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1、第十二章植物细胞大规模培养 教 学 内 容,1、植物细胞培养基 2、植物细胞培养方法 3、植物细胞的大规模培养技术 4、影响植物细胞培养的因素 5、植物细胞培养反应器,前 言,植物中含有数量极为可观的次代谢物质。据保守的估计，目前已发现的植物天然代谢物已超过2万种，而且还在以每年新发现1600种的速度递增。我们祖先在与疾病的抗争中已各积累了丰富的利用植物中的生物活性物质治病强身的经验。李时珍（1953）编纂的巨著本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物。目前仍约25%的法定药品来自植物。然而植物生长缦慢，自然灾害频繁。即使是大规模人工栽培仍然不能从根本上满足人类对经济植物日益增长的需求。
2、因此早在1956年，Routier和Nickell就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。,第十二章 植物细胞的大规模培养,中草药,Reinhard等（1968）首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱(harmine)。紧接着Kaul等（1969）、Furrya等(1972)和Teuscher等（1973）分别培养植物细胞获取了其中的薯蓣(yu山药）皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）。现在一些发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜力十分巨大的生产领域。目前世界最大批量工业化培养细胞（烟草细胞）已达2万升（20吨）。我国在“八五”、“九五”和“863计划”
3、中连续拨款资助工业化培养红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。,植物细胞培养是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。,鉴于有些产物的唯一来源只能是植物，而许多有价值的植物只能生长在某一特定的地理区域，且受到很多自然条件的限制和影响，尤其是有些植物从种植到收获要花几年时间，很难满足需要。采用大规模植物细胞培养技术就可以直接生产这些产物。如可作为药物和染料的紫草宁就是典型的通过大规模植物细胞培养生产的产品，通过大规模培养紫草细胞短时间内就可大量生产紫草宁。表1
4、2-1是植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较。,表12-1植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较,目前，植物细胞培养技术已在农业、医药、食品、化妆品、香料等领域广泛用于大规模生产有价值的产品。小规模的细胞培养通常在培养瓶中完成，而大规模的培养可在发酵罐中进行。,问题,请列举出3至5种由大规模培养植物细胞获得的有经剂价值的产物。,紫草宁,抗肿瘤药物紫杉醇,薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）,与动物细胞培养相比，植物细胞培养的最大优点是植物细胞可以在简单的合成培养基上正常生长。用于植物细胞培养的基础培养基成分基本上与整个植物的要求一样，但是用于培养细胞、组织和器官的培养基
5、需要满足各自的特殊要求。根据特定的植物种类和培养系统，培养基的基本营养成分可作适当的调整。,一、植物细胞培养基,植物细胞培养基通常包括无机盐、碳源、维生素、生长调节素和有机添加剂等。无机盐类 包括：无机盐浓度一般为多少？微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁等。碳源和能源 P225 维生素 植物细胞的生长都需要硫胺素。可在植物细胞培养基中加入烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素和叶酸等。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。,1、植物细胞培养基的组成,植物生长激素 大多数植物细胞培养基中都含有天然的或合成的植物生长激素。生长激素包括了植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸等四大类。有机氮源 通常
6、采用的有机氮源有蛋白质水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等。P225 有机酸 加入丙酮酸，或者柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等三羟酸循环的中间产物，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且使细胞对钾盐的耐受能力至少提高到10mmol/l。除此之外，这些有机酸还能提高低密度接种的细胞和原生质体的生长。复合物质 在植物细胞的培养过程中，酶母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等复合物质通常可以作为细胞的生长剂。,目前应用最广的基础培养基主要有MS、B5、E1以及N6培养基。表12-2列出了这几种常用的植物细胞培养基。,1、植物细胞培养基组成包括 等。,问题,2、植物生长素、细胞激动素、赤霉素对植
7、物细胞培养上有何作用？,2、植物细胞培养基的制备,制备培养基时，培养基中使用无机盐、碳源、维生素、有机酸和植物生物激素都应该采用最高纯度级的试剂和药品。有些生长激素在使用前需要进行重结晶提纯。由于一些生长激素难溶于水，配制时可先溶于2-5ml的酒精中，其酒精-水溶液要用吸附法进行脱色处理，然后慢慢加入蒸馏水，稍微加热后，再稀释至所需体积。,配制培养基的用水应严格地采用蒸馏水或高纯度的去离子水，其中以玻璃器皿制备的蒸馏水最好-1的HCL或0.2 m0l.l-1的NaOH进行调节。当需要使用固体培养基时，须加入琼脂。配制好的培养基按要求装入三角瓶或试管中，121下灭菌20min，待冷却后就可以使用
8、。对于一些热敏性化合物，如L-谷氨酰胺、植物生长激素等，灭菌时不可采用加热法，而应该采用过滤法灭菌，然后无菌操作加入到已灭菌的培养基中。,植物细胞培养基的制备是非常严格的,植物细胞培养基制备时对水有哪些严格要求？,问题,由于培养基中的组份种类繁多，且一些组份量很小，配制起来很繁锁，因此往往把培养基配制成使用浓度的10或100倍的母液，使用时再按需要稀释至使用浓度。培养基母液或经稀释后的培养基应置于冰箱内，在10度以下保存待用。一般含有有机物或激素类物质的培养基母液或稀释液最好保存时间不超过十天。在培养基配制过程中需要注意的是，为了防止在高浓度下，培养基份间相互作用产生沉淀，诸如CaCL2、KI
9、、EDTA的钠或亚铁盐需要单独配制保存，使用时再稀释混合。,二、植物细胞培养方法,原生质体培养：植物的体细胞（二倍体细胞）经过纤维素酶处理后可去掉细胞壁，获得的去壁细胞称为原生质体。该原生质体在良好的无菌培养基中可以生长、分裂，最后可以长成植株。实际过程中，可以用不同植物的原生质体进行融合与体细胞杂交，由此可获得体细胞杂交的植株。,植物因受创伤而在伤口附近产生的薄壁组织,植物细胞培养方法主要有-等。单倍体细胞培养：主要用花药在人工培养基上进行培养，可以从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者是通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。,固体培养：固体培养是在微生物培
10、养的基础上发展起来的植物细胞培养方法。固体培养基的凝固剂除特殊研究外，几乎都使用琼脂，浓度一般为6%-10%。接种材料放在培养基上，原生质体固体培养则需混入培养基内进行嵌合培养，或者使原生质体在固体-液体之间进行双相培养。液体培养：液体培养也是在微生物培养的基础上发展起来的植物细胞培养方法。液体培养可分为静止培养和振荡培养等两类。静止培养不需要任何设备，适合于某些原生质体的培养。振荡培养需要摇床或转床等设备使培养物和培养基保持充分混和以利于气体交换。悬浮培养：（主要）植物细胞的悬浮培养是一种使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的方法。在进行细胞培养时，需要提供容易破裂的愈伤组织进行液体振荡培养，
11、愈伤组织经过悬浮培养可以产生比较纯一的单细胞。用于悬浮培养的愈伤组织应该是易碎的，这样在液体培养条件下能获得分散的单细胞，而紧密不易碎的愈伤组织就不能达到上述目的。固定化培养 主要 固定化培养是在微生物和酶的固定化培养基础上发展起来的植物细胞培养方法。该法与固定化酶或微生物细胞类似，应用最广泛的、能够保持细胞活性的固定化方法是将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。,三、植物细胞的大规模培养技术,目前用于植物细胞大规模培养的技术主要有植物细胞的大规模悬浮培养和植物细胞或原生质体的固定化培养。,1、植物细胞的大规模悬浮培养,前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生物质的积累；后者则相反，细胞生长缓慢
12、而次生物质含量相对较高。,1953年Muir成功地对烟草和直立万寿菊的愈伤组织进行了悬浮培养。继之Tulecke和Nickell（1959）推出了一个20L的植物细胞封闭式悬浮培养系统。经蒸汽灭菌后接入目的培养物，以无菌压缩空气进行搅拌。当营养耗尽，细胞数目不再增加且次生物质达一定含量时，收获细胞，提取产物。他们用此系统成功地培养了银杏、冬青、黑麦草和蔷薇等细胞。结构简单，易于操作是本系统的突出优点。但它的生产效率不够高，次生物质累积的量也较少。,阅读课本P228-23010分钟,悬浮培养中的植物细胞的特性,由于植物细胞有其自身的特性，尽管人们已经在各种微生物反应器中成功地进行了植物细胞的培养
13、，但是植物细胞培养过程的操作条件与微生物培养是不同的。,植物细胞培养液的流变特性,1、在悬浮培养时，植物细胞是以单一存在还是以细胞团形式存在？,问题,2、植物细胞以细胞团形式存在存在原因？,3、人们常用粘度这一参数来描述植物细胞培养液的流变学特征，培养液粘度的变化主要是由于什么引起，而不是分泌物引起？,植物细胞培养过程中的氧传递,由上述情况可以看出，氧对植物细胞的生长来说是很重要的，但是CO2的含量水平对细胞的生长同样相当重要。研究发现，植物细胞能非光合地固定一定浓度的CO2，如在空气中混以2%-4%的CO2能够消除高通气速率对长春花细胞生长和次级代谢物产率的影响。因此，对植物细胞培养来说，在
14、要求培养液充分混合的同时，CO2和氧气的浓度只有达到某一平衡时，才会很好地生长，所以植物细胞培养有时间需要通入一定量的CO2等气体。,把课本的两句话划线,4、说说过高的通气速率对植物细胞的生长不利原因？,5、植物细胞培养时为什么有时要通入一定量的CO2气体？,泡沫和表面粘附性,6、植物细胞培养时产生的泡沫有何特点？,悬浮细胞的生长与增殖,悬浮培养时细胞的生长曲线如图12-1所示，细胞数量随着时间的变化曲线呈现S形。在细胞接种到培养基中最初的时间内细胞很少分裂，经历一个延迟期后进入对数生长期和细胞迅速增殖的直线生长期，接着是细胞增殖减慢的的减慢期和停止生长的静止期。整个周期经历时间的长短植物种类
15、和起培养细胞密度的不同而不同。在细胞培养过程中，一般在静止期或静止期前后进行继代培养，具体时间可根据静止期细胞活力的变化而定。,图12-1 悬浮培养时细胞的生长曲线,静止期,减慢期,直线生长期,对数生长期,延滞期,由于悬浮培养具有：增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；可带走培养物产生的有害代谢产物，避免有害代谢产物局部浓度过高等问题；保证氧的充分供给等三个基本优点，使悬浮培养细胞的生长条件比固体培养有很大的改善。,细胞团和愈伤组织的再形成和植株的再生,悬浮培养的单个细胞在3-5d内即可见细胞分裂，经过一星期左右的培养，单个细胞和小的聚集体不断分裂而形成肉眼可见的小细胞团。大约培养两周后
16、，将细胞分裂再形成的小愈伤组织团块及时转移到分化培养基上，连续光照，三星期后可分化出试管苗。,表12-1植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较,紫杉醇是近年发现的重要的抗癌药物，能有效地治疗卵巢癌、乳腺癌等妇科癌症。但由于紫杉醇是从珍稀植物紫杉提取的，所以如何得到充足的药物一直是医学和环境学家争论的问题。紫杉醇的生产只能通过大量的砍伐这种珍稀植物，这显然将对环境产生不良影响。所以目前科学家们正在开展紫杉醇细胞培养法进行生产和研究。我国在“八五”、“九五”和“863计划”中连续拨款资助工业化培养和生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。,复习,请列举出3至5种由大规
17、模培养植物细胞获得的有经剂价值的产物。,紫草宁,抗肿瘤药物紫杉醇,薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）,2、植物细胞或原生质体的固定化培养,由于固定化植物细胞培养比自由悬浮细胞培养具有较高的机械稳定性、产率，更长的稳定（生产期）等许多优点，因此，通常采用固定化来进行植物细胞的培养。这类培养包括了植物细胞和原生质体的固定化培养。,植物细胞固定化的常用方法有哪些？,问题,细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面。其前提就是通过悬浮培养获得足够数量的细胞。,针对上述细胞悬浮培养的缺点，Brodelius等（1979）首次报道了用海藻酸钙成功固定培养橘叶鸡眼藤、长春花、希
18、腊毛地黄细胞。实验证明，细胞分化和次生物质积累之间存在正相关性。细胞固定化后的密集而缓慢的生长有利细胞的分化和组织化，从而有利于次生物质的合成。此外，细胞固定化后不仅便于对环境因子的参数进行调控，而且有利于在细胞团间形成各种化学物质和物理因素的梯度，这可能是调控高产次生物质的关键。,海藻细胞的固定化,为什么说植物细胞固定化培养更有利于次生生物的生成？,问题,以下简要介绍褐藻钙固定植物细胞的技术路线：大量培养植物细胞 混合 倒入塑料注射器 慢慢滴入含氯化钙的培养基一定浓度的海藻酸钠溶液 海藻酸钙固定的细胞团,小规模固定化小规模的植物细胞固定化可用无菌的塑料注射器进行。配制一定浓度的海藻酸钠溶液，
19、高温、高压灭菌。通过离心或过滤收集植物细胞，将细胞悬浮于海藻酸钠溶液混合，倒入塑料注射器中，慢慢滴入到含有CaCl2的培养基中，不断搅拌，使之形成球形颗粒，然后通过过滤收集颗粒，用含有CaCl2的培养基清洗后，转入装有培养基的摇瓶中进行培养。,图12-2大规模植物细胞固定化装置,含CaCl2的培养基,盖子,空气出口,海藻酸钠+细胞悬浮液,喷嘴,无菌空气入口,大规模固定化植物细胞的大规模固定化原则上可根据上述方法进行，但是不能再用塑料注射器，而需要采用如图12-2所示的大规模细胞固定化装置进行细胞的固定化。,卡拉胶固定化 P230,琼脂糖固定化 P231,琼脂固定化P231,由于原生质体比完整的
20、细胞更脆弱，因此，只能采用最温和的固定化方法进行固定化。通常也是用海藻酸盐、卡拉胶和琼脂糖进行固定化。,原生质体的固定化,1、用卡拉胶固定化植物细胞方法有哪些？,问题,2、琼脂糖固定化和琼脂固定化的最大优点是什么？,3、在植物细胞固定化的四种方法，哪些方法需要其它离子来保持胶的稳定性？分别用什么离子？,总之，人类迄今通过植物细胞培养获得的生物碱、维生素、色素、抗生素以及抗肿瘤药物不下50多个大类，其中已有30多种次生物质的含量在人工培养时已达到或超过亲本植物的水平。在已研究过的200多种植物细胞培养物中，已发现可产生300余种对人类有用的成份，其中不乏临床上广为应用的重要药物。利用培养植物细胞
21、工厂化生产生物天然次级代谢产物的美好前景已经十分清楚地展现在我们面前。深入发掘我国特有的巨大中草药宝库，结合现代细胞培养技术，我国植物细胞次生物质的研制与生产一定会硕果累累，后来居上。,3、植物细胞培养方式,植物细胞的培养方式主要有间歇培养、连续和固定化培养等多种。,间歇培养,两级或多级间歇培养,流加间歇培养,阅读课本P232-2338分钟,固定化细胞培养,连续培养,单级连续培养,多级连续培养,回流式连续培养,固定化细胞培养具有许多潜在的优越性，如能提高生产能力、保护细胞、换液方便、能除去有毒或抑制性代谢物等。这些优越性使固定化细胞培养具有很大的吸引力。选用固定化细胞培养应具有如下两个条件：目
22、的产物应自然分泌到培养液中，或者通过改变PH值、离子强度或使用渗透剂使之分泌于培养基中；要求产物的形成在细胞生长之后。,四、影响植物细胞培养的因素,植物细胞生长和产物合成动力学也可分三种类型：生长偶联型，产物的合成与细胞的生长呈正比；中间型，产物仅在细胞生长下降时才能合成，细胞处于指数生长期时，次级产物含量下降，但细胞生长停止时，产物合成也停止；非生长偶联型，产物只有在细胞生长停止时才能合成。事实上，由于细胞培养过程较复杂，细胞生长和次级代谢物的合成很少符合以上模式，特别是在较大的细胞群体中，由于各细胞所处的生理阶段不同，细胞生长和产物合成也许是群体中部分细胞代谢的结果。此外，不同的环境条件对
23、产物动力学也有很大的影响。,1、细胞的遗传特性,对于植物细胞的培养及其产物的合成，影响细胞培养的因素很多，除了细胞本身的特性外，环境等其他因素对细胞的培养也有很大影响。,阅读课本P233-2348分钟,1、在进行植物细胞的培养时，为什么先弄清楚产物的合成部位？,问题,2、培养的环境条件,PH值,温度,营养成分,光,2、影响植物细胞培养的环境条件有哪些？,搅拌和通气,前体和调节因子,3、植物细胞培养的温度和PH值一般为多少？,4、一般说，增加 的含量会使细胞的生长加快，增加培养基的 含量可以增加细胞培养物的次生代谢产物？,5、为什么说机械搅拌造成的剪切对植物细胞影响较大？,6、在植物细胞培养中，
24、生长调节剂有何作用？,7、在植物细胞培养中，加入外源前体物质有何作用？,8、植物细胞大规模培养可划分为哪两个阶段？,值得注意的是，影响植物细胞培养物的生物量增长和次生代谢物积累的因素是错综复杂的，往往一个因素的调整会影响到其他因素的变化，所以，需要在培养过程中不断加以平衡和研究。同时，由于不同的植物有机体有其本身的特殊性，因此，对于一种植物或一种次生代谢物合适的条件，不一定对其他的细胞或次生代谢作用也是合适的。目的，对植物细胞大量培养一般分成两个阶段：第一阶段是利用生长培养基，尽可能快地使细胞的生物量得到增长；第二阶段是通过生产培养基来诱发和保持次生代谢作用。,五、植物细胞培养反应器,植物细胞
25、培养用的反应器主要有机械式搅拌生物反应器、鼓泡塔与气升式生物反应器、填充床式生物反应器、流化床生物反应器和膜式生物反应器等。,1、机械式搅拌生物反应器(P234),2、鼓泡塔与气升式生物反应器(P234),3、填充床生物反应器,如图12-4（a）是填充床生物反应器。在填充床生物反应器中，细胞可以位于支撑物表面，也可以包埋于支撑物之中，培养液可以流经支撑物颗粒，不断被细胞所利用。填充床生物反应器已被用于植物细胞的培养。,（a）,（b）,出口,出口,进口,进口,填充床生物反应器,流化床生物反应器,填充床生物反应器的优点在于单位体积固定细胞量大，但是填充床反应器还存在许多缺点，它的混合效果低，对必要
26、的氧传递、PH、温度控制和气体产物的排除造成了困难，影响了细胞的培养，同时大颗粒的低效率传质、填充体成分供应和排除的困难，限制了填充床反应器应用于不要求细胞活性的生物转化。,2、流化床生物反应器,典型的流化床生物反应器是利用流体的能量来悬浮颗粒的。如图12-4（b）是流化床细胞反应器。由于使颗粒呈流化状态所需的能量与颗粒大小成正比，因此，通常采用小固定化颗粒，这些小颗粒良好的传质特性是流化床反应器的主要优点。流化床生物反应器的最大缺点是剪切和颗粒碰撞会损坏固定化细胞。,（a）,（b）,出口,出口,进口,进口,填充床生物反应器,流化床生物反应器,3、膜生物反应器,在植物细胞培养过程中，主要采用的是中空纤维和螺线式卷绕反应器。如图12-5所示。膜反应器的优点是可以重复使用，因此，尽管投资较大，仍较经济。另外，由于植物细胞代谢不像微生物那样旺盛，因而可以采用更厚的细胞层。,细胞,细胞,营养物入口,营养物入口,营养物出口,营养物出口,营养物质,图12-5 固定化细胞膜反应器,a-中空纤维反应器,b-螺线式卷绕反应器,Thank you！,END,
