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1、噬菌体展示技术,一、定义,噬菌体展示技术(Phage Display Techniques,PDT)是一项筛选技术，将 外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表 达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的 DNA则位于 病毒粒子内。使大量多肽与其DNA编码序列之间、表型与基因型之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。,表型基因型展示肽编码基因,二、发展简史,Smith 在 1985 年首次证实外源 DNA 可以插入丝状噬 菌体基因 III 中，并与 pIII 蛋白融合展示。Smith GP.Science 1985;228:1315-7
2、,1985 第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽Smith GP.Science.1985;228:1315-71988 噬菌质粒系统1990 抗体片段的展示1993 展示cDNA文库1994/1995 研发了phage two-hybrid技术1996 首次体内in vivo 淘选试验1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体1999 Combination of phage display with high-density arrays2001 Automated phage display selectionKilling cancer cells by targeted drug-car
3、rying phage nanomedicines Published:3 April 2008 BMC Biotechnology 2008,8:37 doi:10.1186/1472-6750-8-37,三、噬菌体展示的基本原理,基本原理 在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。,利用靶分子，采用适当的淘洗方法（亲和洗脱扩增亲和的循环步骤），洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体
4、DNA 序列测序出来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来，为生物科学提供高效而实用的研究手段。,四、噬菌体表面展示的步骤,不同基因分别被插入噬菌体基因组中分离纯化的噬菌体只是展示一个蛋白，多肽或者抗体。收集所有的噬菌体就构成一个文库将噬菌体文库与靶蛋白相互作用，筛选能与靶蛋白相互作用的噬菌体,目前，能用于蛋白质/多肽展示的噬菌体系统有丝状噬菌体展示系统、噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统。其中丝状噬菌体展示P系统单价展示，可以筛选高亲和力配体，P系统拷贝数高，利于疫苗的研制，但丝状噬菌体分泌释放，不易展示大分子蛋白；噬菌体展示和T4噬菌体展示系统容
5、量大，拷贝数高，但不易筛选高亲和配体；T7展示系统可以高、中、低拷贝地展示不同分子量的蛋白质，是目前最为理想的展示系统。,五、噬菌体展示技术的应用现状,噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术模拟了机体免疫系统的选择作用，呈现在噬菌体表面的抗体能够在体外用固相化抗原进行筛选，同时由于噬菌体对大肠杆菌的感染性，噬菌体抗体库技术能够以淘筛的方式，为快速选择特异性抗体提供简便而高效的操作系统。,疫苗：与传统的质粒DNA疫苗相比,利用噬菌体展示技术研制基因工程疫苗具有独特的优势：噬菌体传递的DNA 疫苗诱生的抗体应答持续时间更长,滴度更高；噬菌体有强的免疫原性，是天然的免疫佐剂；噬菌体疫苗在对核酸酶的稳定性
6、方面的优势明显，而且噬菌体疫苗能直接靶向抗原提呈细胞，使用比质粒DNA疫苗低得多的剂量就能诱发很好的免疫效果。,3.多肽类药物：如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一13 肽，它能中和蛇毒-bungarotoxin；从CX7C 多肽库中掏选到一个多肽能与 Hantavirus 结合，并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管促生素（angiogenin）是一种能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促生素的活性；等等。,肿瘤药物导航载体：用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库中淘选到的多肽或单链抗体，可以作为抗癌药
7、物的定向输送工具。一个成功的实例是：将噬菌体多肽展示库注射入具有肿瘤的小鼠体内，然后杀死小鼠，取出肿瘤，再将结合其上的噬菌体洗脱下来。展示在其上的多肽具有与该肿瘤的特异性亲和力。将此多肽与细胞毒素 doxorubicin 偶联。结果显示，此偶联物具有更强的抑制肿瘤的效果.,5.信息传递研究:利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个 Hantaviral 受体；受体的配体，如血管促生素、-bungarotoxin，和一些大蛋白分子中的折叠区域，如SH2、SH3 和 WW 区域。从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的多肽,因此用完整细胞
8、可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。,6.DNA结合蛋白：锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物，这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的 锌指的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干扰病毒感染生活周期。,7.蛋白质组学：噬菌体展示技术作为一个多
9、肽和蛋白质合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其有特异结合力的多肽和蛋白质，其构建的文库的滴度可达1012。蛋白质组学的基本点就是利用蛋白质-蛋白质的相互作用，对成千上万种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术正好能符合这种要求。例：将噬菌体展示cDNA 文库制成蛋白点阵，成功的应用于寻找与过敏症有关的蛋白质。,目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响。,噬菌体展示技术的优势,噬菌体展示技术最关键的优势有
10、：第一，淘选的高效率使得在极低的存在 水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。,噬菌体展示技术的局限性,（1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。目前，常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在109。（2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。例如，在噬菌体展示文库试验中，由于部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须小心控制条件，以保证在噬菌体表面展示的文库没有降解。另外，鼠源抗体在噬菌体中表达差，也是体内选择压力的一个例子。真核细胞蛋白在细菌中表达差是因为它们的蛋白质合成与折叠机制不同的缘故。（3）噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。（4）由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。,谢谢！,再见！,
