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1、层 析,CHROMATOGRAPHY,掌握：层析的概念、一般原理 凝胶层析的基本原理 装层析柱的过程及装柱要求熟悉：层析技术的分类 凝胶层析的特点 凝胶的结构与性质了解：凝胶的选择 柱、样品、洗脱液的选择 凝胶的保存,一.概述,层析Chromatography(色谱),利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异(溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附能力、分子亲合力等)，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。,色谱历史,古罗马人分析混合染料（类似辐射纸色谱）,1903（1906）年，Michael Tswett提出色谱法1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素1941
2、年，Martin和Synge提出分配色谱法 1944年，Martin等又提出纸色谱法 1952年，Martin和James发明了气液色谱法1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC),1958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)仪1975年，Small等提出离子色谱 20世纪80年代，超临界色谱20世纪90年代，毛细管电泳（1809年Ress第一
3、次电泳实验）21世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更大的发展,层析法进行时有两个相，一个相称为固定相(Stationary phase)，另一相称为流动相(Mobile phase)。由于各组分所受固定相的阻力和流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得到分离。,二.层析技术的分类,1.按两相所处的状态分类 以液体作为流动相的层析称为液相层析，以气体作为流动相的称为气相层析。其固定相也可有两种状态，一种是以固体作为吸附剂的固定相，另一种是以涂布在固体载体表面的液体作为固定相。,层析,气相层析（gas-chromatography）,液相层析（liquid-chro
4、matography）,气-固层析（gas-solid chromatography）,气-液层析（gas-liquid chromatography）,液-固层析（liquid-solid chromatography）,液-液层析（liquid-liquid chromatography）,2.按层析过程的机制可分为.吸附层析(adsorption chromatography)-利用吸附剂对不同组分吸附 能力的不同加以分离的方法。.分配层析(partition chromatography)-利用不同组分在流动相和固定相中的 分配系数不同而进行分离的方法。,.离子交换层析（ion-exc
5、hange chromatography）-利用离子交换剂与各组分之间的离子亲和 力不同而进行层析分离的方法。.凝胶层析（gel chromatography）-利用不同组分之间分子大小不同，在通过凝胶介质时所受到的阻滞作用的差异而进行分离的方法。.亲和层析（affinity chromatography）-利用生物大分子之间特有亲和力的不同进分离纯化的方法。,3.按操作技术形式分类.柱层析（colum chromatography）-将固定相装在层析柱中，使样品 朝着一个方向移动，通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。,纸层析（paper chrmatography）-用纸作为液体的载体，
6、样品点在 纸上随后展开达到分离鉴定的 方法。.薄层层析（thin layper chromatography）-将适当的吸附剂在玻璃板或 其他材料薄板上铺成薄层，样品 点在上面随后用流动相展开达 到分离鉴定的方法。,三.层析的一般原理,1.分配系数(Partition chromatography)混合物在层析过程中不管层析技术采用哪两种状态的相(流动相和固定相)都能达到分配平衡，用来叙述一种物质在两种特定相中的分配程度是用分配系数表示的。,分配系数-是一种物质在两种特定相中分配，在特定的温度时这个系数的值是一个常数，即:溶质在固定相中的浓度 Cs K=溶质在流动相中的浓度 Cm,有效分配系数
7、：定义为化合物在一个相的总量除以另一个相中的总量。实际上是分配系数乘以两个相的体积比。在不同的层析机制中,分配系数K的含义不同,在吸附层析中,K为吸附平衡常数;在分配层析中,K为分配系数;在离子交换层析中K为交换常数.,分配系数K值大,说明物质在层析中被固定相吸附得比较牢固,随流动相迁移的速度较慢,留在固定相中的时间较长,在洗脱液中后出峰。若分配系数K值小，则该物质在洗脱液中较早出峰。,从一个混合物中分离和纯化一种生物物质的纯度如何，取决于混合物中各组分K 值的差异程度。混合物中各组分若 K值相差较大,则能较易地把混合物中的生物物质分离。反之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物质分离。,2.
8、讨论层析中的移动情况 通常采用平衡过程的研究方法,把层析柱划分为若干连续部分,每个体系都达到平衡。理论板数(n)：在层析柱上，溶剂连续不断加入，化合物在流动相和固定相中不断分配平衡，所发生的平衡次数称为理论板数。,凝胶层析 Gel Chromatography,一、定义,凝胶层析是按照被分离物质分子大小,经过具有一定孔径的多孔物质进行分离的一种方法。其又称为凝胶过滤或分子筛过滤或排阻层析。,主要机理是分子筛效应,当被分离物质流经凝胶柱时,因各组份的分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。,二.基本原理,流动相（洗脱液）固定相（凝胶）原理：被分离
9、物质中各组分的分子量不同。,进入具有一定孔径的凝胶柱后,较大的分子不能进入凝胶孔隙中,被排阻在外,而较小的分子则能进入凝胶孔隙,加入洗脱剂后,大分子就随洗脱剂从凝胶间隙洗脱下来,受到的阻力小,其流速较快,小分子物质从上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝胶孔隙中,这样多次反复,大分子物质先从柱中流出,小分子物质后流出。,小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留,大分子被排阻在凝胶颗粒外面,在颗粒之间迅速通过。,凝胶层析过程的数理关系,柱床体积(VT)即凝胶体积以及颗粒 内外间隙体积的总和。VT=1/4 D2h D是内壁的直径h是凝胶层析柱床的高度。,洗脱体积（Ve）即欲分离物质通过层析 柱洗脱
10、下来所需洗脱液 的总体积。外水体积（V0）即存在于柱床内凝胶外 面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中流 动相的体积。,内水体积（）即凝胶颗粒内部所含 水相的体积，它可从 干凝胶颗粒重量和吸 水重量求得。凝胶干体积（）,+,洗脱体积与及之间的关系,（）,为样品组分的分配系数，也可以说 是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数与柱的物理条件无关。,可通过实验求得。Ve为实际测得洗脱体积。Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好有颜色以便于观察如Hb、印度黑墨水）通过实际测量求出.V
11、i可由gWr求得（g为干凝胶重,单位为克,Wr为凝胶的吸水量以ml/g表示）。,Ve-Vo Kd=Vi（1）Kd=0时,Ve=Vo,意味着该分子完全被排阻于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相分布为0,而最先流出。（2）当Kd=1时,Ve=Vo+Vi,意味着该分子完全不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部,它能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的比值为1,而最后流出.（3）当0 Kd 1,Ve=Vo+ViKd为处于两种极端行为之间的分子。,（4）Kd 1现象说明凝胶对组分有吸附作用,此时VeVo+Vi,例如一些芳香族化合物的洗脱体积远远超出理论计算的最大值,这些化合物的Kd 1如
12、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。,因此分子的正常Kd值01之间,这种由小到大的Kd值顺序决定了物质流出的顺序。,Ve与MW的关系,对同一类型的化合物,洗脱特性与组分的分子量有关,流过凝胶柱时,按分子量(MW)大小顺序流出,MW大的走在前面,Ve与MW的关系可用下式表示:Ve=K1-K2lgMW K1 K2 为常数,MW为分子量,三.凝胶层析的特点,（一）优点,1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结 构稳定,所以凝胶本身不与样品发生化学反应。2.凝胶层析的操作条件较温和,不易引起生 物物质的变性,即使用来分离一些理化性 质不稳定的物质也很少被破坏。3.样品得率高,重复性好.如果按比例扩大柱 的体积和高
13、度,可进行大量样品的分离纯 化。,（二）缺点,1.要求样品和洗脱液的粘度很低。2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被 纯化的物质的分子量范围受到限制。3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用,如 芳香族化合物与脂蛋白等。,四.凝胶的结构与性能,1.葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）结构：葡聚糖用交联剂1-氯代-2,3-环丙烷使葡聚糖之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联 聚合而成的三维空间网状结构。,OH,特点：Sephadex 的三维空间网状结构的网孔大小取决于交联度,交联度的大小可在合成Sephadex 时控制加入交联剂的百分比决定.交联剂的百分比高,交联度大,网状结
14、构愈紧密,孔隙愈小,吸水后膨胀也愈小,机械强度高,分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百分比低,分离物质的分子量大。G类Sephadex的型号表示每克干凝胶吸水量x10,如G-50表示每克干凝胶吸水量为5ml。Sephadex的化学性质稳定,不溶于水、盐、弱酸和碱,耐热耐碱不耐酸。,2.琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)它是一种大孔凝胶,其工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限,可分离MW40万以上的物质,因此可用来分离核酸及病毒。琼脂糖凝胶不带电荷,不受微生物作用而降解,但对热不稳定,易受pH影响(只在范围内稳定.,3.聚丙烯酰胺凝胶使用范围及效果同葡聚糖凝胶相似,但化学性质较葡
15、聚糖稳定,可在pH2-11范围内使用.聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶P（Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。,4.凝胶的选择 选择何种凝胶以及它的型号,这需要根据实验条件,溶质的分子量的大小和分离工作的目的而定,每种型号凝胶都有一定分离溶质分子量的范围,选择的型号凝胶要能满足实验要求。,六.其它条件选择,1.柱的选择 层析的长度（L）与直径（D）之比（L/D）对层析分辨率有影响,一般对用于组别分离的层析柱其L/D为1518：1,层析柱的体积一般大于样品体积的410倍,这类常用于脱盐.对于分级
16、分离可采用L/D 40：1,甚至100：1,层析柱体积一般大于样品体积的25倍。柱短而粗,则易使样品稀释,柱长而窄,则柱的管壁效应较大,会造成拖尾现象。,2.样品的选择：量适当,粘度小。3.洗脱液的选择：每种样品分离所用的缓冲洗脱液应根据使样品稳定的原则使用。,七.应用,1.分离纯化 2.脱盐 3.高分子溶液的浓缩 4.测分子量,凝胶层析法分离蛋白质,原理 血红蛋白（Hb，分子量64 480左右）与二硝基苯鱼精蛋白（DNP鱼精蛋白，分子量2 00012 000）混合物，由于分子大小不同，通过Sephadex G50层析受阻滞程度有差异，从而达到分离。,器材层析柱（1.525ml）等试剂1.样品
17、液：DNP-鱼精蛋白、Hb2.Sephadex G-50,操作,1.装柱：在层析柱的底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占体积的1/3时，关闭下端出口，自顶部缓缓加入已处理好的Sephadex G-50悬液，待底部凝胶沉积12cm时，再打开出口，凝胶加至凝胶沉积离层析柱口约3cm即可。,装柱注意点：不得有气泡和分层；凝胶表面应平整；柱床体积稳定；不能让凝胶表面露出水面。,2.加样：取样品液5滴即为上柱样品。将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面，注意尽量不要使平整的
18、床表面搅动，然后打开出口，让样品进入床内，直至床面恰好露出，用上法不断加蒸馏水洗涤，立即用试管收集，待红色流尽，换试管收集。,3.观察实验现象，并计算Hb的洗脱体积（Ve）和DNP-鱼精蛋白的Ve。4.再生 用蒸馏水洗涤凝胶层析柱10分钟，此柱即可再生。,把菊根粉或白垩粉（CaCO3）装在玻璃管中，将植物叶子的石油醚提取液倒入管中，然后加入石油醚淋洗。随着淋洗进行，样品中各种色素向下移动的速度不同，逐渐形成一圈圈的连续色带。茨维特在当时的实验中观察到6个色带，它们分别是胡萝卜素、叶黄素和叶绿素A和B。,Chromatographic columnStationary phaseMobile phase or eluent,The mobile(top)and stationary(bottom)phases in column chromatography.,Paper chromatography is an analytical method.Note the very small sample volume spotted onto the plate.,
