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1、精品论文推荐普通小麦-簇毛麦 2V 染色体端体异附加系的选育与鉴定1李淑梅，徐川梅，周波，陈佩度 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏南京（210095） E-mail：pdchen摘要: 簇毛麦（Haynaldia villosa）具有抗多种病害、耐旱、耐寒等优良性状，是可供小麦 改良利用的优良遗传资源。本研究综合利用根尖细胞有丝分裂中期染色体 Giemsa C-分带、花粉母细胞减数分裂中期 I 染色体构型分析、荧光原位杂交（Genomic in situ hybridization,GISH）和分子标记等技术，从普通小麦-簇毛麦 2V（2D）异代换系与含有 Ph 抑制基因的中
2、 国春高配对材料（Pairing homoeologous inhibitor, PhI）的杂交后代中选出分别含有簇毛麦 2V长臂和短臂的普通小麦-簇毛麦 2V 端体异附加系。将控制护颖颖脊刚毛性状的基因进一步定 位在簇毛麦 2V 染色体的短臂上。同时筛选出可以追踪 2V 染色体短臂的 SSR 标记 wmc25。关键词：普通小麦; 簇毛麦; 端体异附加系; 染色体 C-分带；荧光原位杂交；SSR簇毛麦 (Haynaldia villosa) 属于禾本科 (Gramineae) 小麦族 (Triticeae) 簇毛麦属 (Haynaldia Shar.)，具有抗白粉病、抗锈病、抗梭条花叶病、抗全
3、蚀病、分蘖力强、小穗数 多、耐旱及籽粒蛋白质含量高等优良性状1。簇毛麦最明显的形态特征是在护颖颖脊上簇生 刚毛。普通小麦-簇毛麦 2V 异附加系和 2V（2D）异代换系护颖颖脊上簇生刚毛，表明该基 因位于 2V 染色体上2。由于该性状是一个十分明显而稳定的表型性状，易于观察和用作遗 传分析，所以本研究试图利用携有来自 Ae. speltoides 高配对基因的 PhI 材料3来诱导 2V 染 色体产生结构变异，并在此基础上将簇毛基因定位在特定的染色体区段。1. 材料和方法1.1 试验材料小麦-簇毛麦 2V（2D）异代换系和含 PhI 基因（Pairing homoeologous inhibi
4、tor gene）的 中国春高配对材料 C04-13 均由南京农业大学细胞遗传所提供。本实验于 2003 年春配制 2V（2D）异代换系与含有 PhI 高配对基因材料的杂交，诱导 2V 染色体结构变异。1.2 试验方法1.2.1 Giemsa C-分带种子置 20培养箱中发芽，待根长至 12cm 时剪取根尖，在 0冰水中处理 2224h 后， 用卡诺氏固定液（3 份 95%乙醇：1 份冰醋酸）固定，置冰箱中保存备用。27d 后在 45%醋 酸中压片。于花粉母细胞（PMC）减数分裂期挑取含中期 I (MI) 分裂相的花药，用卡诺氏 固定液固定， 27d 后用醋酸洋红染色、压片，观察染色体配对构型
5、。Giemsa C-分带方法 参照 Gill 和 Friebe4程序。1.2.2 荧光原位杂交根尖细胞有丝分裂中期和花粉母细胞减数分裂中期 I 染色体的荧光原位杂交参照陈佩 度等5和 Jiang 等6的程序，略有改动。用绿色荧光素标记的簇毛麦基因组 DNA 作探针，在450490nm 波长下，簇毛麦染色体呈绿色，小麦染色体呈红色。在 Olympus 荧光显微镜下1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（20030307037）和长江学者和创新团队发展计划的资助。-7-观察、照相。1.2.3 SSRDNA的提取参照 Saghai-Maroof 等7报道的CTAB方法略作修改。PCR 扩增在Ge
6、ne Amp PCR System 2700上进行。反应体系10L:1015 ng DNA 模板, 左、右引物各0.2L (10 nmolL - 1) , 1L 10 PCR buffer , 0.8L dNTP (2.5 mmolL - 1) ；0.8L MgCl2 (25 mmolL - 1) ,0.5 U Taq 酶, 补加ddH2O至10L 。反应条件为94预变性3 min ； 94 30s , X（按所 用引物确定退火温度）45 s , 72 50 s, 循环35 次；72延伸10 min。用8%聚丙烯酰胺凝胶 电泳, 银染, 凝胶自动分析仪照相。2. 结果与分析2.1 普通小麦-簇
7、毛麦 2V 端体异附加、代换系的选育与鉴定2.1.1 小麦-簇毛麦 2V 短臂端体异附加、代换系的选育与鉴定对 DS 2V（2D） PhI 的 F3 代种子分单株进行根尖细胞（RTC）有丝分裂中期染色体 C-分带，发现 6 个单株根尖细胞染色体数目为 2n=4243，都有一条端着丝粒染色体，其带 型明显不同于普通小麦中国春各染色体，而与簇毛麦 2V 染色体短臂相同，具有一条强的端 带和一条强的近端带及一较弱的着丝粒带（图 1a）。推断这 6 株材料为普通小麦-簇毛麦 2V 短臂单端体异代换系或附加系。用绿色荧光素标记的簇毛麦基因组 DNA 作探针进行根尖细 胞有丝分裂中期染色体荧光原位杂交（G
8、ISH），结果显示该端体来自簇毛麦（图 1b）。下一 代从一株 2n=43 的单端体异附加系后代中利用 GISH 鉴定出编号为 L-909-237-24 的植株2n=44, 含有 42 条小麦染色体和 2 条簇毛麦端着丝粒染色体，对其减数分裂中期 （IPMC MI）染色体进行 GISH 和配对分析，观察到 21 个环状二价体和一个棒状二价体，棒状二价体呈 现绿色信号（图 1c），表明这是一个纯合的端体异附加系。穗部性状调查时发现含有簇毛麦2V 短臂端着丝粒染色体的各单株颖脊上均有颖脊刚毛（图 1d），与 2V（2D）异代换系的穗 部性状相同。表明控制颖脊刚毛的基因位于 2V 染色体短臂上。2.
9、1.2 小麦-簇毛麦 2V 长臂端体异附加、代换系的选育与鉴定对 DS 2V（2D） PhI 的 F3 代种子分单株进行根尖细胞有丝分裂中期染色体 C-分带， 发现 4 个单株根尖细胞染色体数目为 2n=4243，都有一条端着丝粒染色体，其带型与簇毛 麦 2V 染色体的长臂带型相同，具有弱的着丝粒带和一条近着丝粒带、一条强端带和一条弱 的近端带，初步推断为 2VL 端体。利用簇毛麦基因组 DNA 为探针对上述 4 株端体系的根尖 细胞有丝分裂中期染色体进行荧光原位杂交（GISH）, 端着丝粒染色体呈现黄绿色杂交信 号，表明该端体来自簇毛麦（图 2a），由此推断这 4 株材料为普通小麦-簇毛麦
10、2V 长臂单端 体异代换系或附加系。下一代从 2n=43 的单端体异附加系后代中利用 GISH 鉴定出 L-909-86-11 有两条端着丝粒染色体，根尖细胞有丝分裂中期染色体 C-分带显示，一对端 体的带型与 2V 长臂带型相似（图 2b）。对其减数分裂中期 I（PMC MI）染色体进行 GISH 和配对分析，观察到 21 个二价体加 1 个由 2 条端着丝粒染色体配成的棒状二价体，棒状二 价体呈现绿色信号（图 2c），表明这是一个纯合的端体异附加系。这些含有簇毛麦 2V 长臂端着丝粒染色体的各单株颖脊上均无颖脊刚毛（图 2d），表明 在 2V 染色体长臂上没有控制颖脊刚毛的基因。2.2 S
11、SR 分析本研究利用位于普通小麦第二部分同源群短臂（2AS, 2BS, 2DS）上的 SSR 标记 wmc25 8 在中国春、簇毛麦、硬簇麦和一套中国春-簇毛麦二体异附加系中进行扩增分析，从图 3 中 可以看出引物 wmc25 在簇毛麦、硬簇麦和中国春-簇毛麦 2V 二体异附加系中扩增出大约130bp 的特异性条带，而此条带在中国春及其它 6 个二体异附加系中均未出现。进一步用该 引物在簇毛麦 2V 长臂及短臂端体异代换系中进行 PCR 扩增分析，发现 2V 短臂端体异代换 系 L-909-119 和 L-910-127 总能扩增出大约 130bp 的特异性条带（图 4），而 2V 长臂端体异
12、 代换系 L-910-218 和 L-910-108 均不能扩增出该特异性条带，说明引物 wmc25 的特异性扩增 位点位于簇毛麦 2V 染色体的短臂上。可以用来追踪普通小麦中的簇毛麦 2V 染色体短臂。 本实验室纪剑辉9将位于第二部分同源群长臂上的 RFLP 探针 BCD135 转化成一个 STS标记 NAU/STSBCD135-1。利用这一引物分别在中国春、簇毛麦、硬簇麦、以及一套中国春-簇毛麦二体附加系材料中进行 PCR 扩增分析，引物 NAU/STSBCD135-1 在簇毛麦、硬簇麦 和中国春-簇毛麦 2V 二体附加系中可以扩增出约 400bp 左右的特异带，而此带在中国春及其 它 6
13、 个二体附加系中均未出现。用该引物对 2V 长臂端体异附加系 L-909-241-38，L-952-1-45 和 L-909-86-11 进行 PCR 扩增分析，发现 2V 长臂端体材料能扩增出该特异性带（图 5），说 明引物 NAU/STSBCD135-1 在 2V 染色体长臂上具有特异扩增位点，可以用来追踪普通小麦 中的簇毛麦 2V 长臂。3. 讨论簇毛麦（Haynaldia villosa）最明显的形态特征是在护颖颖脊上簇生刚毛。该基因已经 被定位于 2V 染色体上。本研究在含有 Ae. speltoides 高配对基因的 PhI 材料与 2V（2D）异 代换系的杂种后代中，选育鉴定出涉
14、及 2V 短臂及长臂的端体异代换系和异附加系，对穗部 性状进行调查时发现所有的 2V 短臂端体异代换系和异附加系的穗子护颖颖脊上均具有刚 毛，而 2V 长臂端体异代换系和异附加系的穗子护颖颖脊上均没有刚毛，所以可以将控制颖 脊刚毛的基因定位于 2V 染色体的短臂上。在簇毛麦 2V 染色体上还携有抗眼斑病等有用基 因，利用 2V 短臂和长臂端体异附加系或异代换系，可以将这些基因进一步定位在特定的染 色体臂上。由于簇毛麦染色体在普通情况下与小麦染色体不发生交换、重组，因此可以利用2V 短臂上的簇毛作形态标记，追踪与之共分离的其它基因，可减少标记辅助选择的工作量。参考文献1 Blanco A, Si
15、meone R, Resta P. The addition of Dasypyrum villosum (L.) Candargy Chromosomes to durum wheat (Triticum durum Desf.) J. Theor Appl Genet,1987, 74:328-333.2 陈佩度，刘大钧. 普通小麦与簇毛麦杂种后代的细胞遗传学研究J. 南京农业大学学报，1982，12（4）：1-163 Gill B S, Friebe B, Endo T R. Standard karyotype and nomenclature system for descripti
16、on of chromosome bands and structural aberrations in wheat J. Genome.1991. 34:830-8394 Chen, P. D., H. Tsujimoto & B. S. Gill. Transfer of PhI gene(s) from Triticum speltoides into common wheat J.Theor Appl Genet 1994 . 88:97-101.5陈佩度，周波，齐莉莉. 用分子原位杂交（GISH）鉴定小麦-簇毛麦双倍体、附加系、代换系和易位系 J. 遗传学报，1995，22（5）：3
17、803866 Jiang J.Sequential chromosome banding and in situ hybridization analysis J. Genome. 1993d.36:7927957 Saghai-Maroof M A, Soliman K, et al. Ribisomal DNA spacer-length polymorphism in barley: mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics J. PNAS, 1984, 81(8):801480188 Zhan
18、g W, Gao A.L., Zhou B, et al. Screening and applying wheat microsatellite markers totrace individualHaynaldia villosa Chromosomes J. Acta Genetica Sinica, 2006, 33(3):1-89 纪剑辉，曹爱忠, 王海燕，等. 利用基于 PCR 的分子标记区分普通小麦提莫菲维小麦渐渗系 J. 遗传，2007，29（10）：1256-1262Development and Identification of Triticum asetivum-Hay
19、naldia villosa Ditelosomic Addition Lines Involving Chromosome 2V of H.villosaLi Shumei, Xu Chuanmei, Zhou Bo, Chen Peidu*State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Cytogenetics Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing (210095)AbstractHaynaldia villosa possesses a lo
20、ts of elite traits，such as resistance to several diseases, tolerance todrought and cold, and is an important gene resource for wheat improvement. Triticum aestivum-Haynaldia villosa ditelosomic addition lines involving 2VL and 2VS were identified from the progenies of Triticum aestivum-Haynaldia vil
21、losa disomic substitution line 2V(2D) and Chinese Spring PhI (with Ph inhibit gene) by mitotic and meiotic analysis combining with chromosome C-banding and genomic in situ hybridization (GISH). The gene controlling bristles on the glume ridges was furtherly located on the short arm of 2V. Additional
22、ly, the SSR marker wmc25 was found to be tightly linked to the 2VS of H.villosa.Keywords: Triticum aestivum; Haynaldia villosa; Ditelosomic addition lines; Chromosome C-banding; Genomic in situ hybridization; SSR作者简介： 李淑梅，硕士，现工作单位：河南信阳农业专科学校； 徐川梅，硕士，现在工作单位：浙江林学院林业与生物技术学院森林培育学科， E-mail： xuchuanmei197
23、9；陈佩度，教授，通讯作者，E-mail：pdchen。图版说明：图 1a L-909-119 有丝分裂中期 C-分带（箭头示 2VS）。图 1b. L-909-119 有丝分裂中期 GISH, 以绿色荧光素标记的簇毛麦 gDNA 为探针，端体染色体呈现绿色荧 光杂交信号（箭头示 2VS）。图 1c. L-909-237-24 的减数分裂中期 I 染色体 GISH，以绿色荧光素标记的簇毛麦 gDNA 为探针，端体染 色体呈现明显的杂交信号，两个端着丝粒染色体相互配对成一个棒状二价体。图 1d L-909-237-24 的穗子，箭头示护颖颖脊刚毛。图 2a. L-910-108 有丝分裂中期 G
24、ISH, 以绿色荧光素标记的簇毛麦 gDNA 为探针，端体染色体呈现明显的 杂交信号图。图 2b. L-909-86-11 的根尖细胞有丝分裂中期染色体 C-分带（箭头示 2VL）。图 2c L-909-86-11 的减数分裂中期 I 染色体 GISH，以绿色荧光素标记的簇毛麦 gDNA 为探针，端着丝粒 染色体呈现明显的杂交信号，两个端着丝粒染色体配成一个棒状二价体。图 2d. L-909-86-11 的穗部照片，护颖颖脊无刚毛。图 3 引物 wmc25 的 PCR 扩增结果（箭头示 2V 特异性扩增条带）1.中国春；2.簇毛麦；3.硬簇麦 ；4.DA1V；5.DA2V；6.DA3V；7.D
25、A4V；8.DA5V；9.DA6V；10.DA7V图 4 引物 wmc25 的 PCR 扩增结果（箭头示 2V 短臂特异性扩增条带）1.中国春；2.簇毛麦；3.硬簇麦；4.DA2V；5.L-909-119（2VS）；6.L-910-218（2VL）；7.L-910-127（2VS）；8.L-910-108（2VL）图 5 引物 NAU/STSBCD135-1 的 PCR 扩增结果（箭头示长臂特异性扩增条带）1. Marker：2.中国春；3.Sub6v；4.Add5v；5.硬簇麦；6.簇毛麦；7.Sub4v；8.Sub2v；9.L-909-241-38（2VL）；10.L-952-1-45（2
26、VL）；11.L-909-86-11（2VL）1a1b1c1d2a2b2c2d12345678910图 3 引物 wmc25 的 PCR 扩增结果（箭头示 2V 特异性扩增条带）Fig 3 PCR pattern amplified by SSR primer wmc25（arrow indicating 2V specific band）1.中国春；2.簇毛麦；3.硬簇麦 ；4.DA1V；5.DA2V；6.DA3V；7.DA4V；8.DA5V；9.DA6V；10.DA7V12345678图 4 引物 wmc25 的 PCR 扩增结果（箭头示 2V 短臂特异性扩增条带）Fig4 PCR pat
27、tern amplified by SSR primer wmc25（arrow indicating 2V short arm specific band）1.中国春；2.簇毛麦；3.硬簇麦；4.DA2V；5.L-909-119（2VS）；6.L-910-218（2VL）；7.L-910-127（2VS）；8.L-910-108（2VL）123456789 10 11123456789 10 11图 5 引物 NAU/STSBCD135-1 的 PCR 扩增结果（箭头示长臂特异性扩增条带）1. Marker：2.中国春；3.Sub6v；4.Add5v；5.硬簇麦；6.簇毛麦；7.Sub4v；8.Sub2v；9.L-909-241-38（2VL）；10.L-952-1-45（2VL）；11.L-909-86-11（2VL）
