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1、The Experimental Study of the Survival promoting effect of buyang huanwu decoction on the neurons after the peripheral nerve injuryMajor: Orthopaedics and Traumatology of TCMPostgraduate: Qian YebinTutor: Prof. Tao YoulueABSTRACT Objective: To investigate the effect of buyang huanwu decoction on the
2、 survival of the motor neurons of the anterior horn of spinal cord and the sensory neurons in dorsal root ganglion (DRG) after the peripheral nerve injury. Methods： Twenty adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups after the right sciatic was transected. Postoperatively, bu-yang
3、 huanwu decoction was administered daily to rats of the experimental group. For rats of the control group, normal saline was given. By the end of four weeks, the L4,5 spinal region and L4、L5 DRG were dissected out for neuron count and morphological analysis. Results: The survival rate of motor neuro
4、ns in the experimental group was 69.22% and was statistically significant compared with that in the c-ontrol group, which is 59.87% (P0.01). The survival rate of sensory ne-urons was 79.13% in the experimental group, 70.99% in the control group and the difference was statistically significant (P0.01
5、). The diameter and area of motor neurons and sensory neurons were significantly smaller in the control group than those in the experimental group (P0.01). Conclusion: These results suggest that buyang huanwu decoction can increase the survival rate of neurons and counteract the atrophy of neurons a
6、fter peripheral nerve injury. Key words: buyang huanwu decoction neurons/drug eff peripheral nerves/drug eff 补阳还五汤促进周围神经损伤后神经元存活的实验研究专 业：中医骨伤科学研 究 生：钱叶斌导 师：陶有略 教授摘 要目的：研究补阳还五汤对周围神经损伤后脊髓前角运动神经元和脊神经节感觉神经元存活的影响，为临床应用和进一步研究补阳还五汤治疗周围神经损伤提供客观的理论依据。方法：成年SD大鼠20只，在右侧梨状肌下缘0.5cm处切断坐骨神经，随机分为二组，对照组以生理盐水灌胃，实验组以补阳
7、还五汤灌胃，4周后观察相应节段运动神经元和感觉神经元存活率、神经元胞体直径和面积。结果：4周后相应节段脊髓前角运动神经元存活率：对照组为59.87%，实验组为69.22% (P0.01)，脊神经节感觉神经元存活率：对照组为70.99%，实验组为79.13%(P0.01)。对照组运动神经元和感觉神经元胞体直径、面积明显小于实验组(P0.01)。结论：补阳还五汤能提高周围神经损伤后脊髓前角运动神经元和脊神经节感觉神经元存活率，减轻神经元胞体萎缩程度，有利于周围神经损伤后神经功能的恢复。关键词：补阳还五汤 神经元/药物作用 周围神经/药物作用补阳还五汤促进周围神经损伤后神经元存活的实验研究专 业：中
8、医骨伤科学研 究 生：钱叶斌导 师：陶有略 教授前 言周围神经损伤后的功能恢复是临床上仍未解决的一大难题。神经细胞作为一个整体，胞体与轴突之间的联系是十分密切的，轴突的损伤会累及神经元的胞体，而神经元的功能状态也必将会影响神经轴突的再生及功能的恢复。周围神经损伤引起一定数量的神经元死亡，由于神经元属于终期分化细胞，本身不具备分裂增殖能力，神经元数量减少无疑会影响神经损伤后的功能恢复。为此，研究促进周围神经损伤后神经元存活，减少其死亡，使与其相关联的神经纤维有再生的物质依据，对神经损伤后功能恢复有重要意义。神经再生的目的是努力恢复其神经元形态和功能完整性，神经元胞体在此过程中处于核心地位。因此，
9、神经系统损伤后，对神经元胞体的保护具有相当重要性。这个问题已受到学者们的注意1-3。分子生物学的迅速发展，为利用基因工程生产一些神经营养因子提供了强有力的手段，已生产出了NGF、CNTF和BDNF等，目前对神经损伤后保护神经元胞体研究主要集中在这些因子上。由于神经营养因子目前来源比较困难、价格昂贵、给药途径、副作用等原因，其临床应用受到限制。中药具有价格低、副作用小等优点。 本课题为福建省教委资助项目。周围神经损伤可归属中医的痿症范畴。补阳还五汤是清代名医王清任所创，具有补气、活血和通络的作用。临床研究表明，补阳还五汤治疗周围神经损伤对功能恢复有良好作用4-6。实验研究表明，补阳还五汤能促进周
10、围神经再生，促进神经损伤局部雪旺氏细胞增殖7，促进神经轴浆运输8，提高周围神经损伤后功能恢复效果9，促进脊髓细胞体外存活和突起生长以及神经生长因子的表达10、11。本实验以周围神经损伤后神经元存活率、神经元胞体直径、面积等为指标，探讨补阳还五汤在体内促进周围神经损伤后神经元存活作用，从补阳五汤对神经元胞体死亡的预防方面来阐明其促进周围神经损伤后神经功能恢复的机理，为临床应用和进一步研究补阳还五汤治疗周围神经损伤提供科学的理论依据。材料和方法 一、药物加工 所需中药一次性从福建省中药材公司购入。方剂组成比例：生黄芪120g、当归尾6g、赤芍6g、川芎3g、红花3g、地龙3g、桃仁3g。由福建省第
11、二人民医院中药制剂室煎煮、提取、浓缩，使生药浓度为7g/ml，放入冰箱中保存备用。 二、实验动物 SD大鼠20只，12周龄，体重200g（20g），健康雌性，由上海西普尔一必凯实验动物有限公司提供。 三、实验试剂 所需试剂由福州市医疗器械采购供应站及福建医科大学附属第一医院病理科提供。 四、使用主要仪器 1、SLEE-CUT-4060型切片机 德国产2、美国Kodak彩色冲印胶卷（Q-200度） 3、日本Olympus PM-10-35AD-1型显微照相机4、德国Leica Q 550IW PMLB全自动真彩色图像分析仪五、造模 用2%戊巴比妥（35mg/kg）腹腔注射，局部剪毛、消毒，于右股
12、部后外侧纵行切开皮肤，钝性分离股二头肌，显露坐骨神经，距梨状肌下缘0.5cm处将坐骨神经切断，远端切除1cm，关闭切口。 六、分组及治疗随机分为二组，每组10只。1、对照组用生理盐水灌胃，每日1次，每次3ml，共4周。2、实验组用补阳还五汤制剂灌胃，每日1次，每次3ml，共4周。 七、饲养管理 分笼饲养，每笼饲养5只大鼠，喂给颗粒饲料，每天喂给新鲜水。笼下垫锯末，二天更换一次，保持锯末干燥，以减少足底溃疡的发生。饲养房地面保持干燥，温度适宜（20-27），光线明亮。 八、固定液配制1、0.1mol/L磷酸缓冲固定液（PH7.4）配制 Na2PO429g NaH2PO43g NaCl85g 蒸馏
13、水加至1000ml2、4%多聚甲醛0.1mol/L磷酸缓冲固定液（PH7.4）配制 多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲固定液 500ml 加热60-70，搅拌，滴加IN NaOH直至清澈为止，冷却后加0.1mol/L磷酸缓冲固定液至1000ml，PH7.4。九、取材1、主动脉灌注术后4周，用2%戊巴比妥钠（35mg/kg）腹腔注射。麻醉满意后，将大鼠仰卧，固定四肢，剪开左胸前壁，纵行剪开心包，充分暴露心脏，绕主动脉根部用丝线打一松结，从心尖部剪一小口将接在输液装置上的头磨平的16号针插入，经左心室至升主动脉 ，但勿插入主动脉太远，结扎固定针头，开始灌注，同时剪开右心放血。先灌注冷生理盐水
14、（4），约100ml，至流出液体为略带红色或无色时，灌注4%多聚甲醛0.1mol/L磷酸缓冲固定液（PH7.4）300ml。注：脊髓质地柔软且易迅速发生死后自溶是其突出特点。为了避免神经组织死后自溶及便于取材，在取材前经主动脉灌注固定液进行固定。2、取材随后出双侧L4、L5脊神经节和L4,5段脊髓。放入10%福尔马林固定液中。十、包埋切片和染色1、包埋：石蜡2、切片：片厚5m，每隔5张取1张染色。3、染色：染液配制：1%焦油紫水溶液加1滴冰蜡酸5ml蒸馏水 95ml染色方法：（1）切片脱蜡到水，入70%酒精2小时。（2）蒸馏水洗（3）入焦油紫染液，置37温箱内，染色12小时。（4）蒸馏水速洗，
15、用95%酒精分化脱色，镜下控制。（5）纯酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。十一、检测目镜安装网格型测微尺，在1040放大倍镜下，计数脊神经节单位面积内具有明显胞核的神经元数目，换算成每10000平方微米含神经元个数。在脊髓尼氏染色切片上，分别计算双侧前角运动神经元数目，标准为能辨认出细胞核的神经元轮廓。然后求出各组坐骨神经切断侧和正常例的比例，即神经元的存活率。对各组尼氏染色切片分别随机选择50个细胞，用图像分析仪测量其直径和面积。所得结果进行统计学分析。结果一、一般观察结果造模后3天见各组大鼠伤口缘整齐，无明显红肿，无渗出物，1周后伤口基本愈合。术后动物伤足呈背伸、外展、多翻形态，足趾并拢呈爪
16、样，动物放于平地上，见足趾不能着地行走时以足跟着地，全部跛行，行走不稳或拖步。对照组7只大鼠出现右足底不同程度的溃疡，3周时有所恢复。右下肢，特别是小腿部明显变细，体重减轻，毛发色泽较差。实验组3只大鼠右足底出现溃疡，程度明显轻，3周时已愈合，体重无明显改变，毛发光亮。二、坐骨神经切断后4周神经元存活情况（切断例/正常侧%）表一：对照组实验组脊神经节神经元70.995.0079.134.84脊髓前角运动神经元59.875.4269.225.68注:(1)脊神经节神经元 对照组 VS. 实验组 P0.01 (2)脊髓前角运动神经元 对照组 VS. 实验组 P0.01从上表可以看出在坐骨神经损伤后
17、，应用补阳还五汤可使脊神经节神经元存活率明显提高，为79.13%，与生理盐水对照组的存活率70.99%相比，经检验其差别有非常显著意义（P0.01）。补阳还五汤使脊髓前角运动神经元存活率明显提高，为69.22%，与生理盐水对照组的存活率59.87%相比，经检验其差别有非常显著意义（P0.01）。 三、坐骨神经切断后4周神经元形态（直径、面积）改变 1、脊神经节神经元形态改变 表二、组别测试细胞数直径（um）面积（um2）对照组5022.20.837927实验组5023.80.646425正常侧5024.20.749223注：（1）对照组 VS. 实验组、正常侧 P0.05坐骨神经切断后4周，对
18、照组应用生理盐水，大部分脊神经节神经元胞体明显缩小，尼氏体减少，另一些则崩解死亡。而实验组应用补阳还五汤，其胞体和正常基本一致，经方差分析两两比较，对照组与实验组、正常侧差别有显著性（P0.05）。2、脊髓前角运动神经元形态改变表三、组别测试细胞数直径（um）面积（um2）对照组5025.10.851029实验组5027.50.763733正常侧5027.90.566526注：（1）对照组 VS. 实验组、正常侧 P0.05坐骨神经切断后4周，对照组大部分前角运动神经元胞体明显缩小，尼氏体减少。实验组胞体和正常侧基本一样，经方差分析两两比较，对照组与实验组、正常侧差别有显著性（P0.05）。讨
19、 论 一、周围神经损伤后神经元的有关改变1、神经元死亡小鼠出生后4天、1周、2周、4周在行坐骨神经切断术后可分别引起80-90%、50%、40%和10%的相应节段脊髓前角运动神经元死亡12。切断成年大鼠坐骨神经其背根节感觉神经死亡29%3,脊髓前角运动神经元死亡41%2。在大鼠膝关节处及股部切断坐骨神经，结果远、近端所致感觉神经元死亡率分别为7%和27%13。大鼠面神经高位和低位切断，其运动神经元死亡率分别为31.46%和23.44%14。由此可以看出：（1）周围神经损伤可以引起神经元死亡。（2）低龄动物周围神经损伤后神经元死亡率较高。（3）损伤部位距胞体越近，死亡率越高。本实验在12周龄成年
20、SD大鼠梨状肌下浆缘0.5cm处切断坐骨神经，4周后背根节感觉神经死亡29.01%，脊髓前角运动神经元死亡40.13%，与文献报道结果基本一致。周围神经切断引起轴突反应致相关神经死亡，其机制尚未定论，可能与下列因素有关15，16：（1）轴突切断导致神经胞体膜电位急剧变化，引起细胞内离子失衡；（2）轴突运输中断，其中最关键的神经营养因子转运中断。损伤部位距胞体越近，胞体损害越严重，原因可能是：（1）损伤近端神经纤维的雪旺氏细胞代谢增强，增殖加快，可产生较多的神经营养因子（NTFs）供胞体生存需要，损伤部位越近，残存神经纤维所占雪旺细胞数量越少，合成神经营养因子少，胞体损害越明显，造成较多的神经元
21、死亡。（2）神经元可通过损伤近端的侧支从靶器官获取营养物质维持生存，损伤部位越靠近胞体，近端残留侧支越少，因而容易造成神经元死亡。近年来研究发现周围神经损伤后出现神经元凋亡。Ekstrom17观察到坐骨神经损伤后，凋亡的感觉神经元占总数的1%，陈晓东18等发现成年大鼠坐骨神经切断后，可出现运动神经元凋亡。有关神经损伤导致神经元凋亡的机制，目前尚未完全明了。Gillardon等19，Rabizadeh等20观察到bcl-2和神经生长因子（NGF）低亲和力受体（P75NGFR）参与介导神经细胞的凋亡过程。细胞死亡一般分为坏死和程序性死亡（programmed cell death，PCD）。PCD
22、也称为细胞凋亡（apotosis），是由基因调控的细胞自主性死亡，形态学上表现为染色质的浓缩和出现凋亡小体。当细胞受到有害刺激或处于疾病状态，如缺血、缺氧和炎症反应时，不仅会出现细胞坏死，还会出现细胞凋亡。本实验发现生理盐水组感觉神经元和运动神经元死亡率分别为29.01%和40.13%，补阳还五汤组神经元死亡率则分别降为20.87%和30.78%，两组有显著性差异（P0.01），说明补阳还五汤可提高周围神经损伤后神经元存活率。本实验未作凋亡细胞检测，有关补阳还五汤对周围神经损伤后神经凋亡的影响有待进一步研究。神经损伤后，如何保护濒临死亡的神经元成为目前研究的热点之一。补阳还五汤减少神经元的死亡
23、，无疑对促进神经再生，最大限度地恢复神经功能，具有重要意义。2、神经元形态变化周围神经损伤后，相应的神经元会发生一定程度的萎缩3。神经元树突及其分支广泛存在是神经元之间信息联系，功能协调的重要形态学基础。Waston实验表明周围神经损伤后中枢胞体发生逆行性变化，神经元胞体伸出的树突退缩向胞体，树突周围的突触也脱离其表面。神经再生后仍存在神经元形态恢复障碍，可能是肢体功能恢复困难的重要原因之一21。因为神经元形态未达正常水平，致使该神经元与其它神经元发生突触联系的区域少于正常，势必影响功能的恢复。臂丛神经切断后24小时，超微结构观察到相应节段脊髓前角运动神经元胞浆中线粒体明显水肿，数目减少，胞浆
24、中尼氏体崩解成散在碎片状粗面内质网和游离核糖体，尼氏体数目减少，溶酶体数目和面积减少22。尼氏体是由许多规则排列的粗面内质网以及其间游离的核糖体组成，是细胞合成蛋白质的产所，线粒体是细胞的产能器官，溶酶体是消化器官，并参与不饱和脂肪酸的代谢，这些细胞器减少，将明显影响神经元的功能，使神经元处于低功能状态，不能合成充分的营养物质供轴突再生需要，神经再生受到影响，功能恢复不能达到理想程度。神经元萎缩通常由于细胞的功能活动降低，血液及营养物质供应不足等引起。萎缩细胞的细胞器减少甚至消失。萎缩一般是可复性的，只要萎缩的程度不十分严重，当原因消除后，萎缩的细胞可逐渐恢复原状。但病变如继续发展，则萎缩的细
25、胞可最后消失。本实验观察到坐骨神经切断后4周，生理盐水组感觉神经元和运动神经元胞体明显缩小，尼氏体减少，补阳还五汤组则和正常基本一样。两组有显著性差别（P0.01）,说明补阳还五汤有促进神经元胞体形态恢复的作用，有利于神经功能的恢复。二、补阳还五汤对周围神经损伤的修复作用1、祖国医学对周围神经损伤的认识祖国医学中周围神经损伤可归属于痿证范畴。某个肢体或身体某个部位发生瘫痪状态，称为单瘫，多为周围神经损伤或炎症病变所引起，临床表现为一侧面部或某个肢体麻木不仁，痿软无力，肌张力减弱，腱反射减弱或消失，均为弛缓性瘫痪。肢瘫多为外伤引起，唐蔺道人理伤续断方乌丸子载：“扑打伤损，骨碎筋断，瘀血不散，筋痿
26、力乏，左瘫右痪，手足缓弱”。指出手足瘫痪与伤损的关系。人体是气血津液、脏腑经络等共同组成的一个有机整体，所有的生命活动主要是五脏六腑各种功能的反映，而脏腑功能活动的物质基础是气血津液。素问调经论说：“血气不和，百病乃变化而生”，“人之所有者，血与气耳”，说明了气血的重要性。血靠气的推动周流于全身，营养各个脏腑和组织。素问五脏生成篇说：“肝受血而能视，足受血而能走，掌受血而能握，指受血而能摄。”从表面上看，神经损伤是局部损伤，但机体受外伤影响而遇受局部损伤，每能导致脏腑、经络、气血的功能紊乱。正如正体类要序说：“肢体损于外，则气血伤于内，荣卫有所不贯，脏腑由之不和”。气血两者关系十分密切，血随气
27、沿着经脉而循行全身，以营养五脏六腑、四肢。素问阴阳应象大论阐述气血之间的关系时指出：“阴在内，阳之守也；阳在外，阴之使也。”说明两者相互依存的关系。神经损伤造成气血瘀阻，经络阻塞，损伤后气血循行不得流畅，则机体组织失去濡养，以致机体功能发生异常，而产生一系列的病理变化。伤气则气滞，伤血则血瘀。气血理论与损伤的关系是损伤病机核心内容，是指导治疗的关键。而气与血本不相离，气病可及血、血伤亦多及气，气为血帅，气行则血行，因此通过补气可使血瘀得到改善。用益气药配合活血祛瘀药治疗，可使气行血活，达到治疗目的。2、补阳还五汤配伍特点及运用补阳还五汤系清代名医王清任所创，始见其著作医林改错此方颇受医家尊崇。
28、古代医家将人体之阳评定为十分，左右侧各占五分，如患者肝阳化风，肝风内动时一侧肢体瘫痪，即五分之阳丧失。服用本方后患侧肢体功能恢复，使丧失的五分元阳得以补还，故本方得名补阳还五汤。方剂组成是生黄芪四两，当归尾二钱，赤芍药一钱半，地龙、川芎、桃仁、红花各一钱，水煎服。方中重用黄芪，大补脾胃之元气，令气旺血行，瘀去络通，为君药。当归尾长于活血，具有化瘀而不伤血之妙，是为臣药。川芎、赤芍、桃仁、红花助当归尾活血祛瘀，地龙通经活络，均为佐药。本方的配伍特点是大量补气与少量活血药相配，使气旺则血行，活血而不伤正，共奏补气活血通络之功。本方是体现王清任所创气虚血瘀理论的代表方剂，常用于中风后的治疗，以半身不
29、遂，口眼歪斜，苔白脉缓或脉细弱无力为证治要点。本方证以正气亏虚为主，故生黄芪用量宜重，祛瘀药宜轻。偏寒者，可加熟附子以温经散寒；脾胃虚弱者，可加党参、白术以补气健脾；痰多者，加制半复，天竺黄以化痰；若语言不利，加石菖蒲、郁金、远志等开窍化瘀。本方常用于脑血管意外后遗症，以及其他原因引起的偏瘫、截瘫，或上肢或下肢痿软属气虚血瘀者。现代有用于坐骨神经痛、周围神经麻痹、冠心病、肺心病、肾病等病证。3、补阳还五汤对周围神经损伤修复作用近年来，补阳还五汤临床治疗周围神经损伤受到重视，石庆培5用补阳还五汤治疗医源性腓总神经损伤29例，取得良好效果，徐绍东等6将断裂的神经行显微技术吻合后，治疗组予补阳还五汤
30、口服，对照组予维生素B1口服，经1-2年随访功能恢复在治疗组优良率为86.15%，优于对照组69.35%，显示补阳还五汤对断裂神经吻合术后的神经功能恢复有促进作用。实验资料显示补阳还五汤治疗周围神经损伤，能促进神经再生，促进雪旺氏细胞增殖和髓鞘形成，对失神经性肌萎缩有改善作用7；电生理学测定补阳还五汤组动作电位潜伏期及神经传导速度优于生理盐水组23；补阳还五汤能提高坐骨神经功能指数（SFI，一种可靠的神经功能评价方法）恢复率9，说明能促进神经功能更好地恢复。还能加速大鼠受伤坐骨神经轴浆运输8。以上资料说明补阳还五汤对周围神经损伤具有良好的修复作用。神经细胞作为一个整体，胞体与轴突之间的联系是十
31、分密切的，轴突的损伤会累及神经元的胞体，神经元的功能状态也必将影响神经轴突的再生及功能的恢复。因此，研究恢复神经功能的重点。已从以往单纯重视损伤局部的影响因素，拓展到神经元，轴突及效应器三方面的研究。如何保护神经损伤后的神经元，最大限度地恢复神经功能是目前研究的重点之一。本实验发现补阳还五汤能降低坐骨神经损伤后神经元死亡率，减轻神经元胞体萎缩程度，显示补阳还五汤对周围神经损伤后的神经元具有保护作用。三、补阳还五汤促进神经元存活的机理探讨1、补阳还五汤改善损伤神经细胞代谢（1）补阳还五汤对血液流变性的影响血瘀证的实质就是血液流变学异常，即血液处在浓、粘、凝、聚状态。补阳还五汤可明显地改善血液的浓
32、、粘、凝、聚状态，对血液流变学多项指标均有显著地改善作用24。对家兔脑卒中给予补阳还五汤治疗后观察对血液流变学指标的影响，结果表明补阳还五汤降低动物全血高、低切粘度、红细胞压积、血浆比粘度和血小板聚集率，且作用优于单纯活血化瘀药25。临床研究补阳还五汤对脑血栓患者血液流变性的影响，发现本方对全血粘度、全血还原粘度、全血及血浆比粘度均有显著改善作用，对红细胞电泳、血沉及血沉方程K值亦有改善作用26，27。石关桐等28发现周围神经损伤后血浆粘度明显增高，补阳还五汤有降低血浆粘度的作用。该方还可以扩张外周血管、降低外周血管阻力，增强器官血流量、增加心肌收缩力和改善心肌代谢29。（2）补阳还五汤对血小
33、板聚集的影响血小板聚集性显著升高是血瘀证发病的重要原因。研究发现血小板内的环磷酸腺苷（cAMP）处于高浓度时抑制血小板的聚集，低浓度时则相反。补阳还五汤和黄芪可使血浆中cAMP浓度升高，并对胶原诱导的血小板聚集及ADP诱导的家兔血小板聚集均具有明显的抑制作用30。该方对体内外血栓形成有抑制作用，并且有体内溶血栓作用31。（3）补阳还五汤对微循环的影响高分子右旋糖酐造成的小鼠耳廓微循环模型用补阳还五汤治疗后，可使血流形态、血管口径，血球颜色得到一定程度改善，使血管分布恢复正常29。还可扩张小鼠耳廓细动脉和细静脉口径，增加毛细胞管开放数量32。临床观察该方对改善甲皱微循环有较显著作用33。（4）补
34、阳还五汤对氧和能量代谢的影响补阳还五汤中当归含有红细胞成热因子维生素B12、叶酸及菸酸、亚叶酸、生物素，可促进红细胞发育成熟，因而是有补血作用，川芎可刺激骨髓，提高其造血能力，使红细胞、白细胞、血小板数量增加，也具有补血作用。补阳还五汤及单味黄芪、当归、川芎、红花可延长缺氧小鼠的存活时间，降低死亡率，并使缺氧小鼠血、心、脑中的乳酸含量降低，说明氧被充分利用。黄芪能激活腺苷酸激酶（ADK），有利于能量的贮存、释放和合理运用，避免能量的浪费。神经损伤后，神经细胞处于高代谢状态，需要大量的能量和氧。缺氧可致神经细胞膜电位降低，神经介质合成减少，ATP生成不足，酸中毒，细胞内游离Ca2+增多，溶酶体酶
35、的释放以及细胞水肿，均可导致神经细胞功能障碍甚至结构破坏34。补阳还五汤能改善血液流变性，抑制血小板聚集，改善微循环，促进氧和能量代谢，使神经组织得到较多的血液和氧气，使有氧代谢顺利进行，产生较多的三磷酸腺苷（ATP），有利于胞体蛋白的合成。补阳还五汤可以纠正神经损伤局部缺氧，使雪旺氏细胞氧利用率提高，加快了雪旺氏细胞的增生。雪旺氏细胞分泌多种神经营养因子，可以保护神经元及促进神经再生。2、补阳还五汤促进内源性神经营养因子产生 （1）补阳还五汤对免疫功能的影响实验表明，补阳还五汤对免疫器官有显著增重作用，对巨噬细胞吞噬功能有明显促进作用，可以增加特异性抗体溶血素的含量，说明该方对机体的特异性和
36、非特异性免疫功能有较明显增强作用35。观察小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，补阳还五汤组吞噬率及吞噬指数均比对照组显著升高。拆方研究表明，黄芪有显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率及吞噬指数的作用，去黄芪后原方作用消失36，表明黄芪在本方中的作用非常重要。（2）巨噬细胞对雪旺氏细胞表达神经生长因子的影响正常神经组织中，神经生长因子（NGF）的水平较低，主要由效应神经元支配和分布的靶器官合成并通过轴浆逆行运输而至神经元胞体，以维持神经元的存活及正常功能，而由局部雪旺氏细胞合成的NGF的量极少37，神经损伤后，局部NGF的水平明显升高，且主要由局部增殖的雪旺氏细胞合成，以保护神经元的存活及促进神经纤维的生长，该
37、时期大量入侵的巨噬细胞可能参与了对神经损伤后的雪旺氏细胞表达NGF的调节38。马向阳等39发现巨噬细胞条件培养基引起成年鼠雪旺氏细胞表达NGF的百分率提高，激活巨噬细胞条件培养基中所含的促NGF表达因子无论在质或量上均优于未激活者。白细胞介素1（IL-1）、IL-1、干扰素（IFN-）、肿瘤坏死因子-（TNF-）几种细胞因子也具有类似巨噬细胞条件培养基的作用，巨噬细胞可能通过分泌IL-1、IL-1、IFN-、 TNF-、PDGF（血小板源性生长因子）、FGF（成纤维细胞生长因了）、TGF-（转移生长因子-）等因子促进表达NGF的雪旺氏细胞数量增加以及合成NGF的量增多，从而提高NGF的合成量。
38、坐骨神经损伤后，30分钟内即出现c-fos mRNA的表达增加。随后又出现了NGFmRNA的增加，c-fos mRNA的转录增加较之NGFmRNA转录早2.5小时40。已知c-fos蛋白可以形成一种“转录激活复合物”，改变目的基因（NGFmRNA）的蛋白合成，说明在体内c-fos参与了周围神经损伤后早期NGF表达的调节40，41。但随后则可能主要由巨噬细胞分泌的细胞因子参与长时间的调节，从而促进NGF蛋白的合成以及NGFmRNA的表达增加42，43。（3）巨噬细胞对雪旺氏细胞分裂增殖的影响腹腔巨噬细胞吞噬富含髓鞘的组份后所产生的条件培养基能够引起雪旺氏细胞的分裂增殖，而未激活的巨噬细胞条件培养
39、基对雪旺氏细胞的活性及增殖则没有影响44。其他学者的研究结果也表明了这一点45，46，说明巨噬细胞在吞噬变性髓鞘后产生了促分裂因子，可见巨噬细胞对于周围神经损伤后发生瓦勒氏变性期间的雪旺氏细胞增殖具有重要作用。IL-1不是促雪旺氏细胞分裂因子45，47，但能够刺激成纤维细胞增殖48，酸性成纤维细胞生长因子（FGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）亦可刺激雪旺氏细胞进行有丝分裂49。另外，转移生长因子（TGF）既是成纤维细胞、雪旺氏细胞的有丝分裂促进剂，同时又是一种巨噬细胞的趋化因子及引起巨噬细胞分泌IL-1的刺激因子50。巨噬细胞可分泌TGF、FGF等多种细胞因子51，足见巨噬细胞在促进雪
40、旺氏细胞分裂增殖方面具有重要作用。（4）补阳还五汤对雪旺氏细胞的影响黄芪注射液对培养的雪旺氏细胞具有轻度的促增殖作用52。在钳夹伤造成大鼠腓总神经损伤的动物模型，补阳还五汤能促进损伤局部雪旺氏细胞的增殖和髓鞘的形成7。（5）周围神经损伤后雪旺氏细胞的作用正常时NGF等神经营养因子（NTFs）主要来源于靶器官、细胞，由神经未梢摄取，经逆行轴浆运输至胞体，因血脑屏障及血神经屏障而不经血循环转运途径。当周围神经损伤时，轴浆运输随之中断，不可能从靶器官、细胞获得NTFs，唯一的来源只有神经元胞体、近段轴突及生长锥周围的微环境。Heuman等53用免疫组化技术在体内证实雪旺氏细胞可以分泌或表达NGF。顾
41、立强等54发现雪旺氏细胞无血清条件培养液的超滤液（其内含雪旺氏细胞分泌蛋白），不仅含有维持背根神经节感觉神经元存活的感觉性神经营养因子活性，而且含有维持脊髓前角运动神经元存活的运动性神经营养因子活性，且不被抗NGF抗体阻断，说明除NGF外，还有其他NTFs存在。（6）补阳还五汤对神经元的作用补阳还五汤促进脊髓及背根神经节细胞体外存活和突起生长10，能促进脊髓神经元NGF的合成与表达，促使NGF阳性神经元数目增加和单个NGF神经元面积增大，突起增长11。证实补阳还五汤对神经元有营养作用。综上所述，补阳还五汤可能通过以下途径促进内源性NTFs产生。（7）神经营养因子对神经元的营养作用巨噬细胞脊髓神
42、经元表达NGF补阳还五汤细胞因子雪旺细胞分泌NTFs雪旺细胞分裂增殖保护神经元神经营养因子（NTFs）是一类对中枢和外周神经系统均有营养活性的蛋白质，其主要功能是促进神经系统的发育，保护并修复受损神经元，以及促进生长和增进认知记忆过程中神经元之间的连结55。NGF是发现最早，研究最多的一种NTF，近年陆续发现了不少新的NTF，如脑源性神经营养因子（BDNF），神经营养素-3（NT-3）、神经营养素4/5（NT-4/5）、神经营养素-6（NT-6），睫状神经营养因子（CNTF）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等等。NGF不仅对交感、感觉及中枢胆碱能神经元有营养作用，而且NGF可逆行运输到运
43、动神经元，对运动神经元亦有保护作用56。切断大鼠一侧坐骨神经，近断端套接单盲端硅胶管，管内注入外源性NGF，结果脊髓前角运动神经元和背根节感觉神经元胆碱酯酶（AchE）和酸性磷酸酶（ACP）等酶学改变得到显著改善57、58，并降低感觉神经元死亡率。NGF保护神经元的机制可能与下述作用有关：稳定细胞内钙离子水平59；降低氧化损害60；参与蛋白磷酸化及基因表达调控61；加强受损脊髓前角运动神经元rRNA转录功能62。可阻止NGF低亲和力受体LNGFRP75诱导的细胞凋亡。有关补阳还五汤对NGF及其它神经营养因子的影响有待进一步研究。小 结本实验切断大鼠单侧坐骨神经，分别以补阳还五汤和生理盐水灌胃，
44、4周生观察脊髓前角运动神经元和脊神经节感觉神经元存活率、神经元胞体直径和面积。结果表明：1、周围神经损伤可致一部分感觉神经元和运动神经元死亡及萎缩。2、补阳还五汤能提高周围神经损伤后神经元存活率，降低死亡率，减轻神经元胞体萎缩程度。3、补阳还五汤促进周围神经损伤后神经元存活作用可能是通过改善神经细胞代谢，促进内源性神经营养因子产生。4、补阳还五汤治疗周围神经损伤，有利于神经功能的恢复。参考文献1庞清江，罗永湘，房清敏神经生长因子对脊髓前角运动神元的保护作用中华手外科杂志，1997,13(1):19-21.2Yan Q, Elliott J and Snider WD. Brain-derive
45、d neurotrophic factor rescues spinal motor neurons from axotomg-induced cell death. Nature，1992,360:753-755.3孔吉明，钟世镇，胡耀明周围神经损伤后所致感觉神经元胞体死亡的保护中华显微外科杂志，1995,18(4):269-271.4洪国章补阳还五汤治疗腓总神经损伤浙江中医杂志，1989,24(2):68.5石庆培补阳还五汤治疗医源性腓总神经损伤中国骨伤，1997,10(3):51.6徐绍东，黄东明，陆松青补阳还五汤对周围神经断裂吻合术后功能恢复的疗效观察新中医，1998,30(6):20
46、-21.7赵翠萍，王健智，孙娟，等加味补阳还五汤对周围神经再生的形态学实验研究中医正骨，1993,5(2):6-8.8石关桐，李义凯，石印玉补阳足五汤对钳伤大鼠坐骨神经轴浆运输的影响中国骨伤，1996,9(1):3-4.9邵水金，单宝枝，余安胜，等电针，中药对大鼠坐骨神经损伤后SFI及肌肉影响的观察中国针灸，1998,4:249-251.10廖柏松，杨浩，鞠躬，等补阳还五汤对脊髓及背根神经节细胞作用神经科学，1995,增刊：22011廖柏松，胡燕，党康杰，等补阳还五汤对脊髓神经元NGF和GABA表达的调节作用山东中医药大学学报，1997,21(2):136-137.12Pollin MM. The effect of age on motor neuron death following axotomy in the mouse. Development, 1991,112:83.13Ygge J. Neuronal. Loss in lumbar dorsal root ganglia after proximal compare to distal sciatic ner
