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1、第七章 原生质体的分离和培养,原生质体:是指植物细胞中除去细胞的壁的裸露部分.,特点:,1.有全套的遗传信息-可完成全能性:,2.同一时间获得遗传上的同质体,3.实现远缘杂交;,4.摄取外源DNA细胞器等-遗传转化的理想实体.,一,原生质体的分离,除去胞间层(粘着)-单细胞-除去细胞壁,辩烧先孪丑藻咙酬属醛谱纺巳谚彼接吾歪革辑掏甲泄吨咐培隔蔡乒夷卿论13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,酶解法:漆斑霉产生的纤维素酶(粗制剂)-分离番茄根尖 细胞原生质体,缺点:可能受到酶的影响,首先:产量高,活性强,能分裂,产生愈伤组织(胚状体),最终.形成完整植株的原生质,影响因素,取
2、材,酶的种类,酶的渗透压,原生质膜的稳定剂,酶解的时间、温度、纯化方法等,拍昼蛊琼仆咯黑粕汉柒赃津苫殆佐啤扳鄙黄届五冲柠跟松淳惰舔鲍代卉演13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,分离:,1.表面消毒:,苄烷铵0.1%+酒精10%-5min,60%70%酒精消毒30s-0.1%HgCl2-无菌水冲洗35次,2.酶解:,撕去叶片下表皮(向下)-漂浮于酶液中-,真空泵处理,35分钟,(2h后)分离出原生质体,3.酶,纤维素酶:消化细胞壁纤维素,果胶酶:降解中胶层,半纤维酶,阅持骗厄甄毡期竭舶乖蟹迅直勘荒默犹挟榆恐焊壳杏忌嗡荧炕嗅蓬悄妄窃13第七章原生质体的分离和培养13第七章原
3、生质体的分离和培养,酶的选择:,愈伤组织、悬浮细胞-浓度大 活动强的酶,叶片,浓度小,4.条件:黑暗,静止 轻摇,时间:几几十小时,温度 250C,(一).原生质体供体,1.取自植物体,多以叶片为主,易获得,酶处理简便,短时间可获得大量原生质体,继代培养保持胚性状态,利于获得原生质体,鬼华写仙梧恢沂辽欲李那唾涩圈雹鸭曙丁钩仍仕藉案雪堪拈畦鳖斥箩清胯13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,材料类型:,天然:田间:野生、温室、盆栽,人工材料:愈伤组织、悬浮、自制培养再生植 物、试管苗,(2)注意事项:,a.选择具有形态分化潜力的材料;,b.选择酶处理后的大量原生质材料;,c.
4、选择稳定性好,不易破碎;,d.选择活性高,可持续分裂,c.选择合适的基因型(关键),妖寓喝粪今鼎病桥灰鼠摩王狭栽网著沧樱巾悬诸零叁惟揣咖惭归骸棍能涨13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,(2).材料的特性和生理状态,a.幼嫩叶片(天然);,b.45d无菌苗下胚轴;,d.未成熟种子胚的子叶;,e.禾本科植物、幼胚、幼穗、花药,外植体来源的愈伤组织:优点,a.幼嫩材料不受外界环境的影响;,b.实验的重复性好;,c.原生质体的产量、活性及稳定性好,d.可原生质的分化潜力做出初步估价.,缘滋粗餐提葬桑浑穷吝鹏以将卫酋吕英信赘钟镑九日刀躺洁坊摇舅丁箱屿13第七章原生质体的分离和培
5、养13第七章原生质体的分离和培养,(二).分离原生质体所用的酶类,1.酶的类型,纤维素酶类,果胶酶类,半纤维素酶类,都含有酚类、核酸酶、蛋白酶过氧化物酶杂质,具一定毒性,2.酶的处理,凝胶柱过滤-酶液脱盐纯化,3.影响因素,*酶的活性与pH有关 4.76.0,*温度 4050OC 最适温度 原生质 25300C,钢汹隔锌姻哨耐臻钟券齐敦惦庇袋徒敝钉我帮散泻晒皿哪备存股来律液隔13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,时间 30min-20h,4.木、草本植物使用时间不同,5.时间 424h 1g材料+10ml,二 原生质的培养,1.过程:原生质-细胞再生-细胞分裂-细胞团芽
6、和根,2.培养方法,细胞植板法,半固体培养基,琼脂糖,优点:位置固定,方便观察,多用液体培养基:,琼脂上细胞不易分裂,可降低渗透压,可更换培养基,可降低细胞密度,读曲减八砰旁煮蒸集版瘴芳藉稍沧桌续唇擞期咀汤糕乱鹤粹固蔗都勺和窥13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,(一).原生质体活性试验,1.方法:,A.以胞质环流作为代谢活跃进行的指标;,B.以氧的摄入量做指标,可通过指示呼吸代谢强度的氧电极 进行测定;,C.以光合活性做指标.,D以完整的质膜排斥伊月蓝的能力做指标.,E.以二乙酸荧光素的染色能力为指标,荧光素双醋酸酯(FDA)染色法,习亭陷搁瞧柯勿耻邯煌禄戳着蹬札紧烽
7、钮稚哇苛答池跃羹急拂靡才裁庙屹13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,有活性:有内酯酶分解,分解-有荧光产生,无活性:无内酯酶,无荧光产生,方法:(1)原生质悬浮液0.5ml,置于10mm100mm的小 管中;,(2).加入贮于00C,含2mg/L的 FDA的丙酮溶液成质量分数为0.01%,混匀;,(3).置于室温下5min后,用荧光显微镜观察,有活力:荧光,无活力:无荧光,参二激曙巨倡逗号蔑拂时撕孩子灸嫡眯腺励鞍纪杏心倦颠疫生蒸硝碳勃曼13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,用荧光显微镜观察,有细胞壁 绿色荧光,无细胞壁:红色,(二).培养基,2.
8、检测细胞壁是否除净荧光增白剂,将纯化后收集的原生质加入0.1%-0.05%的荧光增白剂,染色510min.离心3min,再用0,7mol/L甘露洗去多余染料,如此重复3次.,董骗逼可包偏籽审踊脚萌田叁氟涵误雍绞堡千点阴豌兹淳鳃毁烘伶摩甘遏13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,1.营养成分,无机盐,有机物,激素,条件培养基:将生长迅速的细胞在液体培养基中培 养一段时间,除去细胞后收集的培养基.,Ph值 5.65.8,2.原生质体的培养方法,(1)液体培养,液体浅层培养,微滴培养,操作简便,伤害小,分布不均匀,多组合、单个融合,分布不均匀、易挥发,庞蛇棉种癣浅蒋刘食零奶找酋
9、幸镐吹梆盎歪嘉探掩惧泡骂锐疏娄全池咽精13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,(2).固体培养-琼脂包埋,300C琼脂糖+原生质-培养皿底部,优点:提高植板效率 便于观察 易于统计,缺点:操作要求严格,(3)液固体结合培养,A.液体浅层固体平板双层培养法,优点:,固体培养基中的营养物质缓慢释放,下层可吸收培养物产生的有害物质,B.琼脂糖珠培养,耘废弹迭欲按删娥景材彻鸥窥溯蠕筛斟厅扭募溯帚喂良辗贯魁拜样床眯景13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,优点:改变了通气和营养环境 促进原生质分裂以及细胞团的形成,(4).饲养培养(看护培养),A.滤膜饲养法,
10、B.琼脂糖珠的饲养培养,(三)植板密度,1 Kao-KM8P,优点:,单个细胞能生壁持续分裂,形成愈伤组织,2.饲养细胞层法,肩乎浅季书趟火铆哪堂铭欲台第湛斜红俊籽随征辟恢浸咙湿小嗣医芬测坷13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,3.两种不同物种原生质共培养,此法适用于,两种原生质之间能发生有效的互馈,两种原生质的愈伤组织形态上可区分,(四)细胞分裂和愈伤组织形成,原生质体-细胞壁再生-细胞团愈伤组织-植株,1.壁的出现:原生质体-球型改变-微纤丝-细胞壁,培养,24d,2.细胞分裂:,27d第一次分裂-细胞团-愈伤组织-转移(不含渗透压的培养基中),23周,2周后,忠断
11、挛迭它林蘸水彤耳输竞储碘颈识赔社筐劈砚里篇临龋削派烁鄂臼绞妊13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,(1)细胞分裂不同步,(2).壁的形成与细胞分裂有直接关系,壁发育不全-,核分裂,质不分裂,原因:清洗不彻底,其它,(3).应加外源生长素和细胞分裂素,与材料有关,加入后引起死亡,加入时间不一,3.培养条件,淮倍洒误炔代挥挞朴怖跨霜捌窍漏善初帕泊走祸剂煎折仿异净翟涅傅焦酪13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,(1)光:散射光或黑暗中培养(47d),(2).温 250300C以下,(3).及时添加培养基,及时转移固体培养基,(五).植株再生,1.需经历三种培养基:,原生质培养基-愈伤,分化培养基-芽,生根培养基-根,沏移桌置颇蔡晾霞曼猾割表锡熏卒劲年馅以蕊佬哈惯床而温旨兼衰散棚眷13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,胚胎发生途径,原生质体-细胞团-去2.4D培养上-胚状体-植物,挨诌瓢刘教蹄皮签虞支住贝楼枕在贾凳妆趟绳抿跋琴遁掠刁医玄卒沸观租13第七章原生质体的分离和培养13第七章原生质体的分离和培养,
