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1、描述：目的：观察丹参酮A磺酸钠（sodium tanshinone A sulfonate， STS）对血管紧张素（angiotensin ， Ang）诱导心房成纤维细胞胶原合成及TGF-1活化.摘要目的：观察丹参酮A磺酸钠（sodium tanshinone A sulfonate， STS）对血管紧张素（angiotensin ， Ang）诱导心房成纤维细胞胶原合成及TGF-1活化的影响。方法：培养新生大鼠心房成纤维细胞，检测胶原含量，并3H- 脯氨酸掺入法测定胶原合成速率作为心肌纤维化指标。ELISA法检测培养细胞上清中活性TGF-1及总TGF-1含量。发表论文网Western blot
2、测定血小板反应素-1（thrombospondin-1，TSP-1）表达。结果：Ang能够明显上调心房成纤维细胞胶原含量、胶原合成速 率；TSP-1表达及活性TGF-1分泌量上调，而总TGF-1表达无明显改变。在STS处理后，除总TGF-1外，其他指标均明显下调。结 论：STS能减轻Ang诱导心房成纤维细胞胶原分泌及合成速率，机制与抑制TSP-1/TGF-1通路有关。心房颤动（房颤）为临床最常见的快速性心律失常，严重危害人类健康，可致心功能不全及脑栓塞等并发症，明显增加患者死亡率。新近研究提示在多种因素所致房颤模型，均可见显著的心房纤维化（atrial fibrosis），后者干扰局部激动传导
3、，造成单向传导阻滞，增加冲动不均一性和碎裂电活动，促进房颤维持。因此，心房纤维化是房颤维持的关键因素，严重损害心功能2。寻找治疗心房纤维化的治疗方法是改善房颤患者愈后的新途径。研究表明血管紧张素（angiotensin ， Ang）是心房纤维化发病机制中重要的一环，可通过血小板反应素-1（thrombospondin 1，TSP-1）/转化生长因子-1（TGF-1）途径诱导心肌重构3-4。我国传统中药丹参临床上主要用于冠心病的治疗，本室也发现其能抑制心肌重构， 但其对心房纤维化研究尚少。本实验利用培养的新生大鼠心房成纤维细胞，研究丹参的主要成分丹参酮A衍生物“丹参酮A磺酸钠”（sodium t
4、anshinone A sulfonate， STS）对Ang诱导的胶原分泌及合成速率，TSP-1/TGF-1通路的影响， 探讨STS抗MF的可能机制， 为其在临床用于防治心房纤维化提供实验依据。1 材料1.1 动物 12 d龄新生Wistar大鼠，由同济医学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（鄂）2004-0007。1.2 试剂与仪器 Ang（Sigma公司）；STS（中国食品药品检定研究院，批号S02001300）；DMEM干粉培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、3H- 脯氨酸（中国科学院上海原子能研究所）；PMSF和leupeptin（Sigma公司）；PVDF膜（Amersham公司）；
5、羟脯氨酸试剂盒及 TGF-1 ELISA试剂盒（南京建成生物工程有限公司）；小鼠抗大鼠TSP-1（Santa Cruz公司）；其余试剂为国产分析纯。LS3810 液体闪烁仪（Beckman公司），垂直电泳仪及转膜系统（Biorad公司）。2 方法2.1 新生大鼠心房成纤维细胞（atrial fibroblasts， AFs）培养 取12 d龄的Wistar大鼠，在无菌条件下开胸剪取心室肌，无菌条件下剪碎心肌，0.1%胶原酶消化液消化后，加入含10胎牛血清的IMDM培养液制成细胞悬 液，调整细胞密度为1105个/mL，根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁1 h，去除心肌细胞获得成
6、纤维细胞。继续培养细胞至近融合状态时按12传代。传代后成纤维细胞用抗波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体免疫细胞化学染 色鉴定，纯度达到95%。实验用第35代的细胞。2.2 分组 共分为5组，分别为对照组，给予生理盐水；Ang（0.1 molL-1）组；Ang（0.1 molL-1）+STS（3 molL-1）组；Ang（0.1 molL-1）+STS（10 molL-1）组；Ang（0.1 molL-1）+STS（30 molL-1）组。2.3 羟脯氨酸法测定胶原蛋白含量 各干预因素处理细胞48 h后，取细胞上清液0.5 mL，加无水乙醇1.2 mL，旋涡混匀器充分混匀2 min，2次，3
7、 500 rmin-1离 心10 min，取上清（约1.5 mL），烘干，加0.5 mL双蒸水复溶，制成稀释倍数为1的检测液，加试剂1，2，3（具体见试剂盒说明书），混匀，65 水浴15 min，冷却后，在550 nm波长比色。胶原蛋白含量=7.46羟脯氨酸含量（羟脯氨酸含量占胶原的13.4%）。羟脯氨酸=（A测定管-A空白管）/（A标准管-A空白管） 标准管浓度稀释倍数。2.4 胶原合成（3H-proline掺入率）的测定 AFs接种到24孔培养板，贴壁生长至汇合状态后，更换无血清培养液，继续培养48 h，使AFs处于G0/Gl期。更换新的培养液（含0.4%FCS-DMEM及0.3 mmol
8、L-1抗坏血酸），加入上述各组干预，同时每孔加入37106 BqL-1的3H-proline， 共育30 h后，0.25%的胰酶消化并收集细胞。在0.22 m的醋酸纤维素微孔滤膜上负压抽滤，生理盐水和10%的三氯乙酸冲洗滤膜，95%乙醇脱色，烘干后置入闪烁瓶中，加入二甲苯闪烁液4 mL，静置过夜后，在液体闪烁仪计数器（Tri-carb2300，美国Packard公司）上进行放射性强度的测定。 2.5 ELISA法测定活性TGF-1及总TGF-1含量 按TGF-1免疫检测试剂盒说明书分别检测细胞培养上清中活性TGF-1及总TGF-1含量。总TGF-1检测样本需经1 molL-1盐酸化处理；活性T
9、GF-1检测采用非盐酸化处理的上清液。各组所得结果与对照组进行对比，进行统计分析。2.6 总蛋白的提取 取5105个各组干预后的心房成纤维细胞，加入5倍体积的裂解液孵育20 min，其组成为：Tris-HCl 50 mmolL-1 pH 8.0，NaCl 150 mmolL-1，EDTA 0.5 mmolL-1，DTT 1 mmolL-1， NP-40 1%，脱氧胆酸钠0.5%，SDS 0.1%，钒酸钠100 molL-1，PMSF 100 mgL-1，apmtinin 1 mgL-1，leupeptin 2 mgL-1，冰浴条件下进行组织匀浆，4 ，12 000 rmin-1离心10 min
10、，取上清，用Folin酚法进行蛋白定量后保存于-70 。2.7 免疫印迹法检测TSP-1蛋白表达 取40 g总蛋白加入上样缓冲液煮沸3 min变性，经SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后电转移至PVDF膜上，封闭后与l1 000稀释的TSP-1一抗4 孵育过夜，与11万稀释的二抗室温孵育l h，再与化学发光试剂ECL温浴l min后曝光、显影和定影，对结果进行吸光度扫描。用目标蛋白表达量的灰度值除以内参表达量的灰度值，以所得的比值表示目标蛋白的相对表达量。2.8 统计学处理 所有数据均采用AKx-Ds表示，用SPSS 12.0统计软件包进行单因素方差分析，以P0.05为差异具有统计学意义。3 结
11、果3.1 STS对AFs胶原含量的影响 0.1 molL-1Ang能显著提高羟脯氨酸含量（P0.01）。3， 10， 30 molL-1STS处理后，羟脯氨酸含量明显减少（P0.01），见表1。3.2 STS对AFs胶原合成速率（3H-proline掺入率）的影响 0.1 molL-1Ang作用24 h 后，AFs胶原合成速率较对照组增加至（175.8819.22）% （P0.01），而3，10，30 molL-1STS处理后能显著抑制Ang诱导的AFs胶原合成速率的增加（P0.01），见图1。XC杨乐-1.TIF与对照组相比1）P0.01；与Ang组相比2）P0.05，3）P0.01（图2，
12、3同）。图1 STS对AFs胶原合成速率的影响（s，n=5）3.3 STS对活性TGF-1及总TGF-1含量的影响 新近研究表明，循环或局部Ang主要通过活化TGF-1而促心房纤维化。因此，为进一步探讨STS抑制Ang诱导心房成纤维细胞胶原含量及胶原合成 速率增加的机制，用ELISA法检测各组活性TGF-1（A-TGF-1）及总TGF-1（T-TGF-1）含量，数据显示Ang 明显上调A-TGF-1表达（P0.01），而对T-TGF-1表达无明显影响，结果与以往报道一致3。STS干预后，A-TGF-1表达明显下调（P0.01），见图2。3.4 STS对TSP-1蛋白表达的影响 研究表明，Ang
13、诱导TGF-1活化的关键因素是血小板反应素-1（TSP-1）。为证实STS抑制Ang诱导TGF-1活化的机制，用免疫印迹法检测各组TSP-1蛋白表达， 数据显示TSP-1表达被STS显著抑制（P0.01），见图3。4 讨论心房颤动（房颤）的发生源于心脏电生理改变和心房结构重塑的共同作用。心房纤维化会引起细胞外基质沉积与降解失衡，以及成纤维细胞的过度增殖 等。早期研究显示心室纤维化会引起心室壁进行性硬化，进而引起心室功能不全和充血性心力衰竭。但随后的研究突出显示了心房纤维化与房颤的关系，与瓣膜病、 高血压和老龄化的关系。调控心房纤维化也成为临床上治疗房颤患者的重要途径7。然而目前用中草药干预这一
14、过程的研究尚少。我国传统中药丹参具有抗缺血缺氧、改善微循环、抑制血小板黏附聚集功能和抗血栓形成作用， 临床上主要用于冠心病的治疗。但其对心肌纤维化的作用报道较少。 本实验用培养的新生大鼠心房成纤维细胞研究丹参的主要成分丹参酮A衍生物STS对Ang诱导心房成纤维细胞胶原合成的影响，发现STS能显著降低Ang诱导的胶原含量及合成合成速率上升，但机制尚未完全明了。研究证明，在心房成纤维细胞，Ang主要通过上调一些促纤维化的生长因子，间接促进纤维化，其中最重要是TGF-1。TGF-1分为活性和非活性2种形式存在，而真正行使促纤维化效应的是活性TGF-1。本研究表明，Ang能上调活性TGF-1水平而对总
15、TGF-1水平没有明显影响，这也与既往研究结果相似，而STS处理后能够明显下调活性TGF-1水平，说明STS正是通过抑制Ang诱导的TGF-1活化而降低胶原合成的。 血小板反应素-1（TSP-1）也称凝血酶敏感素-1，是一个相对分子质量为450 kD 的同源三聚体基质糖蛋白，最初发现于血小板颗粒内，随后被证明可由成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞和单核细胞等多种细胞分泌。研究表明，在Ang活化成纤维细胞TGF-1的机制中，TSP-1起到了非常重要的作用。本研究显示，Ang明显上调心房成纤维细胞TSP-1表达，而STS处理后，TSP-1表达被显著抑制。综上所述，STS能减轻Ang诱导心房成纤维细胞胶原分泌及合成速率，机制与抑制TSP-1/TGF-1通路有关。下一步研究要着重于STS对Ang-TGF-1其他下游分子的影响，如Smads，TGF-激活的蛋白激酶-1（TKA-1）等，进一步阐明STS抗心肌纤维化的机制，为其在临床用于心房纤维化的防治提供实验依据。
