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1、质粒DNA的提取、酶切及检测,相关知识,基因工程又称DNA重组技术外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的操作包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、受体细胞,常用到的工具酶,限制性内切酶连接酶聚合酶 逆转录酶DNA酶和RNA酶,结构的三大要素：多克隆位点 选择标记（耐药性）独立的复制单位种类：质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC）,载 体,质粒（plasmid）,是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的
2、遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（1n个）松弛型复制（20个以上）,实验目的和要求 学习和掌握质粒提取的原理与操作、限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。,第一部分质粒DNA的提取,碱裂解法,一、实验目的,通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理与操作。,二、实验原理,在EDTA存在的条件下，经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附
3、着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有蛋白质，实验中加入碱性酚（pH8.0）和氯仿混合液的抽提可以除去蛋白质。含有质粒DNA的上清液用乙醇沉淀，获得质粒DNA。,三、主要试剂,溶液I，50 mM葡萄糖/25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA，pH 8.0；Tris-Cl控制溶液的pH，葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，,溶液II，0.2 N NaOH/1%SDS；,NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，这是由于细胞膜发生了从双层膜
4、结构向微囊结构的相变化所导致。SDS是为下一步操作做的铺垫。,溶液III，3 M醋酸钾/2 M醋酸。,钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀。因为基因组DNA太长了。醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。,平衡酚：氯仿（1：1）作用：酚使蛋白质的变性，但是水饱和酚的比重略比水重，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA,四、实验步骤,接含
5、PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中 12000rpm、离心2s，弃上清，收集菌体100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）3min加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置3min裂解菌体,加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性12000rpm，离心5min，取上清记录体积到一新管上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm
6、，离心2min，取上清记录体积到一新管上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），室温2min,12000rpm，离心5min沉淀用70%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）12000rpm，离心2min沉淀风干沉淀用20uL TE溶解，-200C保存,第二部分 质粒酶切,实验目的理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具掌握酶切的基本操作,实验原理,制性内切酶将质粒和外源基因用限制性内切酶酶切，再经过DNA连接酶连接，便可获得携带外源基因的重组质粒，重组质粒可以转移到另一个生物细胞中去，进而复制、转录和表达外源基因产物。限制性内切酶是能识别双链 DNA 分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中
7、的磷酸二酯键的核酸水解酶。EcoR和Hind的识别序列和切口是：EcoR:GAATTC;Hind:AAGCTT。G，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。,限制性核酸内切酶的命名法用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E.coli 用Eco表示，所以用斜体字。用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株用d，即Hind。如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如Hind,Hind，Hind等。,II型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性
8、内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：,粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5 GAA|TT_C 3 3 C_TT|AAG 5垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_
9、和表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5G和AATTC3、3CTTAA和G5二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：5 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 切割后形成5 GAT和ATC 3、3 CTA和TAG 5。这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。,平头末端：,影响核酸限制性内切酶活性的因素(1)DNA的纯度；(2)酶切消化反应的温度；(3)溶液中离子浓度及种类；(4)缓冲液的 pH值。,三、实验操作,加样时，严
10、格操作，做到准确无误。该项操作环节是整个实验的关键之一。,置于37水浴酶解1小时。,第三部分琼脂糖凝胶电泳,相关知识,琼脂糖凝胶琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。,核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系,核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系,不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。,影响迁移率的因素,DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压 一般5V/cm、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲
11、液的组成。,常用染料,EB:溴化乙锭，能插入DNA分子碱基对之间。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，呈橙红色。EB染料优点：染色操作简便，快速；灵敏度高；可以加到样品中或胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。GoldView I是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，与核酸结合后能产生很强的荧光信号，在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光。,一、实验目的,通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。,二、实验原理,核酸pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的
12、净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。不同分子量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。,三、实验操作步骤,琼脂糖凝胶的制备凝胶板的制备 加样电泳 结果观察,将0.08g琼脂糖溶解在100 ml的1TBE电泳液中,配制成0.8%琼脂糖凝胶溶液当琼脂糖溶液的温度降至6080时，加入GoldView I使其终浓度约为0.1l/ml,混匀后，迅速倾入预先安装好的凝胶板中。待其凝固后，小心取下梳齿，备用。加样至样品孔中电泳,调至恒压80v，使DNA向阳性方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约12cm处，停止电泳。紫外灯下观察电泳结果并进行拍照。,Relaxed circle,Linearized form,Super-coiled form,四、实验结果与讨论,根据观察结果，绘图。分析自提质粒的情况以及酶切情况。,
