,包埋猪胰岛细胞形成人工细胞,并移植入糖尿病大鼠体内,结果表明该人工细胞成功地调节了血糖水平,代行了大鼠胰腺功能,因而被称为人工胰腺.这一研究成果较好地解决了组织细胞移
19、植过程的免疫排斥问题,避免或减少了昂贵的免疫抑制剂的使用,为组织细胞移植治疗神经/内分泌系统疾病提供了新思路.,二、动物细胞微囊化方法,需满足条件：1、微囊化的过程要温和，快速，不损伤细胞，尽可能在液体状态和生理条件下制备。2、微囊化所用的试剂和膜材料必须对细胞无毒害作用。3、微囊化所形成的膜必须能够使营养物和代谢产物自由通过，膜的孔径可以控制。4、膜应具有足够的机械强度以抵抗培养过程中的搅拌，不至于使微囊破裂,1、聚赖氨酸/海藻酸(PLL/ALG)微囊化（1）原理 海藻酸是以1，4键连接的聚醛酸，其主要成分是甘露糖醛酸和古罗糖醛酸。当它的水溶液以钙盐的形式存在时，则成凝胶状态。用螯合剂将钙离
20、子去除后，海藻酸又回复到溶液状态。海藻酸钙凝胶用聚赖氨酸处理后，其接触部分不再被螯合剂去钙而溶解,动物细胞与海藻酸溶液混合，经过微囊化发生器滴入CaCl2溶液中，形成凝胶微珠，然后用聚赖氨酸溶液处理微球表面，最后再用柠檬酸去除微珠的钙离子，这样，微珠内部的海藻酸成液态，动物细胞悬浮其中，而微珠表面由于受到聚赖氨酸的处理而不再溶解，形成一层薄膜，动物细胞就被这层膜包在微囊里了，形成细胞微囊。,（2）微囊化装置及步骤,制备微囊化动物细胞要经过以下几步（海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸微囊）1、无菌收集动物细胞，离心后再生理盐水洗涤。2、离心收集细胞，并加入海藻酸溶液混合均匀，使成悬浮液。3、将悬浮液装入微
21、囊发生器中制成微滴。4、微滴加到CaCl2溶液中形成微胶珠。5、凝胶珠用生理盐水洗去残留的CaCl2.6、凝胶珠悬浮于聚赖氨酸溶液中，使之形成膜。7、凝胶珠再用CaCl2溶液洗，用CHES缓冲液固化。8、凝胶珠用生理盐水洗涤以后，再用ALG溶液处理。9、生理盐水洗涤后的凝胶珠加0.05mg/l柠檬酸溶液处理，使半透膜内的ALG成液态，然后用生理盐水冲洗。,(3)影响微囊化的一些因素微囊半透明孔径影响因素微囊的质量影响因素细胞的活性影响因素,微囊半透膜的孔径,是培养基营养成分、代谢物进行膜内外交换、截留一定分子量蛋白在囊内的关键，如何选择是一重要问题。微囊的膜是多阴离子的海藻酸与多阳离子的聚赖氨
22、酸相互作用而形成的。研究表明，此半透膜的孔径主要由聚赖氨酸的分子量决定，一般来说用高分子量的聚赖氨酸(PLL)覆膜孔径大，PLL分子量低、孔径小，通常使用相对分子量为40000-80000的PLL。研究还表明，PLL溶液的浓度及处理时间、溶液的PH及使用温度也都会影响膜的孔径。,微囊的质量,海藻酸的纯度、黏度及甘露糖醛酸和古罗糖醛酸的比例都会影响微囊的形成及机械性能。纯度高、黏度高容易成囊。含古罗糖醛酸多的海藻酸容易成囊，机械性能好，不易破碎。因此在使用海藻酸时必须慎重地选择。,细胞的活性,在进行微囊化时要注意到保持动物细胞的存活率，这与微囊化时间的长短、温度、溶液的pH、保持溶液等渗等都有着
23、密切的关系，需特别注意。微囊化时动物细胞在海藻酸溶液中的初始浓度也与存活率有关，不同的细胞，所用浓度不同，一般在104106个/ml,2、其它的微囊化方法（1）海藻酸钙微囊以甲基纤维素代替海藻酸（PLL）的方法，将动物细胞与1.1%甲基纤维素的CaCL2溶液（1.3%）以1：3的比例混合，然后将混合物滴入0.75%的海藻酸钠溶液中，反应15min后在液滴四周就形成了一层海藻酸钙的膜，包围动物细胞在囊内，一般微囊直径达2.5mm。此方法简单，但强度不够，容易破碎。,（2）脱乙酰几丁质/海藻酸钠微囊用1g/L的脱乙酰几丁质（pH6.5)代替PLL/ALG法中的PLL，在脱乙酰几丁质与海藻酸钠反应2
24、0min后，再用0.05mol/L柠檬酸钠处理，使微囊内重新液化。膜的孔径受脱乙酰几丁质溶液的离子强度的影响，此法同样也存在强度不够的问题。,（3）PLL/脱乙酰几丁质/海藻酸钠双层膜微囊包有细胞的海藻酸钠凝胶珠与脱乙酰几丁质溶液反应成膜后，用生理盐水洗涤再加入到0.3g/L海藻酸钠中反应4min，再经生理盐水洗涤，与0.5g/L的PLL（相对分子量22000）反应6min以稳定膜，同样可以形成微膜。,（4）脱乙酰几丁质/羧甲基纤维素（CMC）微囊利用脱乙酰几丁质与CMC的静电作用形成半透膜使细胞微囊化的方法。将含有细胞的羟甲基纤维素钠盐（CMC）溶液经微囊发射器喷射入脱乙酰几丁质溶液中，反应
25、2-5min，然后倒入磷酸缓冲液中以减少几丁质的粘度，用离心的方法收集微囊、培养。,（5）甲基丙烯酸乙基脂/甲基苯烯酸甲酯（HEMA/MMA）共聚物微囊HEMA/MMA、PEG600和细胞溶液6.7:60:33.3的体积比混匀后，经过空气套筒的针头喷入碳酸二乙酯中，形成悬浮液与生理盐水混合，温和搅拌，使微囊完全形成并沉淀。,第二节 微囊化细胞的培养,一、微囊化培养的细胞种类,在微囊内，很多动物细胞，不管是悬浮细胞还是贴壁细胞都能良好地生长。据报道，仅杂交瘤细胞就有100多种已被微囊化培养。重组成纤细胞HBS-1在贴壁生长时，细胞呈棱形单层生长，而微囊化后形态发生了很大的变化，由棱形变成了球形，
26、并且呈三向实体生长，逐渐成团，与动物体内的组织形态很相识，这可能反应了微囊的微环境比较接近动物体内的环境。,二、培养条件,1、培养容器：小规模的用到转瓶、方瓶等。大规模培养用摇瓶和生物反应器。2、培养基：DMEM,RPMI和EMA3、微囊的大小：微囊小，物质的传递迅速，营养物和氧气可以很快地进入微囊内，以供给细胞生长所需要，同时代谢产物也能及时地排放到微囊外面。当PLL/ALG微囊的直径超过500m 时，细胞的增殖受到明显的抑制。,4、微囊的体积和工作总体积之比：通常在（1：10）（1：2）的范围内。他们间的比值大则生产等量产品可减少生物反应器的体积。对大规模生产是非常有利的。5、可以加大搅拌
27、速度和通气量，但要注意不破坏微囊。,第三节 微囊化动物细胞的应用目前，微囊化细胞可以在两个方面应用：一是培养微囊化动物细胞以生产一些药物。二是作为药物直接用于治疗或者作为筛选药物之用。,一、生产药物上的应用1、单克隆抗体的生产,2、高值生化药物的生产,1、微囊化重组成纤细胞BSH-1分别进行培养瓶和celligen生物反应器内培养，细胞密度可达11082108个/ml微囊,3、干扰素的生产,Jarvis和Grdina通过试剂和病毒方法诱导微囊化FS-1和Namalwa细胞生产干扰素，这两种细胞在微囊中生产比悬浮培养或单层培养更旺盛，两细胞在微囊中生产的干扰素与悬浮培养或单层培养的总产量相同。,
28、二、在治疗及药物筛选上的应用1、人工器官微囊化动物细胞在排除免疫反应上可能有普遍的意义。人们已将某种器官的细胞微囊化并植入体内以期望能代替这些器官的功能。微囊化大鼠兰氏胰岛细胞注入大鼠腹腔内，可用于治疗糖尿病。当4104.510个细胞/ml微囊注入体内后，当天即使血糖由400500mg/dL减至100mg/dL左右，并能长期维持正常血糖水平，在360天内不出现糖尿病症状。,2、抗癌药物的筛选,微囊化的肿瘤细胞用于估价抗癌药物对活体的作用。人的肿瘤细胞经微囊化后注入小鼠腹腔中，服用受检的抗癌药，检测微囊化的肿瘤细胞对药物的反应，结果发现抗癌药能穿透微囊的膜作用与微囊中的肿瘤细胞，抑制或杀灭的水平与其他体外或体内测定的药效一致。,复习题：1、微囊化动物细胞必须具备的条件？2、聚赖氨酸/海藻酸微囊化原理及制备微囊化动物细胞的步骤？3、影响微囊化的因素？4、微囊化动物细胞的应用？,
