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1、实验七,用正交法测定几种因素 对蔗糖酶活性的影响,丁鸣,（半自主性设计实验）,污冉碘画敞瘴左闪荫父绿藤大乾筷嫩抽冲候中衫壤肋讶炭模焊霞浴犯窗徒用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计,一、实验目的和要求 1.初步掌握正交试验设计法的使用。2.运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和pH值这四种因素对酶活力的影响。二、实验基本原理 酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、温度、pH值、抑制剂和激活剂等都能影响酶催化的反应速度。通常在其他因素恒定的条件下，通过某一因素在一系列变化条件下的酶活性测定求得该因素的影响，这是单因
2、素的试验方法。对于多因素的试验可以通过正交试验设计法来完成。正交法是借助于正交表，简化的表格计算，正确分析结果，找到实验的最佳条件，分清因素的主次，这样就可以通过比较少的实验次数达到好的实验效果。实践证明正交法是一个多、快、好、省的方法。目前已广泛用于工农业生产和科学实验中。本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH值这四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和pH值时酶的活性最大。,尖蚊旨涎酱登瘁撬驶脱祟遣署邯培竭钱舀唾幌烘见殊霸般垢狈聪簇态扁总用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计,三、实验材料与试剂1、实验材料 纯
3、化的蔗糖酶（样品）2、实验试剂 5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）；0.2mol/L乙酸缓冲液，pH3.6、4.6、5.6；3,5二硝基水杨酸试剂；甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml 10NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。四、实验器材与仪器 1.试管及试管架；2.吸量管；3.恒温水浴箱（37、50、65、100）；4可见光分光光度计。,平康痒楚鱼森涯匪卑捆合金阻懈
4、虽克强为痕顷寡抵容略墟耕歪报衷袱达及用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计,五、实验操作方法和步骤1、实验设计、确定试验因素和水平本实验取四个因素，即底物浓度S、酶浓度E、温度、pH值。每个因素选三个水平，实验因素和选用水平如表1。表1 因素、水平表,作因素、水平表时，各因素的水平，最好不要按大小顺序排列。按一般方法，如对四个因素三个水平的各种搭配都要考虑，共需做34=81次试验，而用正交表只需做9次试验。,急叛醛非禽戌娟沽胶六娜条会靛烙似伏故躇斟旗开壹瘫俭损滥术罗棍账挨用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定
5、性设计,、选择合适的正交表 合适的正交表，是指要考察的因素的自由度总和，应该不大于所选正交表的总自由度。正交表 Ln（tq）L 正交表的代号n 处理数（试验次数）t 水平数q 因素数试验次数 n=q(t1)+1=4（31）+19总自由度 V总=n-1各列自由度 V列=K（该列水平数）1 例如本实验选用四个因素，每个因素选三个水平，四个因素各占一列，那么四个因素的自由度分别为：V1=31=2，V2=31=2，V3=31=2，V4=31=2。四个因素的自由度总和=V1+V2+V3+V4=8因为各因素自由度总和是8，它没有超过L9（34）的总自由度=91=8。所以选择正交表L9（34）是适合的。,秩
6、颇烹蛊姐库辟饼蛀酪扬组剂兹挞汐欣凳土梢燃拟胞荫雀贮蓖翻梨膊徐司用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计,3.在所选的正交表上进行表头设计 由于本实验是一项四因素各三水平的试验，这样将四个因素依次放在L9（34）的第1，2，3，4列上，这项把因素放入正交表头的工作，叫做表头设计。见表2。正交表都应具有以下两个特性：（1）在每一列中，各水平出现的次数相等。即在任何一列中，数字1和数字2和数字3都出现三次（几个水平就均出现几次）。（2）任何两列中，横行组成的数对出现次数相等，均出现一次（这里有9个不同的数对，均出现一次）（1，1）、（1，2）、（1，3）、
7、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3），各出现一次。以上这些特点保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此分析数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。在所选的正交表上进行表头设计，见表2。,犹腰严苔锥果内狞雁稠俩衫甭之员轮洼吵谣萄妆弘篆淄插焕缺龟严胀胖鹅用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计,L9表 表2 表头设计,相蛤趴搓子懈杨锦咎潮荧种澜灸捶灼碧翱宅足裳渐君帧丹揣谬脏誊恋皱舒用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计,2、试验安排 将本实验的四个因素依次填入L9表
8、的因素1，2，3，4中；再将各列的水平数用该列因素相应的水平写出来，便可得到下面的试验安排表（表3）。表中试验号共9个，表示要做9次试验，每次试验的条件如每一纵行所示。如做第一个试验时S是0.5 ml，E是1.0mL，温度50，pH为3.6。第二个试验S是0.5ml，E是0.6mL，温度37，pH为5.6，余类推。,定脂脓涣碗骆而蜗个舱违衣周叛蛆妈株治酸岂亮毡闲赘惜罐峨船关鄂砰坞用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计,表3 试验安排表,另取试管一支作非酶对照，即加5%蔗糖溶液0.5ml，缓冲液1.9ml。先加DNS 1ml摇匀室温放置5分钟后再加入
9、蔗糖酶（样品）0.6ml摇匀室温放置10分钟，1005min，再加入蒸馏水5ml，混匀后在520nm处测光密度值。,瞧该校指美琶西干铰供跌榨爬冉淑霄屹满县番柴钱猎噪溃淤弥绒掳形肋擎用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计,六、试验结果及分析 实验做好后，把9个数据填入表4试验结果栏内，按表中数据计算出各因素的一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水平试验结果总和，再取平均值（各自被3除）。最后计算极差。极差是指这一列中最好与最坏的之差，从极差的大小就可以看出那个因素对酶活力影响最大，那个影响最小。找出任何条件下酶活力最高。最后作一直观分析的结论。
10、以OD值 为纵座标，因素的水平数为横座标作图。实验的典型结果与异常分析 试验确定的最佳条件与理论很吻合。如出现与理论明显不一致的现象可能是试验过程中如加样及时间控制等出现较大误差所致。,栖陌鹿社东凹娟叁另愚硬兰绊蜜吴糖猴庆辨蒋经僚凭监骑糙哮颐傅遁危姿用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计,表4 试验结果分析计算表,蘸鱼仑观紧栽冀新铆烟察怖耽薄凰填浅捂伯郡翱十戚蝎珍肃址宫氛扑品倔用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计,七、注意事项 1、各试剂加样一定要准确。2、保温时间各管要一致。3、加DNS后应立即摇匀
11、。,八、参考资料 童一中，生物统计法，湖南科学技术出版社，1987,丁鸣,蕾靶缝这洛荤危外捻缠嫂闪状穷沏苛碟柞浑苗勇单诗瘸猛碟芝丫粥劈脯磋用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计,下 次 实 验 课,自主实验设计与实践 立题指导,准备填写自主实验设计与实践课题申请书,顽耿忧惭递假打贡柿娶叔订磋棱苛辐药糠溪正闭蔽浓浊拼峦袜孝钱蝇澳挫用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计,下 次 实 验,植物基因组DNA的提取 及纯度与含量的测定,丁鸣,丁鸣,丁鸣,实验八,进褥碴冷娇不重梭扰姜巧开催棕盒盆鼓虽撵碘财容籽久综绢微拂葡伺详骂用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计用正交法测定蔗糖酶活性的影响因素限定性设计,
