《07第七章色谱法分离原理.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《07第七章色谱法分离原理.ppt（71页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、第七章 色谱法分离原理,71 概 述,色谱法是一种分离技术，是混合物最有效的分离、分析方法。俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置色谱原型装置，如右图所示。,茨维特实验,一、色谱：,色谱法又叫色层法、层析法，以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法。,色谱柱：进行色谱分离用的细长管。固定相：管内保持固定、起分离作用的填充物。流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。,色谱法分离实质：当流动相中携带的混合物 流经固定相时，其与固定相发生相 互作用。由于混合物中各组分在性 质和结构上的差异，与固定相之间 产生的作用力的大小、强弱
2、不同，随着流动相的移动，混合物在两相 间经过反复多次的分配平衡，使得 各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。,两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础,二、色谱分析法的崛起：,三、色谱的分类：,1.按流动相和固定相的物理状态分类：,气相色谱（流气）,液相色谱（流液）,2.按产生分离过程的相系统的形式分类：,用玻璃柱子做色谱柱，固定相填装在柱子中,用毛细管做色谱柱，固定相填装在管壁,用平整的板子作固定相支持的载体，固定相平铺在板上,3.按分离过程原理分类：,吸附,萃取,静电作用和扩散,扩散,生物特性,4.按展开程序分类：,组分与固定相作用力 流动相与固定相作用力,组分与固定相
3、作用力 流动相或其他物质与固定相作用力,将试样连续地通过色谱柱，吸附或溶解最弱的组分，首先以纯物质状态流出色谱柱，然后顺次流出的是次弱组分和第一流出组分的混合物，依次类推，从而实现混合物分离的色谱法。,四、色谱法的特点：,分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体，手性异构体。灵敏度高 可以检测出10-6级甚至10-9级的物质量。分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。应用范围广 气相色谱：沸点400的各种有机或无机样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足之处：被分离组分的定性较为困难。,五、色谱分离过程：,色谱分离过程是在色谱柱内完成的,72 线性洗
4、脱色谱及名词术语,一、线性洗脱色谱：,1.分配等温线与分配系数K：,分配等温线：在一定温度 下，溶质在固定相与流动 相之间的分配曲线，此曲 线称为分配等温线。,分配系数K：分配等温线 的斜率。,若K与浓度无关，则分 配等温线为直线；,在色谱过程中，图中 的C、D型很少出现；A、B型常见，但不能 用于测定；,在溶质浓度低时，Cs 基本上正比于Cm，曲 线近似直线。,2.线性洗脱色谱：,在色谱中，分配系数K为常数时所进行的色谱 过程，即称为,线性洗脱色谱。,结论：,CS值大，则K值大，溶质进入固定相的量就多。,推论：,溶质流过色谱柱时，分配系数K值大的组分通过色谱柱所需时间长，而K值小的组分通过色
5、谱柱所需时间短。当样品中各组分在两相的分配系数K不同时，就能实现差速迁移，达到分离的目的。,二、相关术语：,色谱图：,色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图。纵坐标为信号强度，横坐标为保留值。,保留值：,（热力学因素）即组分在色谱柱中固 定相上停留的时间。,式中各项单位可用 min、s、cm等表示；,保留时间是色谱定性的基本依据，但同 一组分的保留时间受流动相流速的影响，因此，色谱定性分析常采用保留体积等 定性。,=tR-tM,实际上是组分在固定相中停留的总时间；,死体积VM：,指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒之间的空间、色谱仪器管路的空间及检测器的空间的总和。或者说，在死时
6、间内通过色谱柱的流动相体积。VM=tMF0（流动相流速，L/min）,保留体积VR：,在保留时间内通过色谱柱的流动相体积。即将组分从柱中带出所需的流动相体积。VR=tRF0,相对保留值 r21：,某组分2与组分1的调整保留值之比。,某组分的保留体积扣除死体积后的剩余体积，称为该组分的调整保留体积。=VR-VM,调整保留体积：,r21只与色谱柱温度和固定相的性质有关，与色 谱柱的柱长、柱径、填充情况以及流动相流速 无关，因此，它是一个广泛使用的定性数据；,在多元混合物分析时，通常选择一对最难分离 的物质对，将它们的相对保留值作为重要参 数。在这种情况下，r21可用表示：,为后出峰的组分的调整保留
7、时间，故总是大于1的。,分配比k：,也称容量因子。它是指组分在固定相和流动相中的分配量之比。,区域宽度：（动力学因素）,标准偏差：0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。,三、色谱图的作用：,73 色谱法基本原理,一、色谱法中组分分离条件,A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓,两组分的分配系数必须有 差异；,区域扩宽的速率应该小于 区域分离的速率；,在保证快速分离的前提下，提 供足够长的色谱柱。,二、色谱法基本理论,塔板理论,1.理论假设,将色谱柱视为精馏塔，即色谱柱是一系列连续的、相等的水平塔板组成，每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度，简称板高。,流动相进入色谱柱不是连续进行的，而
8、是 脉动式，每次进气为一个塔板体积(Vm)；,所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且 试样沿轴（纵）向扩散可忽略；,分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某 一塔板上的量无关。,塔板理论假设：,在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间 迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板 高度H；,2.理论塔板数（溶质平衡次数）,根据塔板理论假设，在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：,理论塔板数,色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。,色谱柱分离混合组分的能力,3塔板理论对色谱的解释：,第一
9、，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n 大于50时，可得到基本对称的峰形曲线；,第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相 间的分配系数有微小差异，经过反复多次 的分配平衡后，仍可获得良好的分离；,第三，n与半峰宽及峰底宽的关系式为：,即在tR一定时，若色谱峰越窄，则n值越大，H越小，柱效能越高。,4.有效塔板数,注意：同一色谱柱对不同物质的柱效能是不 同的。当选用这些指标表示柱效时，应指明对何种物质而言。,5.塔板理论的特点,定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率；,成功点：,解释了流出曲线的形状；,提出了计算和评价柱效能高低的参数。,不足点：,定性地给出板高的概念，却不能找出影 响板高的因素
10、；,不能说明为什么在不同的流速下，可以 测得不同的理论塔板数。,速率理论：,速率理论指出：在色谱分离过程中，谱峰的扩 宽受涡流扩散、分子扩散和传 质阻力三个动力学因素的控制。,板高方程为：,A、B、C 常数。A为涡流扩散项系数 B为分子扩散项系数 C为传质阻力项系数,流动相的平均线速度；,一定时，只有当A、B、C较小时，板高H才能小，柱效才会高；反之，则柱效低，色谱峰扩张。,1.涡流扩散项（A）,变宽的程度由下式决定：,A=2dp,A与填充物的平均直径dp和填充不规则因子有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关；,使用颗粒细和均匀的填料，采用均匀填充，是减小涡流扩散和提高柱效的有效途径。,气
11、体分子的分子扩散项系数B为：,B=2Dg,弯曲因子。它表示柱填充物 对分子扩散的阻碍程度。,Dg 组分在气相中的扩散系数（cm2.s-1）。Dg除与组分性质 有关外，还与组分 在气相中 的保留时间、柱温、柱压和载 气的性质等因素有关。,2.分子扩散项（）,为减小分子扩散引起的色谱峰变宽，可采用：,用较高的载气流速；,使用相对分子量较大的载气；,控制较低的柱温。,3.传质阻力项（C）,物质系统由于浓度不均匀而发生的物质迁移（从一相转入另一相）过程。,影响传质过程进行速度的阻力。,传质：,传质阻力：,气相传质阻力系数 Cg,Cg描述影响组分从气相转移到固定相表 面这一过程的传质速度的因素。,造成谱
12、峰扩宽,对于填充柱：,采用粒度小的填充物和相对分子量小的载气，可减小Cg值，提高柱效。,液相传质阻力系数Cl,Cl描述影响组分在液相中传质速度的 因素。,a.降低固定液含量，df减小，但容量因子k也 随之变小，对分离不利；,b.固定液含量一定时，df值随载体的比表面积 增加而降低。因此，一般用比表面积较大的 载体来降低df值；,c.提高柱温，Dl增大，但k值减小，故应控制 适当的柱温。,减小固定液的液膜厚度df，增大组分在液相中的扩散系数Dl，可以减小 Cl值。,4.范氏方程式（速率理论方程式：）,选择色谱分离条件具有重要的指导意义。它可以说明固定相的填充均匀程度、粒度、液膜厚度、载气种类和流
13、速等因素的变化对柱效和色谱峰展宽的影响。,74 分离度,一、柱效和选择性,柱效,色谱柱对相邻两峰分离的能力。,用理论塔板数n或有效塔板数n有效进行衡量,选择性,色谱图上两峰之间的距离大小。,一般用相对保留值表示两组分在给定色 谱柱上的选择性；,色谱柱的选择性主要取决于组分在固定相 上的热力学性质。,二、总分离效能指标分离度Rs：,分离度Rs：,定义：,相邻两组分色谱峰保留值之差与该两组分色谱峰基线宽度平均值之比。,定义式：,当Rs1时，两色谱峰总是有部分重叠；,当Rs=1.0时，两色谱峰的分离程度可达 98%；,当Rs=1.5时，两色谱峰的分离程度达 99.7%。,当Rs值更大时，分离效果更好
14、，但会延长 分析时间，使色谱峰变宽，对分析反而不 利。,Rs=1.5为相邻两色谱峰完全分离的标志,影响Rs的因素：,容量因子k值增大，分离度增大，分析时间 延长，甚至造成谱带检测困难。通常控制 容量因子k=27；,相对保留值有微小增大，都会使Rs值有 较大增加。当=1时，Rs=0,不能分离。,75 色谱定性分析和定量分析,一、定性分析：,色谱定性分析的任务：,比较已知物质与未知物质在相同条件下的保留参数或在固定相上的位置，即可确定物质物质是何种物质。,确定色谱图上每一个色谱峰所代表的是什么物质。,方法：,二、定量分析,色谱定量分析的理论依据：,在一定色谱条件下，组分的质量或其在流动相中的浓度，
15、与检测器的响应值成正比。,色谱峰面积,色谱峰峰高,峰高和峰面积的测定,峰高从色谱图上直接测量。,峰面积计算的办法求得：,定量校正因子,1.绝对校正因子,绝对校正因子表示单位峰面积或单位峰高所代表的物质质量：,2.相对校正因子fis,相对校正因子：,是指某组分i与基准物质S的绝对校正因子之比。,质量校正因子：,相对校正因子的测定,准确称取被测组分和标准组分的量，然后在实验条件下进行分析，测量各色谱峰的面积或峰高，代入fis表达式计算。,定量方法,1.外标法标准曲线法：,方法：,将待测组分的纯物质配成不同含量的标液，定量进样，然后以色谱图上对应的峰面积或峰高对百分含量作图，得标准曲线，在相同条件下
16、，注入同体积的试样分析，用内插法定量。,特点：,操作简单，不需测定校正因子；,适合工厂控制和自动化分析。,2.归一化法：,若试样中有n各组分，则组分i的百分含量为：,使用条件：,样品中所有组分必须都能产生可测量的色谱峰。,特点：,简便、准确，操作条件对分析影 响较小；,适于进样量不易测量准确的样品。,3.内标法：,方法：,在一定量的试样中，加入一定量某种纯物质作为内标物，然后进行色谱分析。根据被测组分和内标物的峰面积或峰高及内标物的质量，即可求得被测物的含量。,设：,以内标物作基准物质，则,要求：,a 内标物必须是试样中不存在的 物质；,b 内标峰应与试样中各组分峰分开；,c 内标峰应尽量接近欲分析峰。,特点：,定量准确；,操作条件影响较小；,每次测定都必须准确称量。,例：用3米长的填充柱进行色谱分离，得到如 下图所示的分离。为了使二者刚好能够分 离完全，柱子长度最短需多少？,解：,分析：,分离完全？,Rs1.5,最短柱长？,分离条件不变，H、k2、为常数,解：,由题可知，分离条件未变，故板高H、相对保留值、容量因子k等不变，它们是常数，则有：,对于3米长的色谱柱，由题给的条件可计算出它的分离度Rs值。,由图可知：,若要完全分离，则要求Rs1.5，设此时需要柱长为Lx，则有：,解之得：,答：（略）,本章结束,
