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1、结核病实验室检测新诊断技术介绍省结核病参比实验室 杨丹丹,发光二极管荧光显微镜（LED）方法液基夹层杯技术 线性探针耐多药检测技术（HAIN）基因芯片耐多药检测技术（GENECHIP）TB和利福平耐药快速分子鉴定（X-Pert）,一、发光二极管荧光显微镜（LED）方法,适用范围：痰涂片镜检所需试剂/仪器：LED显微镜、荧光染色液中盖项目：淮安市（淮阴区、楚州区）原理：,发光二极管荧光显微镜（LED）,镜下视野,发光二极管荧光显微镜（LED）,不需要加热玻片，步骤简单视野比普通的显微镜大大2-4倍对数目少的不必使用镜油节省人力时间，时间为普通的1/4每天可检查至少60个涂片可帮助早期诊断肺结核
2、即使菌浓度较低杆菌也有很高的灵敏度，与ZN相比阳性发现率平均增加10%,不需要空调设施不需要暗室诊断性能优于标准荧光显微镜寿命长（15-20,000小时）荧光染色液有致癌作用，推荐自动染色机。涂片需避光低温保存。需加强操作人员的培训和质量控制。成本低廉，价格低于现有的光学显微镜。适合县、乡级基层实验室使用。,二、液基夹层杯技术,适用范围：痰涂片镜检十一五国家重大科技专项：泰兴、江阴厂家：湖南天骑公司原理：集菌法,流程图痰标本消化灭活 基片的夹层杯离心 细菌附着在基片 在夹层杯中直接染色 取出基片 于载玻片上 镜检 自动阅片计算机报告系统。所需仪器设备：普通的抗酸染色液、彭氏杯（专利）、涂片机、
3、KP21型快速干片机、抗酸杆菌自动阅片计算机报告系统。,重大专项：泰兴、江阴地区部分实验结果比较,三、线性探针耐多药检测方法（HAIN）,适用范围：1、TB的诊断2、一线抗结核药物耐药诊断3、二线抗结核药物耐药的诊断4、目前，利福平（rpoB基因）、异烟肼（Kat基因、inhA基因）耐药的诊断所需仪器设备：生安柜、超声振荡仪、PCR扩增仪、可调温振荡仪,原理：基于分子生物学扩增技术。rpoB基因突变位点有：4个Kat基因、inhA基因突变位点有：2个、4个,正确流程,杂交,DNA提取,MIX制备,痰液前处理,操作步骤,一、痰标本处理去污染前处理液：氢氧化钠+柠檬酸三钠+N-乙酰半胱氨酸。痰标本
4、+等体积去污染前处理液：振荡-离心-静置-PBS清洗-离心-留取沉淀。二、DNA提取处理后痰标本沉淀：95C孵育-超声裂解-取上清液用于PCR扩增。三、扩增产物杂交PCR产物变性，与探针试条上的标记突变位点杂交，标记物显色。,四、结果判读,试剂质控,位点质控,HAIN和目前常规药敏方法比较,适用范围：1、TB复合群鉴定。2、TB菌种鉴定。3、利福平和异烟肼耐药检测。原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。,四、GENECHIP基因芯片耐多药检测技术,基因芯片,将核酸片段有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列。采用光导原位合成或微量点样等方法。
5、然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交。通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。，,耐药检测基因芯片,基因芯片是基于特定基因位点突变与耐药性的相关性，通过PCR扩增和核酸杂交技术，检测荧光信号的有无，判断特定位点的突变情况和细菌耐药性的检测方法。结核分枝杆菌耐药检测基因芯片基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌耐药性（利福平、异烟肼）。rpoB基因突变位点：13个位点。katG基因突变位点：2个位点。/inhA基因突变位点：2个突变位点。,耐药分子诊断的基本原
6、理,操作较复杂。特异度与灵敏度不高。基因芯片耐多药检测试剂已获得欧盟体外诊断试剂证书（CE-IVD）。中国药品食品监督管理局的医疗器械证书。可以作为临床耐药结核病临床诊断和治疗的依据。,五、结核和利福平耐药的快速分子鉴定（x-pert）,适用范围：1、TB复合群鉴定。2、利福平耐药检测。原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。可以在2小时出报告结果。,实验室方法,痰标本的前处理：同前方法。试剂加入去污处理的痰标本中。室温下手工晃动密闭痰盒，15分钟内2次，然后取2ml灭活后的物质加入检测盒(其内含相当于0.7ml未处理痰液或0.5ml已去污处理的痰液)，检测盒放入检测平台。MTB/RIF检测系统
7、直接输出电子结果。,实验室方法,阳性培养物经MPT64抗原检测以确定其是否属于结核分枝杆菌菌属。L-J培养基比例法药敏/MIGT 快速药敏法。常规的DNA核酸扩增hain方法检测耐药,实验室方法,试剂分别按2:1和3:1加入未经处理的痰标本和去污处理的痰标本中。室温下手工晃动密闭痰盒，15分钟内2次，然后取2ml灭活后的物质加入检测盒(其内含相当于0.7ml未处理痰液或0.5ml已去污处理的痰液)，检测盒放入检测平台。MTB/RIF检测系统直接输出电子结果。,讨论,该检测方法适用于低收入国家精确诊断肺结核并能够进行福平耐药筛选的快速检测方法。以培养方法作金标准，该方法可以检测出97%以上的肺结
8、核患者，包括90%的涂阴病人。南非有60%-80%的人感染HIV，鉴于合并HIV+TB阳性出率较低，尤其HIV+TB-，MTB/RIF有较高的检出率。,讨论,MTB/RIF优点：简单、安全标本处理简单，操作方便，检测全自动，2小时内出结果，机器判读，结果精确，减少核酸污染。该检测方法产生的气溶胶无传染性。对实验室生物安全级别要求较低，可以在基层开展（从生物安全要求出发），由于较快速，可以减少诊断延迟，检测更多标本。,讨论,MTB/RIF缺点：基层实验室人员培训、温度控制、电力保障、是否到位。但是每年一次的仪器校准对于基层实验室是个挑战，不过已经大量开展能否在基层实验室应用的验证了。技术尖端，生产费用较高。尽管基金会试图通过谈判降低价格和低检测费用，但仍会比显微镜价格要高，但比培养和药敏检测仪器要便宜。,
