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1、第六章 受精与生命的起始,受精 是指来自父本的精子和来自母本的卵子相互作用产生合子的过程。这一过程中发生了几个重要的事件，包括精子的顶体反应、精子穿透卵子透明带、卵子的皮层反应和透明带反应、减数分裂的完成及多精入卵屏障的产生。精子和卵子的相互作用就像一根导火索，引发了一系列的生物连锁反应，从而拉开了发育的序幕，一个新的生命将从此开始。受精既可以发生在体外，例如，大多数鱼类在繁殖季节，雄鱼和雌鱼交配时，将大量的精子或卵子排到水中，精卵在水中完成受精；也可以发生在体内，如一些水生动物和大多数陆生动物通过交配，精卵在雌性动物生殖道中相遇完成受精。,第一节 配子的结构,一、精子的结构一般来说，精子由头
2、部、中部(或颈部)和较长的尾部组成。如图所示：1 精子头部：呈流线型，几乎集中了精子全部的重量，由顶体囊泡（acrosomal vesicle)和精核构成。大部分精子的细胞质在其成熟过程中被排除，只剩下与精子功能有关的细胞器。在精子成熟过程中，细胞核逐渐变为流线型，在电子显微镜下，精核几乎看不到染色质丝和核仁，整个精核是一致密的结构，仅有很薄的一层原生质膜包围着，精子中所有的基因都不表达。固缩状态的精核有利于进入卵子及精子本身的运动。,顶体位于精核前端，它是由高尔基体演化而来。顶体中含有多种水解酶，这些酶在顶体反应中被释放出来，主要作用是溶解卵子的外膜。许多动物的精子中，如海胆在精核与顶体囊泡
3、之间有一富含球状肌动蛋白的区域，这些蛋白质在受精早期产生丝状延长，牵引精子入卵。在海胆及其他一些物种的顶体中还含有与精卵识别有关的分子。特别的是，大部分鱼类精子的头部都不具有顶体结构，这是由于鱼类卵子的外壳具有一精致的便于精子进入的漏斗状特殊结构受精孔 micropyle)，受精时不需要顶体的水解酶打孔。,为了适应不同的环境，成功地进行受精，不同的动物以不同的形式推动精子游动。某些动物(如蛔虫)的精子游动的能力来自于细胞膜的变形运动；为了游动更长的距离，大多数动物的精子依靠尾或鞭毛波浪式的摆动，推动精子在水或雌性动物生殖道中移动。2 鞭毛具有特殊的结构。轴纤丝(axoneme)是由位于精核基部
4、的中心粒发出的微管形成的，是鞭毛中起推动作用的主要部分。它的中心由两根微管组成，周围围绕着9组双微管结构。,在鞭毛中有几种蛋白质发挥着重要作用。首先是微管蛋白(tubulin)，顾名思义它是组成微管的基本蛋白质；其次，在外围双微管结构上附着一种蛋白质，它是精子推动力的主要提供者，因此称为动力蛋白(dynein)。动力蛋白通过水解ATP分子可以把化学能转化为机械能，作用于双微管结构，使其发生弯曲而导致鞭毛摆动，最终推动精子游动；组蛋白H1也是一种重要的鞭毛蛋白质。早先，人们认为组蛋白H1只存在于核酸中，它的主要作用是使染色质折叠形成紧密的串型结构，但是Mrultigner等人(1 992)在鞭毛
5、中发现了相同的蛋白质，并进一步证明它可以稳定鞭毛微管结构，防止去组装。,二、卵子的结构,一般卵子的体积比精子大很多，大约是精子体积的10000倍。精子仅携带极少量的细胞质，而成熟卵子中合成和吸收了大量的物质，像一个储存库，为以后的生长和发育奠定基础。卵子的胞质中储存了大量的蛋白质、RNA、保护性化学物质和形态形成因子。,1蛋白质：胚胎早期细胞的发育需要大量的储存能量和氨基酸。在大多数物种中，由肝脏合成大量卵黄蛋白，经血液运输到卵子中，以卵黄的形式储存起来。2核糖体和tRNA：早期胚胎需要合成自身的蛋白质，在一些物种中，受精后不久有一个合成蛋白质的高潮期，蛋白质的合成是通过预先储存在卵子中的核糖
6、体和tRNA完成的。正在发育中的卵子有一种特殊的机制来合成核糖体，在一些两栖类动物的卵子的减数分裂时期产生了1012个核糖体。3mRNA：受精后卵子的发育所需的mRNA都是母源性的，直到受精卵分裂121 3次，进入中囊胚转换点以后才转录自身的mRNA。经研究预测在海胆的卵子中储存了25 00050 000种不同的mRNA。4形态形成因子：这些指导细胞分化的分子，定位在卵子的不同区域，在卵裂过程中分离到不同的细胞中去。,5保护性化学物质：胚胎无法远离掠夺者或迁移到安全的地方去，因此它们需要各种因子的保护。很多卵子有紫外线滤波器和DN_A修复酶以防止它们受太阳的伤害；有些卵子含有一些让掠夺者不舒服
7、的物质；鸟类的卵子甚至含有抗体。在卵质中包含一个大细胞核。在海胆等物种中，受精时卵核已是单倍性的了，而在大多数蠕虫和哺乳动物中，卵核仍是二倍性的，直到受精后减数分裂才完成。6卵质外是质膜，它在受精时可调控特定的离子在卵子内外的流动，且能与精子质膜融合。质膜之外是卵黄膜，卵黄膜能识别同一物种的精子，对受精的物种特异性有非常重要的作用，在哺乳动物中，卵黄膜特称为透明带。哺乳动物的卵子外包围着滤泡细胞，对卵子具有营养作用，紧靠着透明带的一层滤泡细胞称为辐射冠(corona radiata)。哺乳动物的精孚要使卵子受精，首先必须穿过卵外细胞层。,7质膜下是皮层，是一层大约5um厚的胶状胞质，它比内部的
8、胞质硬，且含有高浓度的球状肌动蛋白分子。受精时，这些肌动蛋白分子聚合形成长的索状微丝。微丝是细胞分裂必需的，它们延伸到细胞表面形成微绒毛，帮助精子进入卵子。皮层内是皮质颗粒。皮质颗粒包含有消化酶、黏多糖、黏性糖蛋白和透明蛋白。这些酶与黏多糖在第一个精子入卵后被激活，以阻止多精入卵。黏性的糖蛋白和透明蛋白包围早期胚胎，为卵裂球提供支持。,第二节配子识别,在自然界中，无论是动物还是植物，为保持其物种的相对稳定性，在繁衍后代的受精过程中，精卵的识别都具种属特异性，即给定物种的卵子对同源精子的识别与结合具有绝对的特异性，异源精子在此将受到严格限制。,一、精子激活 精子行为与形态的改变，包括精子活化、精
9、子受卵子吸引都是由精子与卵子的相互作用产生的。事实上，在受精过程中，几乎所有生物的卵子都提供了一个或多个在受精中起重要作用的细胞层或非细胞层，如海胆的浆膜层、卵黄层，哺乳动物的透明带等等。因此，最早发生的受精事件都牵涉到精子与卵子的相互作用。精子在受精前是不活动的，通过射精，它们开始获得活力精子游动及呼吸。精子获得游动和呼吸的能力是一种化学促活(chemokinesis)现象，它是由精子所在的液体环境决定的。这种环境是精液和(或)卵子发出的化学信号组成的。通常，相对于释放到生殖道中的精子(约107个)，只有较少的精子(约100150个)在受精位置出现。由于精子常常是像卫星一样围绕着卵子游动，其
10、移动力的增加提高了精子与卵子相互作用而接近的几率，这无疑对受精是有益的。,趋化性(chemotaxis)是指精子根据化学浓度梯度直接向卵子运动的现象，与精子鞭毛的波状外形有关。多数情况下，是很难区分由趋化性引起的化学促活的。为了了解化学促活和趋化性的作用机制，科学家们对多种生命体进行了广泛的研究，精子应答化学促活与趋化性因子被认为是受受体调节的。精子应答现象包括环核苷酸(cyclic nucleotide)、胞内Na+、Ca2+的增加，pH值增高和H+、K+外向通透性的增加。,以下以海胆为例简单介绍化学促活现象和趋化性。海胆的精子是通过较高的C02张力保存在精巢中的，这种张力是由细胞内较低的p
11、H值产生的。动力蛋白(dynein)是一种ATP酶，它的主要作用是提供给鞭毛摆动的能量，这种蛋白质有一种特性就是pH值小于7.3时没有活性，当pH值大于7.3时，它才被激活。海胆排出精子，受外界化学因子及环境的影响，通过一系列离子浓度的改变使胞内pH值从70升至7.4，从而激活动力蛋白，最终使精子游动。研究发现，将海胆卵子浆膜层(egg j elly)加入精液中可以大幅度提高精子活性.浆膜层中的活性物质是富含氨基乙酸的多肽分子，其分子质量约为2000 Da。呼吸活化肽(resact)和精子活化肽(speract)是由卵子浆膜层分离出的可以激活精子的多肽。它们在很低的浓度下可以有效地增加Na+一
12、H+交换和细胞内环核苷酸的水平。,下图是由精子活化肽产生的精子运动模式图。精子活化肽激活cGMP的合成，打开了K+通道，细胞膜产生超极化(Vm)防止Ca2+进入细胞或是加速Na+一Ca2+交换，从而降低胞内Ca2+浓度。同时Vm也激活了Na+一H+交换，提高了pH值，从而抑制甚至终止cGMP的合成，这是一种负反馈调控。另外，pH升高引起的cAMP合成激活了Ca2+通道，以提高胞内Ca2+浓度。因此，当精子沿着趋化浓度游动时，K+通道保持活性，抑制Ca2+通道活性；如果精子离开了这条途径，K+通道活性下降，细胞膜去极化，Ca2+浓度上升，最终导致鞭毛不对称性增加而使精子修正方向循着更正确的途径游
13、动。,二、获 能 哺乳动物的精子需要在雌性生殖道中停留一个特定的时期，以获得对卵子受精的能力，这一过程被称为获能(capacitation)。精子的获能是指射出的精子在若干生殖道获能因子作用下，精子膜发生的一系列变化，进而产生生化和运动方式的改变。精子在获能期间，细胞膜发生了一系列变化，包括内膜分子重排、精子表面某些组分移除。尽管世界上有许多的实验室做了多年的研究，但精子获能的分子生物学机制还不很清楚。一个原因是由于配子相互作用和受精的时间很短(特别是卵生动物)，因此精子获能也是非常短暂的；另一个原因是几乎没有有效的方法在脊椎动物中观察到获能的过程。,在哺乳动物中，获能的位置随着物种的不同存在
14、着很大差异.精液储存于子宫中的物种，获能主要发生在输卵管(如许多啮齿类动物、猪和狗等)；精子储存在阴道中的物种(如人和兔)，其获能常常从阴道开始，直到更高的区域。杂交受精实验已经证明一个物种的雌性生殖道可以使另一个物种的精子获能。人们发现通过人工进行腹膜内授精或把配子直接注入输卵管都可以使精子获能，这说明精子获能不一定必须要通过雌性生殖道，而只要在适当的介质条件下即可获能。因此影响获能的因素具有一定程度的适应性。一般来说，精子获能期间，细胞内离子、新陈代谢、腺苷酸环化酶和细胞核、细胞膜、顶体等均会发生改变。,在获能过程中，Ca2+与腺苷酸环化酶的激活有关。腺苷酸环化酶的活化可以使精子获能。当豚
15、鼠精子在含Ca2+的培养基中培养，cAMP提高了30倍，而不加Ca2十的对照实验中仅提高3倍。哺乳动物精子发生顶体反应需要Ca2+的运输及依赖于Ca2+的腺苷酸环化酶增加。通过多种研究，现一般认为获能的一个重要作用是对精子表面物质的修改及移除。精子获能后，顶体上凝集素(1ectin)结合区域发生改变，不能特异识别来自未获能精子表面抗原的抗体。这种抗体和结合位点的改变可能与表面组分的修饰或剔除有关。,三、顶体反应 顶体是一个位于精头顶部的大型分泌囊泡，靠近精膜的顶体膜称为外膜，与精核相邻的称为内膜。如图所示。顶体反应(acrosomal reaction)是在受精前精子顶体发生的一系列变化。大量
16、的研究证明在具有顶体结构的无脊椎动物或脊椎动物中，只有发生顶体反应的精子才能进入卵子并与卵子融合，也只有在精子与卵子接触时才发生顶体反应.(一)顶体反应的过程,1无脊椎动物的顶体反应,在大多数海生无脊椎动物中，顶体反应包括2个事件：顶体膜与精子质膜发生融合及顶体突起(acrosomal process)的形成。如图所示。,在海胆中，精子与卵子胶膜接触后，可引起顶体反应。(1)在顶体顶部顶体膜与精子质膜在多处发生融合，随后融合区域逐渐扩大，最后顶体顶部的顶体膜与精子膜完全融合。在融合过程中，顶体泡中的顶体颗粒以胞吐作用的形式释放出来，其中含有多种蛋白水解酶，它们可以溶解卵子表面胶膜，使精子能到达
17、卵子质膜表面。(2)顶体突起的形成是海胆顶体反应中的另一个重要变化。在海胆精子的核窝(nuclearfossa)中，存在一些无定形物质，它们为没有聚合的肌动蛋白。顶体反应开始后，核窝中没有聚合的肌动蛋白分子，经聚合作用形成纤维状的肌动蛋白，并组装成一束微丝，其后端固着于核膜外表面，而前端向前伸长，结果在核的前端形成一个指状的顶体突。由顶体泡中释放出来的颗粒物质就主要附着于顶体突的外表面。,2.哺乳动物的顶体反应 哺乳动物精子的顶体是一个由膜包围的帽、状结构，覆盖于精核的前端。顶体反应时，顶体帽部分的质膜与顶体外膜在多处发生融合，使顶体内的物质从融合处释放出来。在正常情况下，精子赤道段和顶体后区
18、的质膜不会发生融合，但在顶体反应后，该区段的质膜往往会发生生理变化，以便随后与卵子质膜发生融合,(三)精子顶体酶及其穿透作用精子要到达卵子的表面，它必须克服数层障碍才能完成使命。首先，它必须穿过围绕在卵子最外层起保护作用的浆膜层，接着经过第二个保护层卵黄层，最后它必须突破自己的细胞膜。精子的穿透作用是与顶体反应密切相关的。通过顶体反应释放的物质中含有大量的水解酶，因此顶体这一结构被认为具有类似溶酶体(1ysosome)的功能。精子顶体酶的一个功能是在卵子外围打一个洞，包括浆膜层、卵黄层或透明带。另外它还与精卵结合有关.顶体酶溶解卵子外层包括酶作用方式和非酶作用方式。许多软体动物精子中的顶体酶都
19、是以非酶方式发生作用的。Vacquier和Lee通过实验发现鲍鱼精子中存在一种蛋白质，它可以使卵子卵黄层中相互紧密缠绕的细丝失去内聚力，以致松散开。这一作用的结果是产生了一个直径3um的小孔，精子可以穿过它进入卵子。在哺乳动物顶体中有一种透明质酸酶，可以水解卵细胞外层，有利于精子的穿透作用。精子顶体蛋白也是一种存在于顶体中的酶原，它可以自催化而激活，与精子和卵子透明带结合有关。顶体蛋白的缺失会导致精子穿透透明带过程的延迟。,第三节卵子的激活,一 受体假说二 融合假说,第三节 精卵结合,以海胆为材料的研究都证明在卵子卵黄膜上存在着精子受体。用蛋白水解酶或皮层颗粒蛋白酶处理卵子，都可以明显降低受精
20、率，这主要是因为处理后卵子上的受体发生改变而导致精卵结合力的下降。这种受体对精子的识别具有高度的物种特异性。,一、海胆中精卵识别的特异性 海胆精子顶体中存在一种分子质量为30500 Da的蛋白质，被称为结合素(bindin)。之后在其他无脊椎动物中也发现了它的存在。这种蛋白质可以结合在去浆膜层的卵子表面。结合素具有物种特异性。生化研究发现，即使是最接近的海胆品种，其结合素都是不同的。这暗示在卵黄膜上存在着具有物种特异性的结合素受体。对它结构的分析(如图)发现，这个蛋白质延伸到细胞膜外部空间成为卵黄膜的一部分。外部区域的氨基酸序列具有物种特异性，而膜内区域则相对保守，这是与外部区域作为结合素结合
21、位置相符的。,二哺乳动物的配子结合,(一)透明带的结构和性质 正如卵黄膜在无脊椎动物卵子中一样，透明带（zona pellucida）在哺乳动物卵子中也扮演了一个重要的角色。不同动物卵子的透明带的厚度不一样，小鼠的约为5um，人的约为13um,均由多层组成。它的主要功能包括：顶体胞吐作用、精卵识别、卵子与精子顶体结合、精子激活和阻断多精入卵。透明带仅就结构而言十分简单：在小鼠中，透明带主要由ZPl(200 kDa)、ZP2(120 kDa)和ZP3(80 kDa)3种磺酰化的糖蛋白组成，其中以ZP3的含量最为丰富。对透明带结构的分析结果表明，这3种ZP蛋白在卵膜透明带中的排列不是随机的：由ZP
22、2和ZP3二聚体重复形成的丝状“串珠样结构，通过ZPl二聚体间的二硫键交互连接，组成可通透大分子的膜孔状透明带(图)。在3种蛋白质中，ZPl仅具结构功能，而ZP2和ZP3则同时参与配子间的相互作用。,对小鼠ZP3的生物化学研究表明：ZP3是由一个分子质量为44 kDa的多肽链(402个氨基酸)，3或4个天冬酰胺(N_连接)的寡糖，和几个数目未知的丝氨酸苏氨酸连接(O一连接)的寡糖组成；RNA酶保护实验及Northern杂交结果证实，ZP3基因在卵子发生过程中的表达方式不但表现为卵子特异性和性别特异性，而且还受到卵子发育进程的控制：即在小鼠休眠卵子中不表达，进入生长期后，ZP3开始迅速积累并最终
23、占到卵子全部mRNA的0.102：到卵子减数分裂成熟期I I，其含量则急剧下降(约004)，并且此后未发现有新的表达。这种由成长卵子合成并分泌而成的糖蛋白结构在受精中主要有2个作用：结合精子；在束缚精子后引发顶体反应除了在哺乳动物卵子发育过程中参与卵子外膜组装功能外，ZP3最重要的功能是作为精子特异受体.,(二)精子透明带吸附蛋白 透明带与精子相互识别的分子机制已经被广泛研究，现在认为哺乳动物精子上有一系列蛋白可以特异性识别ZP3蛋白的糖区域。人们发现在精子细胞识别膜上至少有3种吸附蛋白可以与ZP3结合，分别是半乳糖结合蛋白、半乳糖转移酶和透明带受体激酶。每一种蛋白质都有其特殊的功能，又相互重
24、叠，都在精卵结合与顶体反应中起重要作用。,（1）半乳糖结合蛋白(SP56)是一种分子质量为56 kDa的蛋白质，可以与ZP3蛋白的半乳糖基特异性结合。ZP3糖蛋白的一个半乳糖基如果发生丢失或改变，将使精子无法与卵子结合。(2)半乳糖转移酶研究发现半乳糖转移酶(GalTase)这种蛋白受体可以识别ZP3糖蛋白上的N-乙酰氨基葡萄糖，它镶嵌分布在顶体上方的精子细胞膜中，N-乙酰氨基葡萄糖的结合位置暴露在膜外。这种酶可以催化UDP一半乳糖转变为半乳糖，加到一端有N-乙酰氨基葡萄糖的糖链上。由于雌性生殖道中不存在UDP-半乳糖，因此这个酶促反应无法继续，只能保持与ZP3的结合状态。(3)透明带受体激酶
25、透明带受体激酶(ZRK)是一种分子质量为95 kDa的跨膜蛋白，它有2个功能域。在细胞外的区域可以与ZP3发生特异识别结合，细胞内区域具有酪氨酸蛋白激酶活性，当ZRK和ZP3结合时，这种激酶活性才被激活，这说明，ZRK是一种酪氨酸受体激酶。,第四节 配子融合与阻止多精入卵机制,一、配子融合精子通过与卵黄膜或透明带的相互作用，发生顶体反应，使和精子结合的卵黄膜或透明带被顶体反应释放的水解酶溶解，并在该位置进行精卵细胞膜的融合。雄雌配子的融合在大多数卵子中被限定在特定的区域内，特别是具有受精孔的卵子，如鱼类、昆虫等，在受精孔下的卵膜通常是精卵融合的部位。许多动物，如水螅类、管水母和两栖类，精卵融合
26、的位置发生在极体附近。受精后卵膜的融合能力大幅度下降，一般在8细胞期后失去融合能力。,通过电镜观察，海胆卵子表面有许多很小的绒毛状突起，称为微绒毛(microvilli)，在精卵融合时，肌动蛋白与多个微绒毛聚合形成受精锥。同时在精子顶体中，肌动蛋白单体也发生聚合并向前延伸，穿过受精锥，形成受精桥(fertilization bridge)。精子的细胞核与尾部就可以沿着受精桥进入卵子内部。与海胆精卵融合发生在精子顶体头部不同，哺乳动物的精子首先在平伏区段(equatorialsegment)与卵子发生融合.融合是活动的过程，需要许多融合蛋白的调节。,二、阻碍多精人卵的机制 许多精子都可以到达卵子
27、的表面并与之吸附，但是通常只有一个精子能完成受精，称为单精入卵(单精受精)(monospermy)。由于某些动物(如两栖类有尾目、爬行类及鸟类)的卵较大：通常会发生多个精子同时入卵的情况，但也只有一个精子的雄性原核能与雌性原核发生融合，从而恢复物种正常的染色体数目。多个精子入卵受精称为多精入卵(多精受精)(polyspermy)，将导致死亡或不正常的发育。例如在海胆中，(如图示)，2个精子受精将形成三倍体；更糟的是，由于精子的中心体负责形成有丝分裂纺锤体的两极，这样产生了不正常的四极纺锤体，从而使三倍体的染色体分配到四个细胞中，因为细胞分配染色体是随机的，因此造成了染色体紊乱，有的细胞得到了额
28、外的染色体，有的则没有。,1快速阻碍多精人卵卵子的细胞膜既可以与精子融合帮助精子入卵，又可以防止精子的融合确保单精入卵。卵膜的这种快速阻碍多精入卵作用是通过改变自身膜电位形成的。海胆的卵子存活于海水中，其胞内离子浓度与外界环境存在很大的差异。海水中的Na+浓度很高，远远超过卵子内部，而K+浓度则明显低于卵子，这主要是因为卵膜中存在离子通道，它可以阻止Na+流入、K+流出卵细胞。正由于胞内外存在的离子差异，使细胞膜上保持着稳定的膜电位，用电极测量发现膜电位(相对于膜外)为一70 mV。在第一个精子结合到海胆卵子后13 s，伴随着少量Na2+内流，膜电位开始向正值漂移，有时可以达到+20 mV左右
29、(图示)。精卵结合使顶体中的某种蛋白质激活，从而打开Na2+通道，Na+的内流导致了膜内电位的上升。Jaffe等人发现在人工保持膜电位为负值的情况下可导致多精入卵，相反，始终保持正值则不能发生受精。此外在低钙的环境中受精，也导致多精入卵。目前推测，在精子中存在一种对电位敏感的融合蛋白，这种蛋白质的插入受到膜电位的调控正值会使其失去活性。,2皮层颗粒反应在快速阻碍机制中，通常膜电位保持正值的时间约为1 min，如此短暂的电位漂移是不足以实现阻碍多精入卵的。Carroll和Epel发现结合到卵黄膜的精子如果在某种情况下没有被移除，将导致多精入卵。这种移除作用是通过皮层的小泡破裂皮层颗粒反应进行的。
30、(1)皮层(cortex)是由约1 5 000个直径为1 um的皮层颗粒(cortical granule)组成，皮层颗粒通常分布在没有微绒毛结构的卵膜下方，如图。,(2)当精子进入卵子时，皮层颗粒与卵膜发生融合，颗粒内物质被释放到卵膜和卵黄膜之间的区域卵黄周隙(perivitelline space)。这些释放物中有几种蛋白质在皮层颗粒反应中发挥了重要的作用。首先是蛋白酶，它们可以溶解卵黄膜蛋白与卵膜相连位置的卵黄，并对结合素受体及与之结合的精子进行剪除；第二种是黏多糖(mucopolysaccharide)，它可以产生渗透性梯度使水进入卵黄周隙，从而使卵黄层向外隆起，形成受精膜(ferti
31、lization envelope)。这时皮层颗粒分泌的过氧化物酶发生作用，通过交联相邻蛋白质的酪氨酸残基使受精膜变硬。受精膜最先在精子入卵的位置形成，并向外扩张至整个卵细胞，从而排出精子，阻碍多精入卵。此外皮层颗粒除一部分参与生成受精膜外，其中的透明素蛋白(hyalin)在受精膜内部生成透明层(hyaline layer)，它与卵裂中对分裂球的支持作用有关。在哺乳动物中，虽然没有形成受精膜，但基本情况与海胆相似。科学家们认为，皮层颗粒与卵膜融合释放出多种酶类，可以改变透明带上的精子结合受体ZP2、ZP3，即切除ZP2、ZP3蛋白的末端糖基，从而把与其结合的精子从透明带上释放出来，并防止精子重
32、新结合，这一反应又称为带状反应 zona reaction)。例如在释放物中分离出的N_乙酰葡糖胺糖苷酶(M acetylglucosaminidase)，可以把N-乙酰葡糖胺(N-acetyl一glucosamine)从ZP3糖链上分离下来，使ZP3不能与精子表面的半乳糖转移酶结合，使精子再也不能结合到透明带上。,3钙的作用 皮层颗粒反应的作用机制与顶体反应基本相似，Ca2+作为细胞内信使发挥了极其重要的作用。通过受精，海胆卵细胞中的游离Ca2+浓度明显升高。大约从受精前的0.2umo1L上升到1 50umolL。伴随着游离Ca2+浓度的升高，皮质颗粒的质膜与卵膜从精子入卵的部位开始呈波动状
33、向周围逐渐融合，并以胞吐的形式排出其内含物，最终在卵子的整个皮层发生反应。(1)内质网与钙由于Ca2+在卵子激活和皮层颗粒反应中的重要作用，细胞内Ca2+的来源、卵质内钙波(calcium wave)是如何形成及传播的，这两个问题困扰了人们i0多年。随着不断的努力，神秘的面纱被一层层揭开。,细胞内钙主要储存在内质网中。通过对海胆、爪蟾及小鼠的观察，发现在经历皮层反应的卵子中，围绕在皮层颗粒周围的内质网明显增多，而且内质网在连接皮层颗粒的特殊位置还发生了形态变化，这与肌质网的变形十分相似(变形释放出的钙可以调节肌肉收缩)，因此认为这是Ca2+储存和释放的关键区域。这一过程一旦启动，C2+就以自发
34、的形式释放出来，从而造成钙流的形成和皮质颗粒胞吐作用。,(2)钙释放机制磷酸肌醇(IP3)脂类，特别是磷脂酰肌醇，已经被广泛证明为细胞内信号分子。磷脂酰肌醇被磷脂酶C水解为二酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，是调控一系列细胞过程的信号转导机制，例如分泌、代谢、光合作用及细胞增殖。通过注射IP3可以释放海胆卵子中储存的钙；在海胆卵子受精后10 s之内，胞内IP3的浓度明显升高；而且事先注射钙螯合剂可以阻碍IP3的调书作用。这些都有力的证明了IP3激活Ca2+的释放。对海胆的研究发现，在内质网上存在许多Ca2+通道，它们是IP3的受体。IP3在精子入卵的位置产生，并与较近的内质网Ca2+通道
35、结合，造成了Ca2+的释放。释放的Ca2+向外扩散，并催化皮质颗粒内质网的钙结合受体释放Ca2+。这一自催化过程的持续作用，不断分泌Ca2+，形成了一层由受精点向外扩张的Ca2+波。在高钙浓度下，皮层颗粒与卵膜融合，皮层反应发生。脊椎动物的情况基本相似。爪蟾的IP3受体已经被纯化出来，并鉴定出IP3结合域和Ca2十通道。豚鼠卵子中IP3诱导Ca2+释放包括两个阶段：在减数分裂胚泡时期和前中期之间，IP3敏感性逐渐增强；第二次减数分裂中期IP3活性急速上升，释放Ca2+引发皮层颗粒反应。,G蛋白偶联、酪氨酸激酶偶联受体IP3和DAG的产生是与GTP结合蛋白或酪氨酸激酶相关的。G蛋白偶联受体途径是
36、从细胞外配体与跨膜受体结合开始的，这个受体又在细胞质中与三聚G蛋白相连，因此配体与受体结合使G蛋白活化分裂成亚单位，这种亚单位可以激活磷脂酶C，磷脂酶C通过水解4，5一二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)生成IR和甘油二酯(DAG)。IP3可以打开Ca2+通道，提高胞内Ca2+浓度；DAG一方面可以引起H+外流，另一方面则激活蛋白激酶C(PKC)。PKC从胞液转移到卵膜上，激活Na+H+交换。因此，DAG和PKC发生作用提高了胞内pH值。同样，酪氨酸激酶偶联受体的激活也可以产生IP3，并引发胞内钙波及皮层颗粒反应。,第五节 卵子激活机制,在受精过程中，卵子被激活并开始发育同样重要。未受精的卵子是惰性的
37、，细胞的呼吸活动、RNA的转录和蛋白质的合成几乎都停止了。当精膜与卵膜融合后，通过信号转导激活了卵子的发育。以海胆为例，卵子的复苏可分2个阶段：“早期”反应和“晚期”反应。“早期反应指从精卵接触到发生皮层反应的数秒内所发生的事件；“晚期”反应指受精开始后数分钟发生的事件。,一、早期反应 当精卵接触后就激活两个主要的反应以阻止多精入卵：Na+流入细胞激活快速反应，引起膜发生变化；而其中较慢的反应由胞内Ca2+的释放所引起。卵子的复苏都依赖于胞内游离Ca2+浓度的增加。如果将海胆卵注入Ca2+螯合剂EGTA，就观察不到皮层颗粒的外排、受精过程中可能发生的一些变化、精子解凝、细胞分裂的重启动等一系列
38、现象。相反，将游离的Ca2+注入卵内，在无精子刺激的情况下，卵子同样能被激活，但大多数的发育因单倍性而终止在第一次有丝分裂前。Ca2+的释放激活了一系列代谢反应(图示)，其中之一是NAD+激酶的激活。在卵裂过程中，需要构建大量新的细胞膜，因此NAD+转化为NADP+是非常重要的。而NAD+激酶将NAD+转化为NADP+，这对脂代谢非常重要的，因为NADP+是脂生物合成的辅酶。NAD十激酶的激活的另一个效应是氧的消耗。在受精过程中可观察到氧的锐减，这种“呼吸爆发”常常偶联在受精膜上。负责氧消耗的酶同样是依赖NADPH的,二、晚期反应 Ca2+浓度升高不久，胞内pH值也上升。一般认为，高钙低钠这种
39、离子环境是与整个受精过程中发生的事件，包括蛋白质和DNA的合成，相一致的。胞内pH值的升高伴随着第二次Na+的流入。一种蛋白激酶C从胞浆中转移到膜上与二酰甘油联系并被激活，激活的蛋白激酶C通过把磷酸盐转变成反向运输的丝氨酸和苏氨酸残基来刺激卵膜上的Na+H+的反向运输。通过这种离子交换，将海水中的Na+摄取进胞内，而H+被排出胞外，从而使pH值从68上升到72，并导致卵子生理发生大量变化.离子浓度的变化激活了蛋白质和DNA的合成。在精子入卵后几分钟，蛋白质的合成就急剧上升，其合成过程不依赖于新的mRNA的合成。蛋白质的合成主要利用储存在胞内的母源mRNA，包括组蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和早期发
40、育所需的形态生成因子。,第六节 遗传物质的重组,一雌雄原核融合 在海胆中，精核垂直通过卵子的表面进入卵内。精膜与卵膜融合后，通过由精子注入到卵子的。一种激活因子建立一通道，精子内的细胞核、线粒体和中心粒通过这条通道进入卵内。线粒体与鞭毛在卵内降解，只有母本线粒体能存活，在发育或成熟的个体中仅能检测到极少一点精子来源的线粒体。在小鼠中，仅有11 0 000的线粒体来自父本。因此，线粒体基因一般认为是母性遗传。相反，随后分裂所需的中心体则来源于精子的中心粒。,1 雌性原核：单倍性的卵核称为雌性原核。2雄性原核：单倍性的发生了剧烈变化的精核称为雄性原核，在卵内，精核经历了剧烈的变化：如精核解凝、原核
41、形成及与雌性原核融合等一系列发育过程。所有这些进程都受到卵子的严格控制。3雄性原核的形成：精核解凝包括精核核膜解体，致密的精核染色质暴露在卵子胞质中。在海胆中，精核解凝是由2个与DNA紧密结合的、精子特异的组蛋白的磷酸化拉开序幕的。当精子与卵子浆膜层接触时，卵内依赖cAMP的蛋白激酶升高，这些激酶作用于精子特异组蛋白的几个碱性氨基酸残基，使其磷酸化。精核染色质与特异组蛋白去组装，然后与卵质内的组蛋白重新组合。经过解凝，DNA就开始复制和转录了。疏松的染色质在原核周围，利用卵质中的膜材料重新合成核膜，形成雄性原核。,4雌雄原核融合：在海胆精子进入卵子胞质后，雄性原核旋转180度，这样精子的中心粒
42、正好位于精核与卵核之间。精子的中心粒作为微管组织中心，延伸自身的微管，并与卵子的微管一起组装成星体。雄性原核在微管的引导下，向雌性原核方向迁移，使雌雄原核彼此靠拢。此时，DNA的复制开始，到两核相遇融合前完成。最后，雌雄原核融合，形成二倍性的合子核，受精结束。5哺乳动物雌雄原核融合与海胆的区别：在哺乳动物中，该过程与海胆略有差别：（1）哺乳动物的精子进入卵内与卵子表面无关，并非垂直通过，而是卵子的表面膨胀突出到受精锥面，长长的微绒毛从表面朝精子方向冒出。这些突起拉长并把精子头部抓住，精子被吞没；,（2）在海胆中，雌雄原核的迁移不需1 h就完成了，而在哺乳动物中，迁移过程大约要持续1 2 h之久
43、；（3）在哺乳动物中，精核也经历降解再重建的过程。但精核的DNA是与鱼精蛋白结合，这些蛋白质通过二硫键紧密地压缩。当精核进入卵内后，谷胱甘肽减弱这些二硫键的作用，从而使精子的染色质变得疏松；（4）在哺乳动物中，雌生原核在与雄性原核融合前必须完成第二次减数分裂。当雌性原核在完成第二次减数分裂时，雄性原核变大，其周围的中心体产生星光，向雌性原核迁移。雌雄原核相互靠拢，在其迁移过程中，DNA复制。雌雄原核相遇后，核膜解体，染色质凝缩成染色体，定位于纺锤体上。因此，在合子中观察不到真正的二倍体性的核，而是在2细胞期才可见。-,在自然界中，除了两性生殖方式外，还有单性生殖，包括雌核发育、孤雌生殖和杂种生
44、殖。雌核发育是鱼类单性生殖中的一种重要生殖方式。迄今在鱼类中已发现了许多进行雌核发育的种类。这些鱼类的共同特点是：雌鱼产出的卵子具有与母本完成相同的染色体组成；卵子需要近缘种雄鱼提供精子刺激而激活卵子的发育，后代一般不具备父本性状；除银鲫的某些种类外，后代均为雌性；染色体数目大多为多倍性的。雌核发育的鱼类依靠两种机制来维系其繁殖，即在卵子发生中抑制卵子倍性的降低和在受精过程中抑制雄性原核的形成，从而使子代的遗传特性与母本相同。,二、卵质的重排受精启动了卵子胞质物质的重排，这种重排对以后发育过程中细胞的分化至关重要。在一些种类中，由于胞质中含有色素颗粒，因此形态决定子的重排可以被观察到。如被囊动
45、物的未受精的卵子，外周为一层含有黄色脂包涵体的皮质层，包被着中心的灰白胞质。在减数分裂中，核破裂释放出一清亮种物质，集中在动物极。在受精5 min后，清亮层与黄色皮质层向植物极迁移。当雄性原核由植物极向细胞赤道迁移时，脂包涵体也随之迁移，形成一黄色新月状，从植物极延伸到赤道处。迁移也将黄色胞质携带到此处，以后此处生成肌肉细胞。胞质的移动与微管有关，这些微管是从精子中心粒和动物极胞质产生的。,在两栖类的卵子中也可见胞质的移动。在一些种类中，如林蛙，由于色素颗粒的存在，也可观察到由于胞质移动而形成的类似的“灰色新月”。而在另一些种类中，如爪蟾，观察不到“灰色新月”的形成，但研究人员通过对皮层下的胞
46、质和卵子的表面分别标记上不同的染料，来观察胞质的移动。两栖类卵子胞质的移动是由微管的形成所引起的，微管的排列方向与胞质的旋转方向平行。若将卵子在胞质旋转前用秋水仙碱或紫外线照射处理，微管的形成停止，胞质的旋转也不发生。精子中心粒启动了微管的聚合，其非中心位置提供了旋转的方向。下图是蛙卵受精后的细胞质重排,皮层胞质相对于内层胞质的移动引起了内部胞质的复杂运动。在第一个细胞周期的中间，可观察到大量中部细胞质从胚胎未来的腹部向未来的背部流动。,四、卵裂的准备,胞内Ca2+浓度的增加启动了细胞分裂所需的细胞器。卵裂启动的机制因物种的不同而不同，主要依赖于受精时减数分裂所处的时期。在已研究的所有种类中，
47、细胞周期都是由其重要调控者周期蛋白的合成与降解所调控的。这是一类分子质量大约为4560 kDa的蛋白质，在细胞内的含量随细胞周期呈现周期性变化：在每一轮间期开始合成，G2M时达到高峰，M期结束后突然被水解，下一轮间期又重新合成积累。卵裂与胞质的各个区域有特殊的关系。在具被膜的胚胎中，第一次卵裂将卵子分成两半。第一次卵裂的位置不是随机的，而是由精子的进入点和卵质的旋转方向所决定的。在第一次分裂前，胞质重排，雌雄原核融合，DNA复制，新的蛋白质合成，为以后多细胞生物的形成做准备。,作业：简述精子的和卵细胞的结构。什么是顶体反应？以无脊椎动物为例说明其过程。精子和卵细胞是如何识别的？论述阻止多精入卵的机制。叙述雌雄原核的融合过程及哺乳动物与海胆该过程的区别。,
