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1、实验六 微生物的简单染色及革兰氏染色,细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的 制片和简单染色 革兰氏染色法,细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的 制片和简单染色,一、实验目的 学习掌握微生物制片及简单染色的基本 技术 初步了解细菌、放线菌、酵母菌及 霉菌的形态特征和相互区别 巩固显微镜操作技术及无菌操作 技术,二、基本原理,染色前必须固定细菌 其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上 二是增加其对染料的亲和力 常用的有加热和化学固定两种方法 固定时尽量维持细胞原有的形,常用碱性染料进行简单染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料
2、的染色部分很容易与微生物细胞结合使其着色。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带 正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红 等酸性染料染色,三、实验器材与试剂,菌种：牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养的12-18小时枯草芽 胞杆菌和培养24h的金黄色葡萄球菌 溶液和试剂：草酸铵结晶紫染液、齐氏石炭酸复红染液、吕氏碱性美蓝染液、革兰氏染色用碘液、乳酸石炭酸棉蓝染液 仪器和其他用品：双层瓶、接种环、接种铲、接种针、平皿、U型玻璃棒、解剖针、解剖刀、50%乙醇、20%甘油、高氏一号培养 基平板、马铃薯琼脂薄层平板等,四、操作步骤,安全警示1.加热固定时
3、要使用载玻片夹子，以免烫伤。不要将 载玻片在火焰上烧烤时间过长，以免载玻片破裂2.使用燃料时避免粘到衣服上3.放线菌和霉菌制片要减少空气流动，避免吸入孢子4.实验完毕后洗手，金黄色葡萄球菌为条件致病菌，二甲苯为有毒物质。,细菌制片及简单染色涂片：将玻片分成两个区域，各滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操 作的方法挑菌少许枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌于玻 片的水中，并充分混匀涂成薄膜干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥固定：涂面朝上，通过微火2-3次染色：玻片泠却后加结晶紫滴于涂片上，覆盖涂面染色1分钟水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至洗出水变无色为止（注：勿冲去菌体）干燥：自然干燥，或用吸
4、水纸吸干镜检：显微镜下观察并记录,四、实验步骤,1、菌落形态观察：2、细菌简单染色：3、细菌革兰氏染色。,注意：菌落颜色、湿度、形状、大小、透明度、颜色、边缘是否规则等特征。,染色过程：涂片干燥固定染色（1min）水洗干燥镜检注意事项：涂片：取菌量不能太大 干燥：自然干燥 水洗：水流不能直接冲在涂菌处,放线菌革兰染色,青霉的显微结构,曲霉的显微的显微结构,毛霉显微结构,根霉显微形态,电镜下的酵母,革兰氏染色法,一、目的要求 学习掌握革兰氏染色法 了解革兰氏染色原理 巩固显微镜操作技术及无菌操 作技术,二、基本原理（革兰氏染色）,革兰氏染色法是1884年由丹麦病理ChristainGram氏创立
5、的，可将细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和 革兰氏阴性，是由这两类细菌细 胞壁的结构和组成不同决定的,三、实验器材与试剂菌种：大肠杆菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物 金黄色葡萄球菌 16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物溶液和试剂：革兰氏染液、草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘 液、95%乙醇、番红复染液等仪器和其它用品：显微镜、双层瓶、接种环、载玻片夹 子、无菌生理盐水等,本实验为什么采用上述生物？,四、操作步骤,革兰氏染色法的基本步骤是：制片初染（结晶紫）媒染（碘液）脱色（95%乙醇或丙酮）复染(番红)镜检（油镜）混合涂片染色 经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的 细菌为革兰氏阳性菌；细菌染上复染剂的颜 色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌,染色结果,金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果,染色结果,大肠杆菌革兰氏染色结果,染色结果,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果,附：油镜的使用,双目显微镜,单目显微镜,2.油镜的原理,油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时，因介质折光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜筒的光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加入与玻璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不至因折射而减弱，因此能清楚地看到物象。,双层瓶,香柏油,二甲苯,
