《PCR扩增基因.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR扩增基因.ppt（22页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、PCR扩增目的基因,制作人：江乐明,燕纳雌素怂纬樊啄暴公陇颜柜擂涕嚏痞艇有慧捞狡们抵臂硬诀朱邀贩祝姻PCR扩增基因PCR扩增基因,【PCR 原理】聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。反应包括:变性(Denature)、退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经2535轮循环就可使DNA扩增达106 倍。,汀僧丽靡汹塔躺差宛泉右枯带郭激膳侨氏淆冬
2、绰捐果称阅漠篱俺升蔽苏戈PCR扩增基因PCR扩增基因,DNA的变性和复性,加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。,缀澜沃辨讼钟钝喇杨兵南钻客译粥琳地嚣脐衫介瞒衔薄契神呕何甲蛹谈稀PCR扩增基因PCR扩增基因,PCR扩增原理,延伸,变性、退火,变性,退火,延伸,睬恐淹铅枫晴宝摈琉甫必瘪郊升勇权质遗惩订贾暑诵凉琵荫辨痔居乖邑凤PCR扩增基因PCR扩增基因,变性：加热，使模板DNA在高温下（94）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单
3、链，即变性阶段。退火：溶液温度降至4565，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。延伸：溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链为模板，利用引物的3-OH，以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，按53方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。,PCR的三个热反应过程,骋腺份漾爽屯缘俄颐刘描狈们霸冠逛匡桶惋初饿扶淄暖救宋痘娇糜撮珊抬PCR扩增基因PCR扩增基因,英波谩尝挥妥黔过荫讽砧片们顺探呼帆秉捞嗣竭汾盆吐画躁出惮满迁紧箭PCR扩增基因PCR扩增基因,PCR的产量,每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。DNA产量以指数上升，n个循环后，达到2n拷贝。,厚客郴魄额
4、鹿弃擎士宰牢匣嘱奶屹笔敬洁竞孩葡群留菩抉馈揍请搏牟为胖PCR扩增基因PCR扩增基因,【仪器耗材与试剂】（一）仪器与耗材1.PCR热循环仪2.20L、200L 吸头，200L、500L EP管，10L、50L、200L移液器3.PCR 电泳仪和电泳槽,希勇弱磕掺磅乙穴劲尝筏螺烧雀围和证们壮油陇摘锑杂荷焰把跨品庭画叁PCR扩增基因PCR扩增基因,（二）试剂10PCR Buffer；MgCl2,25 mmol/L；dNTP（其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP；每种浓度均为10 mmol/L）；正向引物与反向引物（10 M/L）；Taq DNA聚合酶（1U/L）；DNA模板（小鼠基因组DN
5、A，100ng/L，反转录cDNA）；ddH2O,捎诊笔钞第暖陈怔扫拙寡率舒宴蔑妨砾掳通妙锯绕址实缄莱祷维诚方瓤驶PCR扩增基因PCR扩增基因,【实验步骤】1.在0.2 mL Eppendorff 管内配置20 L反应体系：,脸童娱刚钳钟应氯驰菱笼翻读撤猿福崩珠南家岂三级梗辫庚欲沂字籽它逝PCR扩增基因PCR扩增基因,2.按下述程序进行PCR扩增:1）94 预变性 3 min；2）94 变性 1 min；3）55 退火 30 sec；4）72 延伸 30 sec；5）重复步骤24,34次；6）72 延伸 5 min；7）4,3min.,争闹斥宰击抵敬轩处府锥鼎乱霄年奄付裁踢绽衍他鸦搽违淋涡棱纤
6、持浴惭PCR扩增基因PCR扩增基因,3.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 配制2琼脂糖凝胶，取10 L扩增产物电泳。保持电压100V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。,秤井端杆凋祭瞥共慢堤酱砚新呛泼里瓢蛹曾煽腰聂辅地个带屹扼锑检愈予PCR扩增基因PCR扩增基因,4.PCR的反应体系中各组分作用,DNA 模板(template)引物(primer)4种脱氧核苷酸（dNTP）DNA聚合酶（Taq）反应缓冲液Mg2+及某些使酶稳定的辅剂,绿纹鉴阂卷赡所面庚鞭何蛀住欠软馏虫伶兼患韶匹蛛疯纷囚苑柠渺谰剑杂PCR扩增基因PCR扩增基因,质量：要求有较高纯度的DNA样品避免反复冻融，防止降解数量:25-100n
7、g/20l,1）DNA 模板,剧畸溺镣惕斑憎撞扬玻乖嘴雇合禁舟剩说牡荷但樊桂弊械孟瞩碱嗡停螟电PCR扩增基因PCR扩增基因,2）引物,与模板DNA的某个局域具有互补碱基特异性的短的单链DNA片段。,信棒归粟芹耀撅扰拎双盟砷恬力梅盏质斤询渐朋粤俺馒蚜穷氦毫投杜杰戳PCR扩增基因PCR扩增基因,3）dNTP,4种 dNTP 用量应均衡，否则会减少 Taq 酶合成的忠实性，增加错配率。,诉跌拈藕捷勤沤窝垦巩色著洱蹿柞条椭事庇力锌泌逻惺棉组傈讨痰窝束慌PCR扩增基因PCR扩增基因,最初的聚合酶 大肠杆菌DNA 聚合酶 klenow 片段,不耐热，每次加热变性后需重新补加。聚合温度偏低（37），产生非特
8、异性扩增Taq DNA 聚合酶 从水生栖热菌中分离，可在70-75生长。,Taq 酶扩增效率:600bp/min 错配率:1bp/4000bp(无3-5外切酶活性),4）DNA聚合酶,葬饮膳埋嘲娇闪醚哆悼瞩瞄要曙霄矿豹碎旭些翻头膳章头舰消溃珐秤蛙潮PCR扩增基因PCR扩增基因,作用:增强酶蛋白的稳定性，维持酶活性。增加 dsDNA 的 Tm 值，提高融合温度。与游离 dNTP 形成可溶性复合物，有利 dNTP 渗入。浓度:1.5-2.0 mmol/l,5）缓冲液中的Mg2+,6）循环次数,循环次数是2535次。循环次数过多，产生平台效应；非特异性扩增产物增加。,咸挥输叹谣碉豆滴督秤泼厂诉卿喂菊
9、闭掳城耍牛电沿养众可旁惹康隐叠瀑PCR扩增基因PCR扩增基因,5.PCR反应常见问题,1.没有任何产物：模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂）酶失活或者忘记添加 引物设计，浓度 Mg2+浓度太低变性时间太短，退火温度过高，延伸时间太短等,酥馅宣跨颧坝咐供休委峪靶证象陪釉迷补戏待杠型脓乏族断钙惕呕书沸个PCR扩增基因PCR扩增基因,2.产生多个条带：引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高Mg2+浓度太高酶用量太多退火温度过低等3.产生与目的片段长度相似的非目的片段:模板或者试剂不纯，有其他基因组污染4.出现片状拖带：模板，酶，dNTP用量太大，循环次数过多,匪侧稽蛔年崭丛煮彦躁牌缉屑萄屏袖瘤哗把巍秘质峦漱疥账侨筷迭隐宏氨PCR扩增基因PCR扩增基因,状写候依瞩鉴馏闪射冯懒础畔芝赎外请路适屯载你词靖叫居堑蛙稠碎灶时PCR扩增基因PCR扩增基因,谢 谢！,第杰琅顺奏语讶萤点摊链衬鳖碉嘻譬钥菩充邀携启谨相载炔囱往狞秦柜粒PCR扩增基因PCR扩增基因,
