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1、第六章 发酵工艺过程控制,发酵，原本是指在厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成乳酸或乙醇等的分解代谢过程。在广义的工艺上，则把发酵看做是微生物把一些原料养分在合适的条件下（通常是需氧）经特定的代谢转变成产物的过程。发酵是一种很复杂的生化过程，发酵生产受许多因素的影响和工艺条件的制约。需要多年的经验才能掌握。生产菌种的代谢规律和发酵调控的基本知识对稳定生产，提高产量意义重大。,微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来；必须了解有关生产菌种对环境条件的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需求等，并深入了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机
2、制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论基础；通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓度，糖、氮消耗及产物，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度、pH、溶解氧等参数情况，并予以有效地控制，使生产菌种处于产物合成的优化环境中。,第一节 发酵过程中的代谢变化与控制参数,一、发酵工艺过程控制的重要性,从产物形成来说，代谢变化就是反映发酵中的菌体生长、发酵参数的变化（培养基和培养条件）和产物形成速率这三者之间的关系。,二、发酵过程的代谢变化规律,一般来说，微生物的培养方式分为分批发酵、补料分批发酵、半连续发酵及连续发酵四种类型的操作方式。,1、分批发酵,指在一个封闭的培养系统内投入有限数
3、量的营养物质（基质）后接入种子进行培养的发酵方式。即一次性投料，一次性收获产品的发酵方式。在该系统里种子接种到培养基后，除了气体流通外，发酵液始终留在生物反应器内。,延滞期,指数期,稳定期,衰亡期,时间（t）,菌体浓度,分批培养条件下的典型生长曲线,分批培养过程中随着培养基中的营养物质不断减少，微生物生长的环境条件也不断变化，因此，微生物分批培养是一种非稳态的培养方法。,2、微生物分批培养生长速度的动力学方程1942年，Monod提出了在特定温度、pH值、营养物类型、营养物浓度条件下，微生物细胞的比生长速率与限制性营养物浓度之间存在如下关系：=maxS/（Ka+S）max微生物的最大比生长速率
4、S限制性营养基质的浓度Ks饱和常数,Monod方程的几点说明a：分批培养过程的经验方程，在纯培养情况下，只有当微生物细胞生长受一种限制性营养物质制约时，与实验数据相一致。b：Ks反映了微生物对营养物质的吸收的亲和力的大小，数值越小，表明微生物对营养物质的亲和力大。反之则亲和力小。一般微生物的Ks值为0.1120mg/L，是很小的。c：max随微生物的种类和培养条件不同，一般来说细菌的max大于霉菌，就同种微生物来说，培养温度升高，max增大。,3、分批培养时微生物细胞的生长与产物形成的动力学 在发酵过程中，常用得率系数来描述微生物生长过程的特征，即生成的细胞或产物与消耗的营养物质之间的关系。在
5、实际中，最常用的是细胞得率系数（Yx/s）和产物得率系数（Yp/s），分别定义为消耗1g营养物质生成的细胞的克数和生成产物的克数。工业生产中可通过测定一定时间内细胞和产物的生成量及营养物质的消耗量来进行计算。,在分批培养过程中根据产物生成是否与菌体生长同步的关系，将微生物产物形成动力学分为 生长关联型 和 非生长关联型。,A（葡萄糖异构酶）,B（菌体浓度）,B（菌体浓度）,A（杀念珠菌素）,生长关联型,非生长关联型,产物的生成速率与菌体生长速率成正比。这种产物通常是微生物分解基质的直接产物，如酒精，但也有某些酶类，如脂肪酶和葡萄糖异构酶,产物的生成速率与菌体生长速率成无关，而与菌体量的多少有关
6、。,对于生长关联型产品，可采用有利于细胞生长的培养条件，延长与产物合成有关的对数生长期。,对于非生长关联型产品，则宜缩短菌体的对数生长期，并迅速获得足够量的菌体细胞后，延长稳定期，从而提高产量。,（1）有关分批发酵的几点讨论生产的对象不同，掌握工艺的重点不同产物为细胞本身采用能支持最高生长量的培养条件产物为初级代谢物延长对数生长期产物为次级代谢物缩短对数生长期，延长稳定期（2）分批发酵的优缺点优点：操作简单，周期短，染菌的机会减少生产过程易于控制、产品质量易掌握。x 缺点：分批发酵不适于测定过程动力学，存在基质的抑制问题，出现二次生长现象，对与一些对基质敏感的产物，由于养分易耗尽，产率较低。,
7、2、补料分批发酵（fed-batch）,由于此过程只有料液的输入没有输出，发酵液的体积在增加。,补料分批培养（fed-batch culture，简称FBC），是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法，是分批培养和连续培养之间的一种过渡培养方式，是一种控制发酵的好方法，现已广泛用于发酵工业。,可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的影响，改善发酵流变学的性质；可用作控制细胞质量的手段，以提高发芽孢子的比例；可作为理论研究的手段，为自动控制和最优控制提供实验基础。,（1）补料分批培养（FBC）的
8、优点,（2）补料优化方式及控制,连续流加、不连续流加、多周期流加快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加单组分流加、多组分流加,补料方式,流加操作控制系统,直接以限制性营养物浓度作为反馈参数，如控制氮源、碳源、C/N比等，由于目前缺乏能直接测量重要参数的传感器，因此直接方法的使用受到了限制。,、半连续发酵,是指在补料分批发酵的基础上，间歇地放掉部分发酵液（行业中称为带放）的培养方法。,优点：可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾；克服养分的不足，避免发酵过早结束；缓解有害代谢产物的积累。,放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生长旺盛期的菌体丢失前体
9、菌体易变异,缺点,、连续发酵,又称连续流动培养或开放型培养，即发酵过程中一边补入新鲜的料液，并同时以相近的流速放出含有产品的发酵液的培养方法。在这样的环境中培养，所提供的基质对菌的生长就受到限制，培养液中的菌体浓度能保持一定的稳定状态（发酵液的体积不变）。,连续培养系统又称为恒化器，培养物的生长速率受其周围化学环境，即受培养基组分的限制。恒化器：一种微生物连续培养器。它以恒定的速度流出培养液，使容器中的微生物生长繁殖始终低于最快生长速度。这种容器反映的是培养基的化学环境恒定。,连续发酵的缺点：长时间的连续培养难以保证纯种培养，并且菌种发生变异的可能性较大，且易污染杂菌。故在工业规模上很少采用。
10、生产上只有丙酮丁醇厌氧发酵、纸浆液生产饲料酵母、以及活性污泥处理各种废水等才使用连续培养工艺，此方法多数用于实验室以研究微生物的生理特性。,与传统的分批发酵相比，连续发酵有以下优点：维持低基质浓度：可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾；避免培养基积累有毒代谢物；可以提高设备利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间；产物质量比较稳定 便于自动控制。,在发酵工艺中，要想控制发酵，使其按人的意志转移，是很难办到的。因为影响发酵的因素太多，有些因素还是未知的，但了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握反映菌的生理代谢和发酵过程变化的规律，可以帮助人们有效地控制微
11、生物的生长和生产。,第二节 发酵过程的主要控制参数,第二节 发酵过程的主要控制参数,pH值（酸碱度）温度（）溶解氧浓度基质含量空气流量压力搅拌转速搅拌功率粘度,浊度料液流量产物浓度氧化还原电位废气中的氧含量废气中的CO2含量菌丝形态菌体浓度,发酵的一般流程,发酵工艺中几个最常用的控制点,温度控制pH值控制溶氧控制二氧化碳控制泡沫的控制,一、温度对发酵的影响,对细胞生长的影响：温度升高，从酶反应动力学来看，生长代谢加快，但由于酶很容易热失活，所以高温时菌体易于衰老；对产物形成的影响：菌体生长速率、呼吸强度和代谢产物形成速率的最适温度往往是不同的；温度升高，一般产物生成提前；对生物合成的方向的影响
12、：反馈抑制随温度变化而改变；对发酵液物理性质及溶解氧的影响：影响氧的溶解和传递，影响一些基质的分解，间接影响生物合成。,1、影响发酵温度的因素,发酵热的成分生物热：微生物生长繁殖过程中的产热搅拌热：机械搅拌造成的摩擦热蒸发热：被通气和蒸发水分带走的热量辐射热：发酵罐罐体向外辐射的热量Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射,2、发酵热的测定,通过冷却水进出口温度和流量测定：Q发酵=Gcw(t1-t2)/V G冷却水流量；Cw水的比热；V发酵液体积。通过发酵液温度随时间上升的速率测定：Q发酵=(M1c1+M2c2)S M1、c1 发酵液质量、比热；M2、c2 发酵罐质量、比热；S温度上升速率。,3
13、、最适温度选择与发酵温度控制,温度变化的一般规律与控制的一般原则接种后发酵温度有下降趋势，此时可适当升高温度，以利于孢子萌发和菌体的生长繁殖；待发酵液温度开始上升后，应保持在菌体的最适生长温度；到主发酵旺盛阶段，温度应控制在比最适生长温度低些，即代谢产物合成的最适温度；到发酵后期，温度下降，此时适当升温可提高产量。选择是相对的，要考虑培养基成分、浓度；溶氧（温升氧降）；生长阶段；培养条件等。,3、最适温度选择与发酵温度控制最适温度选择,最适温度分最适生长温度和最适产物合成温度，两者往往不同，各阶段可用不同温度。如：青霉素分别为：30和 24.7。青霉素发酵的温度控制0-5h：30C5-40h：
14、25C40-125h：20C125-165h：25C,4、最适温度选择与发酵温度控制发酵温度控制,进行温度控制时应考虑的因素不同菌种在不同生长阶段的生长和生产特性参考其它发酵条件（通气、培养基成分和浓度、pH值等），如通气条件差时，则最适发酵温度比通气良好时低。,4、最适温度选择与发酵温度控制发酵温度控制,温度控制的方法冷却是主要的方法，通常是利用发酵罐的热交换装置进行降温，如果气温较高，冷却水温度也较高时，多采用冷媒(盐水)进行降温。发酵罐的热交换装置：罐外夹套罐内蛇管、列管,二、pH值对发酵的影响及控制,发酵液pH对菌体生长、繁殖和产物积累影响较大。生产前应进行试验和研究。菌体生长、繁殖和
15、产物积累的最适pH不一定相同。整个发酵过程的pH是变化的。1、pH对发酵的影响 2、影响发酵pH的因素 3、最适pH的选择和调节,1、pH对发酵的影响,微生物生长最适pH值范围 不同的微生物具有不同的最适生长的pH值和忍受的上下限 细菌（6.5）7.0-8.0；放线菌（6.5）7.5-8.5；产物形成最适pH值范围 微生物的生长和产物形成的最适pH值往往不同。少数一致，大多不同；有的偏高，有的偏低。,几种抗生素生物合成的最适pH值链霉素（灰色链霉菌）、红霉素：6.87.3金霉素（放线菌）、四环素（放线菌金色链丛菌）：5.96.3青霉素：6.56.8 柠檬酸：3.54.0,同一种微生物在其不同的
16、生长阶段和不同的生理生化过程中，对pH值的要求也不同。举例：Aspergillus niger在pH22.5范围时有利于合成柠檬酸，当在pH2.56.5范围内时以菌体生长为主，而在pH7.0时，则以合成草酸为主。丙酮丁醇梭菌在pH5.57.0范围时，以菌体生长为主，而在pH4.35.3范围内才进行丙酮丁醇发酵。微生物 生长最适pH 合成抗生素最适pH灰色链霉菌6.36.96.77.3红霉素链霉菌6.67.06.87.3产黄青霉6.57.26.26.8金霉素链霉菌6.16.65.96.3龟裂链霉菌6.06.65.86.1灰黄青霉6.47.06.26.5,生长的最适pH值与发酵的最适pH值,1、p
17、H对发酵的影响,pH对微生物生长和产物形成影响的原因：pH值影响菌体形态，如壁厚薄、长径比；pH值改变使原生质膜电荷发生改变，影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的排出；pH值直接影响酶活性；pH值影响某些重要营养物质和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用。pH影响生物合成的途径。如：黑曲霉pH=2-3时产柠檬酸；近中性时产草酸、葡萄糖酸。,2、发酵过程pH值的变化,在发酵过程中，随着菌种对培养基碳、氮源的利用，随着有机酸和氨基酸的积累，会使pH值产生一定的变化。,1、生长阶段：相对于起始pH值来说有变化。菌体产生蛋白酶水解培养基中的蛋白质，生成铵离子，使pH上升至碱性；随着菌体量
18、增多，铵离子的消耗也增多，另外糖利用过程中有机酸的积累使pH值下降。2、生产阶段：这个阶段pH值趋于稳定。3、自溶阶段：随着养分的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中氨基氮增加，致使pH又上升，此时菌体趋于自溶而代谢活动终止。,pH值,培养时间,培养过程中培养液pH值的大致变化趋势,由此可见，在适合于菌生长及合成产物的环境条件下，菌体本身具有一定的调节pH的能力，但是当外界条件变化过于剧烈，菌体就失去了调节能力，培养液的pH就会波动。,3、影响发酵pH的因素,影响pH值的因素：培养基成份、微生物代谢特性决定发酵过程的pH变化。（综合反映）此外，通气状况的变化，菌体自溶和杂菌污染都可能引起发酵液pH
19、的变化。微生物改变培养液pH以适合自身生长的能力很强。发酵液的实际pH是“成分”和“途径”的统一。确定和有效控制pH在菌体生长或产物积累的最适范围是高产的保证。,3、影响发酵pH的因素,生理碱性物质和生理酸性物质生理碱性物质：经微生物代谢后，导致pH上升（碱性物质生成或酸性物质消耗）的物质。如：有机氮源，硝酸盐，有机酸。（产NH3、NaOH）生理酸性物质：经微生物代谢后，导致pH下降（酸性物质生成或碱性物质消耗）的物质。如：糖类（产有机酸），脂肪（产脂肪酸），铵盐（氧化产硫酸）。,4、最适pH的选择和调节,最适pH的选择和调节的原则：既有利于菌体的生长繁殖，又可最大限度的获得高产。根据不同微生
20、物的特性，在发酵过程中随时检查pH 值的变化，选用适当的方法进行调节。生长最适pH和产物形成最适pH的相互关系：两者相同，范围都宽；容易控制。两者相同，范围都窄；必须严格控制。两者相同，范围一宽一窄；必须严格控制。两者不同，范围都窄；分别严格控制。,4、最适pH的选择和调节,选择pH值的方法：通过实验确定。配制并始终调节控制不同pH，检出菌体或产物最大值。调节pH值的方法：主要考虑培养基中生理酸、碱性物质的配比；补料调节：调节通气量、调整盐类、氮源、碳源的配比平衡；如：青霉素生产的葡萄糖补加控制pH。（按需补糖比恒速补糖效果好。）添加弱酸或弱碱、加缓冲剂。（一般效果不好）,三、溶氧对发酵的影响
21、,氧是制约发酵进行的重要因素氧难溶于水，培养基中贮存的氧量很少；【25 在水中的溶解度0.25mmol/L，在发酵液中则更低28时，饱和浓度7mg/L左右】高产株和加富培养基的采用以及发酵周期的缩短 加剧了对氧的需求；形成产物的最佳氧浓度和生长的最佳氧浓度有可 能是不同的；发酵罐中氧的吸收率很低；（多数 2%；通常 1%）加大通气量会引起过多泡沫；消泡剂不利于氧的溶解。,目前的发酵工业氧的利用率是很低的。在抗生素发酵中，被微生物利用的氧不超过空气中含氧量的2%，即使是利用率高的谷氨酸发酵，也不过10%30%，大量的无菌空气被浪费掉。,1、氧的传递和传质方程式,氧传递的阻力：气相到气液界面；气液
22、界面；通过液膜；液相；细胞或细胞团表面液膜；固液界面；细胞团内；细胞壁；反应（生化）阻力。从空气泡到细胞内总阻力为上述阻力之和。即1/kt=1/kG+1/kI+1/kL+1/kLB+1/kLC+1/kIS+1/kA+1/kW+1/kR液相主体到细胞壁，氧的浓度差很小。（细胞不结团时，壁氧的浓度与液膜接近）。,1、氧的传递和传质方程式,氧传递的总推动力：气相与细胞内的氧分压差和浓度差。减小阻力方法：液膜，气液混合所生湍动；细胞团表面液膜，搅拌减小外径，减少阻力；细胞团内阻力和壁阻力，搅拌减少逆向扩散梯度；反应阻力，培养基成分，培养条件，产物移去。,1、氧的传递和传质方程式,气液相间的氧传递和氧传
23、质方程式。（氧分压和浓度变化图7-7）氧传递的主要阻力存在于气膜和液膜中。单位体积培养液中的氧传递速率：OTR（dc/dt）=KLa（C*-CL）a比表面积；KL以氧浓度为推动力的总传递系数（氧传质系数）C*气液平衡的液相氧浓度（应有）；CL液相主体氧浓度（存在）。,气液相间的氧传递和氧传质方程式,培养物处于充裕的通气情况下，CL会逐渐接近C*，氧传递速率渐小；而处于不充裕的通气情况下，CL下降趋于0，氧传递速率最大。（C*-CL推动力）,2、影响微生物对氧需求的因素,不同微生物对氧的需求不同，其耗氧速度用呼吸强度（比耗氧速率）来表示：CL QO2=(QO2)m(当氧是限制性基质时)K0+CL
24、(QO2)m最大比耗氧速率；CL溶解氧浓度；K0氧的米氏常数。各种菌的K0和(QO2)m有定值（表7-3；表7-4）。,影响微生物对氧需求的因素,菌的呼吸强度与菌种种类K0，(QO2)m和培养液中溶解氧浓度有关。CL增加，QO2 增强；直至达到 CL/（K0+CL）1 临界值，再不加大。如：图7-8。,2、影响微生物对氧需求的因素,摄氧率：单位体积培养液，在单位时间内耗氧量。r=QO2X X细胞浓度。氧的满足度：溶解氧浓度与临界氧浓度之比。产物形成的最佳氧浓度有时与细胞生长最佳氧浓度不同，需氧量差别较大，各有不同。,影响微生物摄氧率的因素,菌种；溶解氧浓度；细胞浓度；培养基成分和浓度：如：碳源
25、，利用速度不同摄氧率不同；pH；温度：温度高，临界值增高；有毒物积累。抑制呼吸；挥发性中间物（有机酸），加强。,3、培养基的流变特性,培养基的流变特性影响：动量、热量、质量传递，继而影响各种发酵条件。如：溶氧速率、气体交换、发酵温度、营养物补充、PH值的调节等。培养液是 一多相体系，由液相、固相（菌体，不溶性培养基组分）和气相构成。,牛顿流体和非牛顿流体,牛顿型流体：服从牛顿黏性定律，黏度只是温度的函数，与流变状态无关。即发酵罐中任何局部黏度相同，与搅拌速度、半径无关。（清细菌、酵母液）非牛顿型流体：不服从牛顿黏性定律，其黏度不仅受温度影响，而且随流动状态而异。可分为几种类型的流体。与切变率r
26、有关。（放线菌、霉菌、高浓度细菌、酵母培养液）,非牛顿流体的搅拌功率,罐中非牛顿流体的平均切变率与搅拌速 度成正比。_ 平均切变率 r=k N k无因次常数 N搅拌器转速 对不同的非牛顿流体，采用不同型式和大小的搅拌器，k值一般在10-13之间。在发酵过程中，培养液的黏度系数K、流变特征指数n表现出时变性。,4、影响供氧的因素,由氧传质方程式：OTR=KLa（C*-CL）可知，以下因素影响氧传递速率：（1）影响KL的因素；（2）影响推动力（C*-CL）的因素。,（1）影响KL的因素,搅拌：搅拌的作用是把通入的气体打碎气泡变小，增大气液相接触面积；延长汽泡在液体中的停留时间；增加湍动程度，减小气
27、泡外液膜厚度，减小阻力；使培养基成分和细胞均匀分布，利于营养物吸收，代谢物扩散。搅拌比通气速度对KL的影响更明显。,通气效率还与罐体积（越小越好）、罐形状、结构、搅拌器形式、挡板有关。而通常发酵装置采用的机械搅拌的方式是普通提高溶氧系数的行之有效的方法但搅拌速度过高，会对细胞造成损伤，并会增加传热的负担。,（1）影响KL的因素,空气流量：供氧，带走废气。KLa随空气流量增加而增加，但有限度。如超过限度，搅拌器在空气泡中空转，不能分散空气，搅拌功率下降。气沿轴逸出。,（1）影响KL的因素,培养液性质的影响：微生物生长繁殖和代谢可引起发酵液密度、黏度、表面张力、扩散系数的变化。这些性质的变化都会影
28、响KLa值。如：黏度增大，滞留液膜厚度增加，传质阻力增大；同时黏度影响扩散系数，使通气效率降低。综合操作条件和流体性质对KL的影响，有：KL表面张力、黏度、离子浓度、密度等),（1）影响KL的因素,微生物生长的影响：细胞浓度增加，KLa值变小，细胞浓度相同时，如球状菌菌悬液的KLa值是丝状菌悬液KLa值的两倍。（流动特性，稠度差别较大）,（1）影响KL的因素,消沫剂的影响：消泡剂的油脂等具有亲水基团和疏水端分布于气液界面，增大传递阻力，使KL下降（虽使a 增大）。产生泡沫原因多样，其中发酵性泡沫氧低，CO2高，不易破，“逃液”。消沫剂虽然使KL下降，但最终会有 效的改善发酵液的通气效率。（消泡
29、沫的重要手段）,（1）影响KL的因素,离子强度的影响：气泡在电解质溶液中，比在水中小很多，a较大，KLa值也比水大。并随浓度增加而增大。丙酮、乙醇、甲醇等有机溶剂也有类似情况。,综上，KL和a两个系数常以乘积的形式一起应用，俗称为“通气效率”可用来衡量发酵罐的通气状况。高值表示通气条件富裕；低值则表示通气条件贫乏。,（2）影响推动力的因素,提高推动力实际上是增加氧的饱和度C*。影响因素有：温度：常压下，随温度升高而降低。溶质的影响：随浓度增加氧饱和度下降。电解质，因盐析作用而降低；有机溶液，升高。罐压：罐压增加，溶解氧浓度增加，但CO2也增加且更快。不利于液相中CO2排出。对细胞渗透压有不利影
30、响。纯氧：富氧通气、溶解氧增加。但生产成本提高，不够经济。,5、液相体积氧传递系数KL的测定,常握供氧，需氧情况，要测定：溶解氧浓度，摄氧率和液相体积氧传递系数KLa。1.摄氧率的测定：先用纯水标定电极，得单位电流值代表的溶解氧浓度；测定时、关气、除气、保持搅拌；细胞耗氧，培养基氧降，电流值降，摄氧率 r 求出。,5、液相体积氧传递系数KL的测定,2.液相体积氧传递系数KLa的测定：可用直接测定法，动态测定法。用复膜氧电极测定，停气、N气、除气，保搅拌；溶氧下降，到呼吸临界氧浓度时，恢复通气。溶解氧浓度为纵坐标，测定时间为横坐标。制得曲线，其斜率=-1/KL；延长线与纵轴的截距为C*。,6、控
31、制溶氧的工艺手段,（1）改变通气速率改变通气速率主要是通过变化KL来改变供氧能力。有2种情况：A：在低通气量的情况下，增大通气量对提高溶氧浓度有十分显著的效果B:在空气流速已经十分大的情况下，再增加通气速率，作用便不明显。反而会产生某些副作用。如：泡沫的形成，水分的蒸发、罐温的增加、以及杂菌几率增加等,（2）改变搅拌速度一般说来，改变搅拌速度的效果要比改变通气速率大，原因是A:通气泡沫被充分破碎，增加有效气液接触面积B：液流的滞流增加，气泡周围液膜厚度和菌丝表面液膜厚度减小，并延长了气泡在液体中的停留时间，因而就较明显地增加了KL提高了供氧能力。,（3）改变气体组成中的氧分压 用通入纯氧的方法
32、来改变空气中氧的含量，提高了C*,因而提高了供氧能力。纯氧成本高，但对于某些发酵需要时，如溶氧低于临界值时，短时间内加入纯氧是有效而可行的。这种方法在实验室动植物细胞培养中已被采用,（4）改变罐压改变罐压，实际上就是改变氧的分压来提高C*，从而提高供氧能力，但是通常不是一种高效方法因为：A：提高罐压就要相应的增加空压机的出口压力，增加了动能消耗B:发酵罐的强度也要相应增加C：提高罐压后，产生的CO2溶解量也要增加，会使发酵液的pH值发生变化，对菌体生产是极为不利的。,（5）改变发酵液的理化性质如果培养基的性质是限制氧传递的因素时，要根据具体的状况对培养液的某一物理性质加以改造：如加入消泡剂、补
33、加无菌水、改变培养基的成分等都可以改善通气效果，以适应菌的生长和生产。,（6）加入传氧中间介质,近年来通过中间介质的加入来提高生物应用的传氧系数已引起了注意。这些传氧介质一般是不溶于培养基的液体，呈乳化状态来提高气液相之间的传递。在气液相之间起到了氧传递的促进作用A：血红蛋白 B：烃类碳氢化合物（煤油、石蜡、甲苯）C:含氟碳化物,四、二氧化碳对发酵的影响及控制,二氧化碳的来源：是微生物的代谢产物，也是某些合成 代谢的一种基质。二氧化碳对发酵的影响：1、对菌体；2、对产物。,例如，在产黄青霉的生长和产物形成中的CO2来源菌体生长：菌体维持：青霉素生产：,二氧化碳对发酵的影响,1、对菌体：CO2效
34、应：在发酵生产中不同微生物或某一生长阶段对二氧化碳有着特殊的要求（促进或必须）；通常对菌体生长有抑制作用。排气中高于4时，糖代谢和呼吸速率下降。2、对产物：需占一定的比例（或分压），过高、过低产量都会下降；CO2对某些发酵产生抑制作用。如：抗生素，组氨酸等；二氧化碳可通过改变pH而影响发酵生产。,原因：CO2作用膜脂质核心部位，改变膜流动性及表面电荷密度，影响膜运输效率，导致细胞生长受限制，形态改变；（HCO3-影响细胞膜的膜蛋白）也可产生反馈作用，使PH下降，与其他物质反应，与生长必需金属离子形成碳酸盐沉淀，过分耗氧，引起溶解氧下降等，影响菌体生长和产物合成。,发酵液中CO2浓度的影响因素：
35、细胞呼吸强度；发酵液流变学特性；通气搅拌程度；罐压大小；设备规模。二氧化碳浓度的控制方法：调节罐压、通气量和搅拌速度；补料。（青霉素：补糖，增加CO2 产生，降低PH。）,呼吸商与发酵的关系,呼吸商：发酵过程中二氧化碳的释放率（CER）与摄氧率（OUR）的比值称为呼吸商。也即呼吸作用所释放的CO2和吸收的O2的分子比。,糖类：当其完全氧化分解时，氧只用于与碳形成二氧化碳，也就是说每释放m摩尔CO2需吸收m摩尔O2，故呼吸商为1。脂质：完全氧化分解时，由于其分子中氢对氧的比例较糖分子中高，氧既需用于碳氧化，也要用于与氢氧化，需消耗较多的氧，故呼吸商小于1（0.70.8）在低氧的条件下，由于生物体
36、内存在无氧呼吸，特别是以糖类做为呼吸底物时，呼吸商明显会大于1。因此生物体呼吸作用类型的不同，在一定程度上也影响呼吸商数值的大小。另外，如果呼吸底物是机酸，因其相对含氧量高，呼吸商也会大于1。,五、泡沫对发酵的影响及控制,泡沫产生的原因泡沫过多对发酵的危害泡沫的消长规律泡沫的消除和防止,1、泡沫产生的原因,充气产生泡沫微生物代谢气体形成泡沫泡沫的产生与培养基性质有关（蛋白质原料、蜜糖水解原料，淀粉水解不完全时易发泡）,2、泡沫过多对发酵的危害,使装量减少，或造成跑液，使产量降低；通过轴封泄漏，污染设备，增加染菌机会；菌体粘附罐顶、罐壁，发酵液中菌体量减少；影响通气搅拌的进行，造成减产或菌体提前
37、自溶；菌体提前自溶会促使更多泡沫形成，恶性循环；减风量，影响溶解氧浓度，影响生长、代谢；加消泡剂，给提取工艺带来困难。,3、泡沫的消长规律,通气和搅拌：随通气和搅拌增加而增加，搅拌比通气影响大；培养基原料性质：蛋白胨、玉米浆、花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉等蛋白质原料是主要发泡物质；,培养基灭菌方法：温度过高，形成蛋白黑色素，5羟甲基糖醛，泡沫增多；细胞代谢活动：初期，高粘度、低张力，泡多；中期，粘度降、张力升，泡少；后期，自溶，泡沫上升。,4、泡沫的消除和防止,消泡方法：改变培养基成份，减少通气，选育新生产种化学法：添加消泡剂（油类等），应用面广机械法：靠机械强烈振动，压力的变化，使 气泡破裂，
38、或借助机械力将排出气 体中的液体加以分离回收,4、泡沫的消除和防止,化学消泡法机理：由于消泡剂本身的表面张力较低，当其与气泡膜表面接触时，使气泡膜局部的表面张力降低，从而使气泡破裂。消泡剂的特点：是表面活性剂，具有一定的亲水性，溶解度较小，无毒，不干扰溶氧、pH值等测定仪表的使用，来源广，价廉。缺点：1、消耗多种油类或化工原料；2、使发酵液中氧的吸收减少1/5-1/3。,4.化学消泡法,A.消泡剂的作用：降低泡沫液膜的机械强度；降低液膜的表面黏度；兼有两者的作用，达到破裂泡沫的目的。,B.作为生物工业理想的消泡剂，应具备下列条件：应该在气液界面上具有足够大的铺展系数，才能迅速发挥消泡作用，这就
39、要求消泡剂有一定的亲水性；应该在低浓度时具有消泡活性；应该具有持久的消泡或抑泡性能，以防止形成新的泡沫；应该对微生物、人类和动物无毒性；应该对产物的提取不产生影响；不会在使用、运输中引起任何危害；来源方便，成本低；应该对氧传递不产生影响；能耐高温灭菌。,C.常用的消泡剂有4大类：天然油脂类高级醇类聚醚类硅树脂类以天然油脂类和聚醚类在生物发酵中最为常用。,豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和猪油等。油不仅用作消泡剂，还可作为碳源和发酵控制的手段。在发酵中，要控制油的质量、新鲜程度，并要进行发酵试验检验。,聚醚类消泡剂品种很多，它们是氧化丙稀或氧化丙稀和环氧乙烷与甘油聚合而成的聚合物。聚氧丙稀甘油（GP
40、型）氧化丙稀和甘油聚合；亲水性差，在发泡介质中的溶解度小，所以用于稀薄发酵液中要比用于粘稠发酵液中的效果好；抑泡性能比消泡性能好，适宜用于基础培养基中，以抑制泡沫的产生。聚氧乙烯氧丙稀甘油（GPE型，泡敌）氧化丙稀、环氧乙烷与甘油聚合；亲水性好，在发泡介质中易铺展，消泡能力强，作用快，溶解度大，消泡活性维持时间短，用于粘稠发酵液的效果比用于稀薄的好。,化学消泡剂的应用,主要取决于该消泡剂的消泡性能和扩散能力，还与加入量和加入时机有关。生产上常用以下方法：（1）借助某些载体和机械作用使消泡剂更易于在发酵液中进行分散。同时载体的使用能产生明显的增效作用：如当用聚丙烯甘油作消泡剂时，以豆油为载体的消
41、泡增效作用非常明显。,（2）多种消泡剂并用可增强消泡效果：如用0.5%-3%的硅酮、20%-30%的植物油、5%-10%的聚乙醇二油酸脂、1%-4%的多元醇脂肪酸组成的混合消泡剂有明显的消泡增强效果（3）利用乳化剂增强消泡剂的消泡效果，如与吐温80-作为乳化剂可增强聚氧丙烯甘油的消泡效果12倍。,4、泡沫的消除和防止,机械消泡优点：节省原料、减少了染菌机会缺点：不能从根本上消除引起气泡的原因，不如化学消泡迅速可靠，需设备，耗能。机械消泡装置的选择依据：动力小、结构简单、坚固耐用、清洁（杀菌）容易、维修（保养）费用少,4、泡沫的消除和防止,机械消泡方法罐内消泡：在发酵罐内消除泡沫耙式消泡桨、碟式
42、消泡器等罐外消泡：将泡沫引出发酵罐外，消泡后再 返回罐内旋转叶片消泡器、离心式消泡器等,4、泡沫的消除和防止,耙式消泡桨,4、泡沫的消除和防止,碟片式消泡器（罐顶）优点：消泡能力强，功耗小缺点：结构复杂，维护麻烦,马达,泡沫,液体,4、泡沫的消除和防止,旋转叶片罐外消泡,4、泡沫的消除和防止,离心力罐外消泡（分散法）,*、中间控制补料,补料的内容补充能源和碳源补充氮源补充微量元素和无机盐补充诱导酶的作用底物补料的原则：根据微生物的生长代谢与生物合成规律，控制微生物的中间代谢，使之向有利于生产的方向发展。,中间控制补料,补料中应注意的问题选择合适的补料的时机、方式和控制指标料液的配比要恰当（如C
43、/N等）注意对培养基性质的改变（如pH值等）加强无菌控制经济、节约,六 发酵终点的判断,要确定一个合理的放罐时间，需要考虑下列几个因素：一、经济因素二、产品质量因素三、特殊因素,以最低的成本来获得最大生产能力的时间为最适发酵时间。,在正常情况下，可根据作业计划，按时放罐；在异常情况下，如染菌、代谢异常（糖耗缓慢等），就应根据不同情况，进行适当处理，以免倒罐。为了能够得到尽量多的产物，应该及时采取措施（如改变温度或补充营养等），并适当提前或拖后放罐时间。,判断放罐的指标：产物浓度、过滤速度、菌丝形态、氨基氮、pH、DO、发酵液的黏度和外观等。一般，菌丝自溶前会出现一些迹象：如氨基氮、DO和pH值
44、开始上升、菌丝碎片增多、黏度增加、过滤速度下降等。对于绝大多数抗生素类，放罐时间掌握在菌丝自溶前，以便胞内抗生素释放出来。总之，发酵终点的判断需综合多方面的因素统筹考虑。,第三节 发酵过程检测与自控,电子计算机的使用，为发酵过程的检测和自控注入了巨大的活力。,检测方法：物理测量（如温度、压力、体积、流量等）物理化学测量（pH值、溶氧、溶CO2、氧化还原电位、气相成分等）化学测量（基质、前体、产物等的浓度）生物学和生物化学测量（生物量、细胞形态、酶活性、胞内成分等）,发酵过程自控是根据对过程变量的有效测量及对过程变化规律的认识，借助于由自动化仪表和电子计算机组成的控制器，操纵其中一些关键变量，使
45、过程向着预定的目标发展。,包括：,和过程的未来状态相联系的控制目的或目标（如要求控制的温度、pH值、生物量浓度等）；一组可供选择的控制动作（如阀门的开、关，泵的开、停等）；一种能够预测控制动作对过程状态影响的模型（如用加入基质的浓度和速率控制细胞生长率时需要能表达它们之间相关关系的数学式）。,这三者相互联系、相互制约，组成具有特定自控功能的自控系统。,一、状态参数指能反映过程中菌的生理代谢状况的参数，如pH、溶氧、CO2、尾气O2、黏度、菌浓等。应用的探头必须耐反复的高温蒸汽灭菌。或可伸缩的探头二、间接参数指通过基本参数求得的，如摄氧率（OUR）、KL、呼吸商（RQ）等。三、离线发酵分析 目前
46、的发酵液中的基质、前体和代谢产物的分析都依赖于人工取样和离线分析，见表7-16.,计算机控制技术在发酵工业中的应用,工业生产发酵过程控制系统,可用于发酵过程营养剂补加控制、消沫控制以及对发酵过程中温度、罐压、PH值、供气量等参数的控制。系统用于抗生素、VC、VB、酶制剂、酵母、味精等发酵生产过程控制。,在线监测图示,我国是发酵工业大国,但目前我国发酵工业的控制技术还比较落后,在工业生产中仍以人工控制为主,采用计算机控制技术起步较晚,普及率太低。“七五”末期,首先在青霉素发酵过程中进行试验,并取得了良好的效果。“八五”期间又陆续在土霉素、洁霉素、维生素C等产品中推广应用,经济效益十分显著。统计资
47、料表明,我国青霉素发酵单位“七五”期间在25000U/m1左右徘徊,由于采用计算机发酵过程控制技术和菌种的改进,到“八五”期间已经突破5000U/m1大关。仅华北制药厂、哈药总厂与“七五”期间相比,年纯增经济效益超过3000万元。“十五”期间,国家医药管理局仍然把发酵生产过程采用计算机控制技术列为推广工作的重点。,FK型发酵过程控制系统,1主要技术参数检测参数:发酵温度、消毒温度、通气流量、罐压力、发酵液体积、PH值、溶解氧分子含量、尾气中的二氧化碳和二氧化碳含量、搅拌速度等,以及公用工程参数检测。控制参数:发酵温度控制、发酵液PH值控制、营养剂流加控制、消沫防逃液控制、通气流量控制、罐顶压力
48、控制、连消控制等。,2系统的构成 发酵过程控制系统采用三级管理,也可只取二级管理系统。在该系统中,自成一个二级管理的控制DCS系统,监控站用于对全车间发酵罐群的集中检测与参数给定控制,并对各罐发酵参数集中显示和存储。监控站配有51厘米彩色CRT、点阵打印机和彩色喷墨打印机(PRN)。针式点阵打印机用于各种数据表格打印,彩喷用于显示彩色画面拷贝。主要画面括概貌画面,分组画面,单元画面,报警画面,动态流程画面,实时趋势画面和历史趋势画面等。,3与发酵控制系统配套的仪表,(1)补料控制器 补料控制器主要是为了解决发酵过程中由于料液清洁度、粘度和高温灭菌等因素,使用常规的流量计与调节阀反馈控制难以保持
49、正常工作状态,特别是无法克服发酵过程染菌的问题而设计的。采用了计量罐与开关阀控制的方法。其工作原理是:根据计量罐体积和补料速率计算出补一罐营养剂的周期,通过改变补一罐料液的周期来改变补料速率。例如:选用1升罐体,设定补料率为100升/小时,在计算机控制下,把1小时分成100个等间隔时间,分别在此时间内流加一罐营养剂,即每36秒钟补加一罐营养剂。,3与发酵控制系统配套的仪表,(2)FX防污染消沫控制器 在发酵工业生产中,经常拌随着泡沫的产生,当泡沫增多时,除了给发酵带来很多不利因素,还会出现逃液,给生产带来直接的经济损失。发酵过程中,消沫控制是不可缺少的工作。目前在国内发酵工业中,均采用电阻式单
50、电极测量原理的消沫控制,在一般正常工作条件下来达到消沫目的。但在使用过程中,由于污染结垢而引起电极绝缘性能下降,在电极表面产生泄漏电流,造成电极呈短路状态,引起控制失灵,产生误动作,造成过量加入消泡剂,同样给生产造成损失。,FX防污染消沫控制器采用双电极式电阻测量原理,其中一个敏感电极用于探测液位,另一个保护电极用于抵消污垢产生的泄漏电流;有效地避免了因污染造成的误动作。该控制器在系统中配套使用效果良好。,三、传感器和执行器,发酵过程控制系统是一个机电一体化的控制系统,在系统中,计算机是核心和纽带,就工业现场应用而言,系统成败的关键却在传感器与执行器上。特别是执行器,如果满足不了防污染、不染菌
