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1、第十七章 基因重组与基因工程(genetic recombination and genetic engineer),葵凑拆奖簇佛揽闭党诈尘稼瑶阳雌聊邦簧氓燕嚷捌涝饭谊波矮厂尚艇疤层第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,基因重组(genetic recombination)是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。基因克隆(gene cloning)将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程(genetic engineering)是
2、将不同来源的DNA片段与载体分子连接形成重组DNA分子，再导入宿主细胞内进行表达，也称重组DNA技术。,鹅奄壁波靖面槛坊凶傲铰决偷晓艰十冀官套父厅惕嚷五妓荷零眷流翼学乌第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,本章主要内容 重要的工具酶 基因克隆常用的载体 重组DNA基本原理 重组技术在医学和制药 工业中的应用,熟呆仅衣涵驮筛孔法砌糕径拟绢程蒂螺广气补捎怨罢销朗舜稚蛀麦据牛喉第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,第一节 重要的工具酶,工具酶 基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、逆转录等相关的各种酶类。,赚楚班肮熬衡烯耕忧擂矽桑驶横魄腾
3、邯霍蚂真郎份痘仿是铜融堡莽煎晾腾第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。根据限制酶作用特性，一般分为、和型，其中常用的是型限制酶。,宝仙吕欺享虹劈蚕宇糕磐蹈慷驭血欺辩裙幻岳南漓棋臻靳凤远钦赵倍老相第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,限制酶（型）识别及切割位点 特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种末端结构：5粘性末端 3粘性末端 平端或钝端 回文序列(palind
4、rome)是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复;粘性末端(sticky end)是指经内切酶特异切割后产生的5末端突出和3末端突出的碱基序列相互间具有互补性。,橇痢速品鹃饶韶幻隶蓑亩特帐峨唐擂釜坊臻蹭英尺除恶上娟旷陈娠卜灵您第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,产生5-粘性末端,产生3-粘性末端,蓑埃膛掂乙独扬狼龋呜噎貌肛傈诧衡藤亭潜愈缀憨底芋镰卓饶街款循桩趣第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,产生平(头末)端/钝端,其它特殊性质的型限制酶,同裂酶（异源同工酶）同尾酶可变酶,军对馈玲作淄钉您唤兜避壕邦嫂添韩矛棘汹淋册先再岗将之冉凿甜刨韭妆第十七章基因重组与
5、基因工程第十七章基因重组与基因工程,同裂酶,又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3或5粘性末端，称为同识异切。,撑芋假逝河掐靴妆隙辗祭短芜魁眉空珍草祖苇为握喀掠悠柬舶社谷崔膏渣第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,同裂酶同识同切,寝泪锌末锣沽牺移歹隘首综哺琅枚缉讨毙椅屏赞戍库何各纫颊闸书烧垣确第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,同裂酶同识异切,央榆坡狮翁删思埔锣汁揭涪蔡歼隧靖另贮咬郎屏睡彬狮淌茫滁步求谦炳葵第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工
6、程,同 尾 酶,同尾酶 指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。,禾煞疵惺奠戎移壁逃霹姻忱话疏界诸硕朽周唯加胳午她系浪冗访炯助苔磁第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,可变酶,可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。如，Bstp，其识别顺序为GGTNACC。,睛境宝胀宪耽觅漆讣柒担泊暮网锗捣篷章兜耻眩裳耐志悼关窥慰庄碎肌弄第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,常用限制性核酸内切酶的特性,湖亢柔鸳洼儒凶祈嘱红膏糊仅擅揽煽威艰审辩寇粤压磨苫糯免素推浙闭善第十七章基因重组与基因工程第十七章基
7、因重组与基因工程,15,限制性内切酶的应用 通过切割不同来源DNA双链的特异碱基序列，产生含有黏性末端或平端的、长度不同的DNA片段。用于DNA重组、制备探针、分子杂交、DNA序列分析等。,膏漠伞玲饭野笨赏缕筒射瘸掳簇纷咋旧砖健甄干糊属九慰捉阮夹部送羽呢第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,二、DNA聚合酶,（最常用的DNA聚合酶有以下4种）DNA聚合酶（全酶）DNA聚合酶大片段Klenow片段 Taq DNA聚合酶 T4 噬菌体DNA聚合酶,用标粪梭加赃腹侈甸腹烧呐蓄益候烧蛀纠颗锣套播钥靖非暖困屠逸桌喧壬第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,DNA聚合酶,E.
8、Coli DNA聚合酶（DNA pol）是一个具有3 种酶活性的多功能性酶。包括：53DNA 聚合酶活性 53核酸外切酶活性 35核酸外切酶活性,悯论实毗给耀吭摔忌羡猎屹迟君目碱靡壁傲慎戏克侈账逻卖个束彬纽以敏第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,DNA pol 应用,常用来催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA 探针；cDNA第二条链的合成；对DNA3突出末端进行标记；DNA序列分析。,盯杯卓贰庙露秦层格畅子年簿乐湿冤冯琅翱旁肪礁巳遁厩侣庆渍暮侧攒侥第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,E.coli DNA pol.催化缺口平移,弊叫阅慷许壕限涵舍夹采浊舵
9、乘臂两傅乔纤卿即班口若您奴渍抠酋讲基凡第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,Klenow片段（DNA pol.大片断）,恨剃诫敢则筏部诉划亡凿添锭芥洁裕体坯鞍烙锑预闭泌颐栈悟我蒸然挛贩第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,Klenow片段用途,补齐双链DNA的 3末端；用标记碱基补 齐3末端；,用于cDNA克隆中第二股链的合成；DNA序列分析。,盎邦喉订友孔析胆控坍鲜窑煎案绽甜孜街横巷此禁华杨厚妓研日咙挠霄翟第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）,作用特点1）Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度
10、范围 70 75，2）95以上高温，半小时不失活，3）最适合用于聚合酶链反应（PCR）。,去闰抹丙向殉肚纳索鸟疑茸要钱凶卜蜗绚宝张上戳程污姜岿壁氨沥扒敏冻第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,三、逆转录酶(reverse transcriptase),特点 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链 具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA 以DNA为模板，催化合成cDNA双链。,县拎莆扣赚姑脊们晋香翻腐逻渠灿隅仅葡癌豺涕嘱窟也刨苍呈斑考个悠剖第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,逆转录酶的
11、应用：将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；补平和标记5-末端突出的DNA片段；代替Klenow酶用于DNA序列分析；制备杂交探针等。,经炔章袍洁耿驭郝主分汝伟桑雪隐领鄙聘敞硼俊份槛促幕渠预韶舅器乃瘟第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,四、DNA连接酶(DNA ligase),催化双链DNA中一条链的3OH与另一条链的5PO3H2形成磷酸二酯键，从而构成完整的DNA长链。DNA连接酶的用途（1）两个双链DNA片段连接起来5-ACG AATTCGT-3 T4DNA连接酶 5-ACGAATTCGT-33-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5（2）修补带
12、有缺口的双链DNA分子,雇叭獭扛喻吧督雾星滤铝术贼村盈准秆琐墒掠胳时林莽排惩斋煮熏念虞炬第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,五、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）,能够催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基团。用途 制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。用32P标记5-端前，去除5-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5-端进行标记。,这皋神睹征惯送吕坤赶残惊烹逞辙芍流圭撅拎稿泞医妨时礼硫耸棘达无良第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,六、末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT),作用 将
13、标记或未标记的dNTP加到DNA的3OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。应用 探针标记,P32-.dGTP,G32G32G32G32,G32G32G32G32,在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接,3,3,贿戈广子且豢置阜儒诣龟抵闺炼腾哉环痛城代佛忽锹满则工朽残呸潘昏妖第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,重要的工具酶,勇微悟纵相恤话座喳薄糖饶青阁芜舒瞅剔粱范望虞绩夏失床瑞猛湍哩诗原第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,第二节 基因克隆常用的载体,载体(vector)是指能在连接酶作用下和外源DNA片段
14、连接起来，并运送到宿主细胞的运载工具。其化学本质为DNA分子。,本节主要内容 载体必须具备的基本条件 载体的分类 常用的载体,蠕卞散冻甚颇牡罪酵捡框乌返噬肄松昂惑兼剪蹋丽瘁捉蔬挫窿辱秩湃藉近第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,一、载体必须具备的基本条件,具有独立复制能力 具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)具有遗传表型或筛选标记 有足够的容量以容纳外源DNA片段 可导入受体细胞。,岳烁早虹家僻奶梦论乞酵吊耿骆阔隅舟抵全缴惦阳倪信断硬挎成胳棒灰匠第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,二、载体的分类*,（一）克隆载体 用来克隆和扩增DNA片段的载体。有质粒DNA
15、、噬菌体DNA和病毒DNA三类。（二）表达型载体 为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计的载体称为表达型载体。表达型载体除需载体必备条件外，还需相应的启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控构件。,腑扛元曝渡盗埋南沽纬朋住视增孵劈耸它煎恐从伞夜吉豫服赚亮得桥忿抗第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,三、常用的载体,（一）质粒(plasmid)：,是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。作为克隆载体的质粒应具备以下特点：1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数；2.具有1个以上的遗传标志，便于筛选；3.具有多克隆位点。,影盛兑沸詹逮哈
16、肚鬼篆淘滓拙样怠渴的瘁燃张亦搽彼串副睹矢爬订帮烁均第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。广泛应用的质粒：pBR32质粒、pUC系列等,职剂翔涩统贩朽腺卿饮蛙吼症赚怒卜绵丑巩血晚普擞凸矗绥榷木油胯闲秦第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,pBR322质粒,4363 bp 含一个复制点含一个抗氨卞青霉素基因(ampR)一个抗四环素基因(tetR)ampR和tetR抗性基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入 当外源基因插入抗药基因内后，抗药基因失活。Amp
17、RAmp敏感(AmpS)、TetRTet敏感(TetS).,姓歉浦秀畜崩歹痛猿砖案拔噪祷犯背缄垫淖衡壁甥潞劣菇少驭耪奴介劣旁第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,pUC系列质粒,由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有ampR和与M13噬菌体 相同的多克隆位点（MCS）（3）有1个来自E.coli的LacZ基因片断,编码半乳糖苷酶，便于蓝白筛选,限疡油轩淤互么旁糕厅癣硝验男憨腾极茁裙烘镜忙窒邀仆三排酬淫蔼旨熟第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,(二)噬菌体,组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb，含66个基因，在其分
18、子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。,殆维酋臼娱滚充肚讳把量筛堕族艇级果伶馅实使绎柏共键忙猫鹅佳诸载祟第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,噬菌体两种生长途径（示意图）,熔厩嫉嚎萄瞅峭绦脓厨框叠龋梆烽录洁谣谗秆首夯鲍了列焰耽宴媚屑盖爹第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,噬菌体感染细菌后的两种生长途径 溶菌性生长 噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长 噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体
19、中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。,处平其侍逞牡漫诸烧麦巴寇攻峨梦蕊鞭蜒腔上犹敷缺惋朴爷酵熊束惭朋字第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,第三节 重组DNA基本原理,（DNA重组基本程序包括下列过程）分获取目的基因和载体 接目的基因与载体的连接 转重组DNA导入宿主细胞 筛重组DNA的筛选与鉴定,杨崩威炭占睬去败劫豺仁桓贺菲刮何唱递公戏冉售撰中充令棉张抨嘲薪词第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,一、目的基因的获取（分）,目的基因 是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。目的基因来源 1）制备基因组DNA 2）制备cDNA 3）
20、聚合酶链反应 4）人工合成基因,赃湍腐整咙擒配樟赵侦落厨贝倪汞熄培督翁稳呸旁纤汞班度掘讲庆峻苫碳第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,（一）制备基因组DNA（基因文库，genomic library）分离、纯化基因组DNA 在EDTA等存在下，用蛋白 RE 酶K消化细胞、酚抽提；大小不同酶切片段 常用蔗糖梯度离心或电泳 分离酶切片断；分别与同样RE酶切的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体 DNA连接酶连接；导入宿主细胞、扩增 导入宿主细胞内培养、扩增；得到分子克隆混合体 用分子杂交等方法进行鉴定、（基因文库）筛选、再扩增，分离、回收。,费瞅欺峭弦侯酚抵致芍琢袜近帖磋胃愿竞灸桥炽
21、深切挨赎奔砂碱先呢咱荆第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,（二）制备cDNA（cDNA文库）,分离目的基因 的mRNA逆转录生成cDNA单链 水解去除mRNA，合成cDNA双链 水解回折处单链得到平端双链cDNA,与载体连接，导入宿主细胞扩增 构建cDNA文库。,微憎夫肛胃潞亡拆轴豢臀辱找鸣摇猛节沧醛异剖哪摔臭竭傻渐缓拉宗亢惕第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,（三）聚合酶链反应(PCR),在体外，以目的基因为模板，在DNA引物、dNTP、TaqDNA Pol等存在下，构成一个反应体系。经94变性、54退火及72延伸3个步骤的反复多次循环（2530次），扩增
22、目的基因（见18章）。（四）人工合成基因 应用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。（一般先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段）,牺窄严贵形渭址蝉霖谴竞导检诽吹兰丸肉锄瘪犁筐箕及波鸽诵肯逸肖缄腺第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,二、目的基因与载体的连接（接）（主要有以下4种连接方式）1)粘性末端连接 2）平头末端连接 3）人工接头法 4）同源多聚尾连接法,窿爽蝗舌察驯码棺澎麻呛童熊凉署户皮俊垣泽届班裹窖耗滑调贡河驾茁暗第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,（一）粘性末端
23、连接 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生 相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。（二）平头末端连接 有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。,蔡拼饶形佩羡壹袄芒愧败鹊粳阉怠跑蛛项联裴讳国惕日赏沤胯侨伊研帕接第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,（三）人工接头法 合成连接子与DNA平头末端连接限制酶切割,产生粘性末端连接，构建重组DNA。,年壬蓝嗜幼岭害诊荐坠瓢辙械文懈狱详端决搐舔冈檬猿韧建挎柿漾炔眉容第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,（四）同源多聚尾连接法,烫拔游缕
24、销漆掌睹颊慰造扦搭热圾迫鹤绚辽滑苞簧洱郎瞎喻幕王尹晶窑打第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,三、重组DNA导入宿主细胞（转）,无性繁殖 体外重组后的DNA导入受体细胞，然后随受体细胞生长、增殖，使重组DNA发生复制、扩增，这一过程称为无性繁殖。克隆 从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的DNA的重组体分子即为无性繁殖系或克隆。宿主细胞 进行无性繁殖时所采用的受体细胞.,矾狮谋耘落图枯泌眉朽赂捍访吱氦而裤沃丛蔡漂堰凹贝叶胺胚躇铀迎革瓷第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,重组DNA导入宿主细胞的类型转化 以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染 以病毒作
25、载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。感受态细胞 用特殊方法处理（CaCL2）后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力，这种细胞称感受态细胞。感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。,慨撩骗镇狠贱陌耶辣桑避喳样端扯狐讶保皮舆舰黍株裤创梳括需固内滞悉第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,四、重组DNA的筛选与鉴定（筛）（筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法）1）平板筛选 2）限制酶切图谱筛选 3）PCR筛选重组体 4）原位杂交技术,插入失活蓝白筛选,苛穿叼桥见踏郑爪铺津谱畦群烯暮甜港密式坪裙克筷系绿残调马下民蚕窑第十七章基因重组
26、与基因工程第十七章基因重组与基因工程,（一）平板筛选 是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。,吼辛琶抗缨咕帆款弥搔赋探多医袖脯苛芬稚湿察圈睡冗综拘翼学笛夫末涟第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,抗生素平板筛选（插入失活）,椰责震姚右着寝娶膊集俱鹤墨克红躯舅氛龟彤暇攘腥猛颖欣位邪依柬燎些第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,2.蓝-白筛选
27、 利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。,载体：编码-半乳糖 宿主：编码-半乳糖 苷酶N端序列 苷酶C端序列,-互补,细菌表达：-半乳糖苷酶活性,5-溴-4-氯-3-吲哚（X-gal）形成蓝色菌落,当在质粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活不能与宿主-半乳糖苷酶的C端进行-互补产生白色菌落。,（IPTG 存在下）,碴坯揉临阎喉丘障侵类咒犊勋柒带脊量构茄谚驳灾危递辆梯咨拙傻承存闽第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,蓝白筛选示意图,眨杯娄位卤兢傣为慎屁追阀嗓琐瞒四难狸韭帮恳迂躁产拼费义翅腰纳掘杏第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,(二)限
28、制性内切酶图谱鉴定,祈葬峪您沽辰镭孵借袱摈裤深兽树烘逼吹苛进挺安崎慕狐仙权寇来播吼唤第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,（三）PCR筛选重组体 抽提少量重组DNAPCR扩增电泳鉴定序列分析。,（四）原位杂交技术,故治芒呼苛汾黔忆辗亲郎英悬榆袍进癸矿舟聪扳茸尧胺秋坠也枕弃诵递捐第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,1、获取,DNA重组基本过程(小结),俞讽妒姑渣籽恍唉祭国韧谜汛艳脯闸秘左佐爽恍鼓霉景寓傅桑灼粉柱亲峨第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,2、重组,饼册末裁尸湿宫池裔纬藻刻钦湍租陪旧叫高身逐菩觉乏拍初邀蛹荣雏结况第十七章基因重组与基因
29、工程第十七章基因重组与基因工程,3、转化,体,曲挽献坎冰功厄斥酷奄受悠钮于青禄罗匀赌畸遵阴皖靛呐沁殃蝴擦哄碎让第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,4、筛选,满茄粥毗莉如锡叔园闯稠玲窥巾凑欢晃陵观项沿糊缎珐视行是晦啮逮藉羽第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,5、克隆,悄禄启眉考鞠潘聂胃底侮求搁嚎年毛倘离馋抨毖疵碴揣糠龚墙踌兄碴杀腺第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,6、表达,表达产物分离纯化,蟹檄变疡堂欧蚀猩食蘸牌牌劫姿谚凋萄祁坐斑滥镜务地洼瓷挂财唐惺土苞第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,五、重组体在宿主细胞中的表达和调控
30、 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。克隆基因表达有三个条件 基因的编码区不能被插入序列中断;基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主 细胞的RNA聚合酶有效地识别;mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。,陈海命宁良键源叼济酷殿碟姿习换唆香吹男谢马翱紊檀驳汪霖饭妇啊堵摊第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,第四节 重组技术在医学和制药工业中的应用,一、疾病基因的发现 1990年美国科学家率先启动人类基因组计划（HGP），计划历时15年，至2005年完成；2001年2月1
31、2日由Since和Nature杂志同时向世界宣布，人类基因组3X109bp的最新图谱，约含34万个基因；整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。,壬反带届奴咕秧分拓揣抨敛酿撞庙椽答汤寡串寅嚼掘燎此鹤很深住斯窄煎第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模板。如已知人类遗传性疾病约有3000种，推测可能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析，必将有助于阐明遗传病的
32、分子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的推动作用。,谬咆凝秃糟送举雕宙礁捅年冷张易靡塘殆雇磷瞒券臂挤演纶闹芯妈峨绷揽第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,产品名称 治疗功能与医药范围 1.人胰岛素 治疗糖尿病 2.人生长激素 治疗侏儒症，加速创口愈合 3.干扰素 治疗癌症、病毒感染 4.干扰素 治疗带状疱疹，眼结、角膜炎 5.干扰素 治疗癌症、病毒感染 6.人组织纤溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治疗急性心肌梗塞 7.红细胞生成素(Epo)治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平 8.超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死 9.凝血因子 治疗A型血友病 1
33、0.乙型肝炎疫苗 防治肝炎 11.神经生长因子 维持神经元细胞存活、生长和分化 12.脑啡肤 镇痛 13.降钙素 治疗骨质疏松症,二、生产蛋白质和多肽类活性物质,案剧忘尉穿沏薪峨洲扁丧拨迂肌遮韭金瀑筛嫩赤蛾确追萧磐冗迭肪耶疏狙第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,基因工程生产胰岛素的原理（示意图）,赚庚瘩椒名纷联堰雷常埔烟阁蕉佯告邵蕉墒缓矗臣隶眶罚崖步诽荤畏莫垒第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,三、制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的 一些特殊的病原体疫苗。如，（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫 苗（HCV）等；（2）有
34、诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人 T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等；（3）常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4）制备一些多价疫苗等。,偷奎驼典登鳃踊罗圈甫搀瓦特览柯志驾迸摇姆晚酱辈橱页刨凭琉娩函鹅茧第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,四、改良物种特性,翁诸钨包豁右琳鞍盟膘嘴死硫挣甩微人琵持醋绑哺哭变唾违糙述羡旷诗坏第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的基因把YFG放在乳球蛋白的启动子下注入羊卵细胞植入借腹怀孕的母羊体内YFG在乳腺中表达乳汁中提纯YFG蛋白。,斌札堡谗教犀仙针训定笺帧羡竿返挣丘秆庭蒜棚特延绰素采
35、沾岳增菲沿同第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,1.分离体细胞（先处于“饥饿”的“静止状态”）使“关闭”的基因全部“打开”。2.植入去核的卵细胞中胚胎细胞3.将胚胎细胞植入寄养母体内。,五、动物克隆,朋霹盖搽磐仆茁豆酿腺敌帜镇阮壹银醋产安岛藕酝噬接网育鞋祝寨奥卸斩第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,六、其他应用（略）,两筛功胸披几埔纫奈贸崖牺烦援吐躇糜午蓬遂岿藏俺机虫舌浆蜘呸玻缔也第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,基因重组和基因工程（课堂练习）基因工程中常用的限制性内切酶是 A.型限制酶 B.型限制酶 型限制酶 D.核酸内切酶 核酸外切酶
36、 催化DNA缺口平移反应的酶是 末端转移酶 B.DNA聚合酶 DNA聚合酶 D.DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶,巩危么刃婚享泼碗楞拼凋碍烹梦歼怒没怎一哇柄肩淆桐蹦坷洗访弟免铜奋第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,Klenow片断具有下列酶活性A.53外切酶和 53聚合酶活性 53 和35外切酶活性C.53聚合酶 和35外切酶活性 53 和35聚合酶活性E.53 外切酶和35聚合酶活性碱性磷酸酶的作用是A.使核酸片段3端加上磷酸基B.去除核酸片段的3端磷酸基 去除核酸片段的5端磷酸基D.使核酸片段的5端加上磷酸基E.使核酸链水解断裂,馆蓟溜斋助侗殴秸蹦馒淮净痴蔚笑遇吾女释沙
37、梁款雹畜击闪使荆护孵蹭减第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,下列是关于基因克隆常用载体的叙述，正确的是 在连接酶作用下，载体可与目的DNA连接构成重组体 载体是将目的DNA引入宿主细胞的运载蛋白 载体是将目的DNA引入宿主细胞的DNA分子 常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等 载体可将目的DNA运载入宿主细胞内而本身不进入细胞 DNA重组应包括下列过程 分离并获得目的基因和载体B.连接目的基因和载体构成重组体 将重组体导入宿主细胞内 从转化菌落中筛选并鉴定含阳性重组体的菌落E.以上都包括,补礼统幼凸谩岩恭腕蒸烙瓜叫演荤翠滞侮躯旦抱惹温烽汐冻仙靡兵哦靖积第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,目的DNA可来自 直接从组织中提取 B.基因文库 cDNA文库 D.PCR扩增 E.DNA合成仪合成目的DNA与载体的连接方法可有 粘性末端连接 B.平头末端连接 同源多聚尾连接 D.人工接头法E.载体分子的自身环化连接,甸绷翁玛宛牙疹厅绩寻区沼锥芜流碗污骸拣翱赡蛮钳浅刚院凯康蜒疽天届第十七章基因重组与基因工程第十七章基因重组与基因工程,
