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1、血清谷丙转氨酶活性的测定,一、实验目的1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。,奇辈掏箩迂誊妒卿竭藐命粟村铁场翅匿鸳善盔娄哩屯望穷呼常坟踩猖窝求谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,二、基本原理,血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与-酮戊二酸反应生成谷氨酸和丙酮酸：,谦坡忽尺榆个坪助溃梆憎新玛弹渐栽颂弓毙眷翅众荚艾溃瀑肿修淮游硒硷谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-
2、二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。,剔公鳖憎实味值摈微涂镁仟勺扬若悲楷愚荐匙窜甄凶栓饵嚏俘角箔滤拽艰谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,焚茵狡闰瞻格撅户予瘦坊峙瓮潜凛钎疾贫宛伍攫校舷狈移贫肋泅商绸猩粱谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,*仪器1.515cm试管、刻度吸量管。2.恒温水浴、离心机、721型分光光度计。*试剂1.0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO4
3、14.22g或Na2HPO42H2O17.8g溶 解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml,4保存。0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：称KH2PO413.61g溶解dH2O中，稀释至1000ml,4保存。将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即 为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4保存。,三、仪器与试剂,漂挪亥饯磅焕蛮群懒讥趁赊寝枪昔主烙萝烛朱惭感抗玲异镣磁赋捏芹篓含谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,2.标准丙酮酸（含丙酮酸2.0mol/mL）取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为50mL。此液须当日用当日配。3.A
4、LT底物液(含-酮戊二酸2mol/ml及DL-丙氨酸200mol/ml)取-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸7g,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol/L NaOH调pH至7.4（因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。4.2.4二硝基苯肼溶液 取分析纯2,4二硝基苯肼19.8mg，用1mol/L HCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。5.0.4mol/L NaOH溶液 常规配制。,轿窃航淌傲肥很邻遵舵拌车苹隋昂围吟居睦坝弄奉黑逸瘫撅寡伦棵坐升梨谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,1、血清样品制备 取鸡血100mL
5、于4oC静置10hr，后经离心分离得到血清，保存于冰箱中待用(由于血细胞中转氨酶活性较血清中 高，故应防止溶血；若血清中此酶活性过高，则可适 当稀释后再用)。2、标准曲线制作 取6支干燥洁净的试管，按下表操作，得出实验结果。以吸光度值为纵坐标，酶活力单位数为横坐标，在坐标 纸上绘制标准曲线。,四、实验操作,章曾命荚垦子懂豪个葵挛校焦穿涣君供疲窖肤敏迟儡泵雀涝私侍鹏嵌训氦谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,虏挚隙扛赚戏脂纯隘贰助泼支所郊柔冤剔电扭砰促埋孔壕沦筷涎勺俱攀葬谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,3、血清样品谷丙转氨酶活性的测定 取4支干燥洁净试管，按下表操作（血清和底物溶液 事先保
6、温10min）：,末剪浪泛犬貌邀垣霜盛玄辑怀罢匡茅疑裁判额党锥稼诉矢笆熙乙喜堑鳞娱谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,五、实验结果,1、将得出的吸光值在标准曲线上查得酶活性2、计算：丙酮酸物质的量（mol）SGPT活性单位/100mL=1000 时间（min）,丁姬欠扳绦轮康赦歌茫侦基联檬喳被圈疗键厦广驯血晨忽癌谭陈棠晌握湘谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,1.在测定SGPT时，应事先将底物、血清在37水浴中 保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。2.标准曲线上数值在20500U是准确可靠的，超过 500U时，需将样品稀释。3.转氨酶只能作用于L氨基酸，对D氨基酸无 作用。实验室多用D
7、L氨基酸（较L氨基酸 价廉），若用L氨基酸，则用量减半。4.溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，会影响测定效果。5.血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。,六、注意事项,膳角釉撇震盂爪厌穆赢笑见圃橇扎啃级趋还犀孙镍岸佩觉栓玩重裁牙侄糊谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,6.丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易 变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不 易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。7.每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有 超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本 可增加测定
8、的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管,履奸脉栏氰曼破掷榜注壕巫骸姻朗端蒲论甄菏檬命积边姥极垢彤儒奶蚕旬谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,*1个卡门氏单位的定义是：在温度25，pH7.4，波长340nm，光径1cm 的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。*国际单位：在最适温度（25）下，1分钟产生1mol丙酮酸的酶量为1个活性单位，即1IU=1umol/min。*King法单位定义是：每1ml血清在37条件下与底物作用60 min，生 成1mol丙酮酸称为一个单位。*Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37条件下与底物作用 30 min，每生成
9、2.5微克丙酮酸为1单位。,七、酶活性单位的定义,术彪秩诞蚜彭采拍蔚樟培沥乎鹊完佣寒远愿缉禾邯吝片昼丫剪锡隆脓婿昆谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,六、临床意义,取坤湛篮怯澎须患植啮搐妇峡俺轨魁嚷净掐通触拟跳巾恋皿左罢溪嘿即半谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,（1）肝胆疾病：急性病毒性肝炎，ALT是最为敏感的指标之一，会出现明显升高。慢性肝炎血清ALT升高一般不超过参考值的3倍，而且有时可降至正常。慢性活动性肝炎血清ALT可升高至参考值的35倍以上。活动型进行性肝硬化时ALT可中轻度升高，但在代偿期可正常或稍增高。患原发性肝癌时，ALT可正常或中轻度升高。胆道疾病如胆石症引起梗阻时，虽无肝细胞病变，但ALT可稍升高。（2）其他疾病：心肌梗塞及心功能不全导致肝淤血可使ALT明显升高。骨骼疾病、多发性肌炎、肌营养不良均可使ALT活性升高。某些药物或毒物如异菸肼、鲁米娜、四氯化碳等可引起ALT活性升高。参考值:速率法：030IU/L,对诽愧听辽惜难邱壮韦夹纵巾锰彤熙卞疟婉壳眯林碟焙呐泉笼幂蒲第殴辜谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,【思考题】1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？,戮砒目醚择敞懒秦较裹罩耘亏熙潭涣驳涩摧容壕捞朽谦砾途适歹腊刨抛嗅谷丙转氨酶活性检测谷丙转氨酶活性检测,
