气相色谱法的应用.ppt

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1、 中药分析,气相色谱法的应用,1,第三、四章内容复习,差示分光光度法的原理是什么？薄层色谱中一般以Rf作为定性依据，Rf的定义是什么？薄层扫描法的扫描方式有哪些？薄层扫描定量法常用的定量方法有哪三种？,第五章教学内容和要求,概述：,气相色谱法（gas chromatograpy，GC）是以气体为流动相的色谱方法。气相色谱分离是基于样品在两相之间的分配，这两相中一相是表面积很大的固定相，另一相是通过固定相的一种气体。优点：高分离效能、高选择性、高灵敏度、分析速度快、应用范围较广。缺点:受样品的蒸气压限制和定性鉴定较为困难。,4,5,待分离组分 和,载气,A,B,C,D,第一节 气相色谱的基本原理

2、,可以利用气相色谱保留值进行定性分析，利用峰面积或峰高进行定量分析。,一塔板理论,塔板理论认为，一根柱子可以分成n段，在每段内组分在两相间很快达到分配平衡，每一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则（式中n为理论塔板数）,当理论塔板数（n）足够大时，色谱柱流出曲线趋近于正态分布，理论塔板数（n）可以根据色谱图上所得的保留时间tR和峰宽W或半高峰宽Wh/2计算：或 n或H是描述色谱柱效能的指标，一般而言，色谱柱的理论塔板数（n）越大，理论塔板高（H）越小，则表示色谱柱的柱效越高。,7,组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：但是，实际的色谱分离过程与塔板理论

3、的描述并不完全相符，范第姆特在此基础上发展和建立了速率理论。,8,二速率理论,速率理论提出了范第姆特方程式。它是在塔板理论的基础上引入影响板高的动力学因素而导出的。它表明了塔板高度（H）与载气线速（u）以及影响H的三项因素之间的关系，其简化式为 式中A、B、C为常数：A项称为涡流扩散项，B/u 项称为分子扩散项，C u 项称为传质项；u 为载气线速率，即一定时间内载气在色谱柱中的流动距离，单位为cm/s。由式中关系可见，当u 一定时，只有当A、B/u、C u 项较小时，H 才能有较小值，才能获得较高的柱效能；反之，色谱峰扩张柱效能较低。,9,将A、B、C的关系式带入简式（式5-5），得：由上式

4、可以看出:色谱柱填充的均匀程度、载体粒度的大小、载气种类和流速、柱温、固定相的液膜厚度等因素对柱效能及色谱峰扩张的影响，从而对于气相色谱分离条件的选择具有指导意义。,10,11,第二节 气相色谱实验技术,12,色谱柱,流量控制器,稳压器,空气,氢气,载气,进样口,检测器,电子部件,PC,一、气相色谱仪器,气相色谱结构流程,气相色谱仪主要部件,1、载气系统 包括气源、净化干燥管和载气流速控制；,常用的载气有：氢气、氮气、氦气净化干燥管：去除载气中的水、有机物等杂质（依次通过分子筛、活性炭等）载气流速控制：压力表、流量计、针形稳压阀，控制载气流速恒定。,2、进样装置 进样装置：进样器+气化室；气体

5、进样器（六通阀）：推拉式和旋转式两种。试样首先充满定量管，切入后，载气携带定量管中的试样气体进入分离柱；,填充柱进样口,毛细柱进样口,液体进样器：不同规格的专用注射器，填充柱色谱常用10L；毛细管色谱常用1L；新型仪器带有全自动液体进样器，清洗、润冲、取样、进样、换样等过程自动完成，一次可放置数十个试样。气化室：将液体试样瞬间气化的装置。无催化作用。,3、色谱柱（分离柱和柱温箱）色谱柱：色谱仪的核心部件。柱材质：不锈钢管或玻璃管，内径3-6毫米。长度可根据需要确定。柱填料：粒度为60-80或80-100目的色谱固定相。液-固色谱：固体吸附剂 液-液色谱：担体+固定液 柱制备对柱效有较大影响，填

6、料装填太紧，柱前压力大，流速慢或将 柱堵死，反之空隙体积大，柱效低。4.检测系统 色谱仪的眼睛，通常由检测元件、放大器、显示记录三部分组成,被色谱柱分离后的组分依次进入检测器，按其浓度或质量随时间的变化，转化成相应电信号，经放大后记录和显示，给出色谱图 检测器：广普型对所有物质均有响应 专属型对特定物质有高灵敏响应 常用的检测器：热导检测器、氢火焰离子化检测器5.温度控制系统 温度是色谱分离条件的重要选择参数 气化室、分离室、检测器三部分在色谱仪操作时均需控制温度 气化室：保证液体试样瞬间气化 检测器：保证被分离后的组分通过时不在此冷凝 分离室：准确控制分离需要的温度。当试样复杂时，分离室温度

7、需要按一定程序控制温度变化，各组分在最佳温度下分离,19,保留时间:用于确定样品组分，即进行样品定性分析。峰面积:用于测定样品的含量，即定量分析。,典型色谱图,二实验技术的要点,（一）色谱柱（填充柱）的选择和制备 在气相色谱分析中，样品中各组分的分离是在色谱柱内完成，为能够准确而快速地完成某一特定样品的分离分析任务，在很大程度上取决于色谱柱的选择。色谱柱是由柱体、担体和固定液三部分组成的。,20,1柱体的选择,常用为不锈钢柱，一般直型柱易于填充均匀，螺旋型柱易于得到较合适的长度。但要注意，螺旋管的螺旋直径至少必须是柱直径的10倍，这样才能把扩散和跑道效应降到最低。填充柱长度可以从0.120m，

8、普通分析柱长0.13m。按理论推测，柱越长，理论塔板数越高，分离效果越好。但由于载气流经柱子时速度是变化的，因此处于最佳流速下操作的柱子只有一小段，这就是说，若柱太长，分离效果将随柱长而递减。,21,2固体载体的选择,理想的载体具有下列性质：比表面积大；有适宜的孔隙结构；化学惰性且无吸附性；热稳定性和机械强度好；抗破碎强度高；颗粒形状规整，大小均匀；固定液对之有湿润性，涂布后易于填充。应用最广的载体很大部分是以硅藻土（红、白）为原料硅烷化法：由于载体表面存在硅醇基，具有形成氢键的能力，因而常用硅烷化试剂与其起反应以改进载体表面性能。常用的硅烷化试剂有二甲基二氯硅烷（DMCS）和六甲基二硅胺（H

9、NDS）。,22,3固定液的选择,固定液的选择一般是根据被分离物质的性质而定，需要在开始分析前了解被分离物质中可能含有的组分类型。对被分离物质的结构、沸程、性质了解得越多，就越容易选择合适的固定液。固定液选择主要根据“相似性原则”。对于一个有效的正常分离来说，固定液的化学结构与被分离组分的化学结构越相似，它们之间的作用力（色散力、诱导力、静电力和氢键结合力等）就越强，则被分离组分在固定液中的溶解度大，分配系数也大，因而在柱内的保留时间长；反之，组分就会被很快洗脱出柱。,23,4色谱柱的制备方法,综合法：白色担体：固定液的体积为担体重量的2倍 红色担体，所用固定液溶液的体积与担体重量相同填充好的

10、色谱柱应进行老化。老化的目的是除去填充物中残留的挥发性成分并促使固定液涂渍更加均匀、牢固地分布在担体表面。处理方法是将层析柱入口端连入气相色谱仪中，使载气缓缓通过层析柱，保持在高于正常操作温度2050，而又不超过固定液最高使用温度，加热几小时或过夜。注意为防止污染检测器，柱出口不要与检测器相接。,25,（二）检测器的选择,通用检测器有：1、热导池检测器，TCD(Thermal conductivity detector)测一般化合物和永久性气体2、氢火焰离子化检测器,FID(Hydrogen flame ionization detector)测一般有机化合物专用检测器有：3、电子俘获检测器，

11、ECD(Electron capture detector)测带强电负性原子的有机化合物4、火焰光度检测器，FPD(Flame photometric detector)测含硫、含磷的有机化合物特殊检测器有：FTIR、MS、测化合物结构,26,热导检测器,原理：不同物质具有不同的导热系数,氢火焰离子化检测器,原理：利用有机化合物在氢火焰中燃烧时能产生带电离子碎片，引起电极间导电度变化而进行测定。,（三）操作温度的确定,在实际使用时要考虑，固定液的最高和最低使用温度，最高操作温度应比所选择的固定液的沸点大约低150200，比其规定的最高使用温度低0100。一般说来，使用较低的柱温能改善分离。在通

12、常情况下，选择温度时要权衡各方面得失，既不能太高有损于分离，又不能太低使保留时间过长，可使温度约等于样品组分的平均沸点。柱温选择的基本原则是：在使最难分离的组分有尽可能好的分离度的前提下，采用较低柱温。,29,柱温与样品沸点之间的关系,（四）载气的选择和流量调节,载气在化学上必须是惰性的，目前氮气较为常用。实际工作中，载气的选择主要依据检测器灵敏度的需求。在使用载气及检测器所需辅助气体时，应注意载气的纯化。理论板高最小时，载气的流量为最佳流量。,31,三毛细管柱气相色谱,（一）毛细管柱的分类与制备 1毛细管柱的分类,2毛细管的表面处理 钝化（脱活，提高可湿性）的方法主要有以下几种：（1）硅烷化

13、（2）PEG-20M钝化（3）表面活性剂钝化3固定液的涂渍 现多采用固定化固定相毛细管柱，固定化包括交联（crosslinling，指在固定相分子间进行共价连接）和键合（bonding，指固定相与支持物表面的连接）。固定化固定相毛细管柱有下述优点：（1）可用溶剂洗涤；（2）减少了固定相的流失；（3）可减少超载峰的拖尾；（4）固定相不易剥落。,33,（二）进样系统,毛细管柱气相色谱的流路系统与填充柱气相色谱没有本质的不同，差别主要在于毛细管色谱的进样部分有用作载气分流室的控制流路和为FID提供柱后尾吹气的流路系统。进样系统：进样器和分流器 进样方式：分流进样和不分流进样 分流模式:含量较高组分分

14、析，该模式可以避免毛细管柱超负荷，保证其处于最佳流态状况。不分流模式:痕量组分分析,34,35,图5-3 毛细管柱气相色谱的流路图,（三）毛细管色谱的特点及应用,与一般填充柱比较，毛细管柱具有柱效高和柱渗透性好的特点。由于毛细管柱没有填充粒子，因此不存在多孔效应或涡流扩散所造成的谱带扩展,加之传质阻力C减少,柱长增加，故使柱效增加明显。毛细管柱具有很高的分离效率，突出地表现为所洗脱的峰形尖而窄。毛细管柱的R值要比填充柱高10倍，它可将保留时间在两个峰之间的各峰都分开，这一性能对于分析复杂混合物极为重要。,36,四程序升温和衍生物制备（一）程序升温技术的应用,柱温固定的色谱过程称为恒温色谱（IG

15、C）或等温色谱。对于一个样品中的各组分都有一个最佳柱温，对填充柱，大约为组分的平均沸点；对毛细管柱，大约比沸点低50为最佳柱温，如果样品组分较少，沸程范围不大，一般都采用恒温色谱，效果较好。但恒温技术在分析复杂混合物和宽沸程样品时，有很大的局限性。如果采用程序升温色谱法（PTGC），即柱温按预定的加热速度，随时间呈线性或非线性增加，则混合物中所有组分将在其最佳柱温（称为保留温度）下流出色谱 一般说来，如果样品的沸点范围（样品中组分的最低沸点与组分最高沸点之差）大于100，就需要用程序升温法。,37,2程序升温方式与保留温度,在程序升温色谱中柱温增加的方式，分为：（1）线性升温：柱温随时间成比例

16、增加。（2）非线性升温：线性-恒温加热：适于高沸点样品的分离。恒温-线性加热：适于低沸点组分较多的情况。恒温-线性-恒温加热：适于沸点范围很宽的样品。多种速度升温：适于沸点间隔较大，性质不同的样品。,38,程序升温色谱中，常用保留温度（组分浓度最大值流出色谱柱时的柱温）作为定性依据。,（二）衍生物的制备,采用制备衍生物的办法解决部分问题,化合物要具有26.661333.22Pa的蒸气压，且在操作温度下有良好的热稳定性才能进 行气相色谱分析,中药分析中，除了挥发油及低沸点、易挥发小分子物质外，有不少化合物本身难用气相色谱进行分析,1制备衍生物的目的,改进被测化合物的色谱性能，使原来不挥发的或挥发

17、差的化合物变成一种新的具有一定挥发性的化合物,第三节 气相色谱法的分析应用,一定性分析1.直接利用保留时间定性 一定的物质在一定的层析操作条件下，应有一定的保留时间。但不同的化合物可以有同样的或很相近的保留时间。在这种情况下，应用GC与质谱（MS）；GC与红外光谱（IR）的联用来进行确切的鉴别。2相对保留值（或相对保留时间）相对保留值是以被测定组分的校正保留时间与基准物质的校正保留时间的比值表示。只要柱温、固定相确定，即使柱长、柱径、填充情况及载气流速等有所变化，均不影响比值。,42,3保留指数（I）又称Kovats指数，即以两个相邻的正构烷烃为基准物质，测定它们的校正保留时间，使未知组分的校

18、正保留时间在两个保留时间之间，按下式计算未知组分的保留指数（Ix）：4保留值-碳原子数变化规律 在相同温度下，同系物的碳原子数与保留值对数呈线性关系：,43,二定量分析,44,（一）误差产生的原因,（二）峰面积测量 1峰面积的测量方法气相色谱定量分析的依据是组分的量（重量或在载气中的浓度）与检测的峰面积响应值成正比，即：W=fA 式中，W：组分的量；A：色谱峰峰面积；f：比例常数,面积积分的方法：（1）峰高乘半峰宽法：A=1.065h W h/2，此法对非对称峰或很窄的峰，测量误差大，不宜采用。（2）峰宽乘峰高法：，A=1/2Wh，对矮而宽的峰较准确。（3）峰高乘平均峰宽法：A=1/2h（W0

19、.15+W0.85），此法对非对称峰（前伸峰或拖尾峰）测量较准确。（4）峰高定量法：当峰形为对称峰时峰高可代替峰面积定量。,46,3定量方法,（1）外标法：配制一系列已知浓度的标准液，在同一条件，按同量注入色谱柱，测量其峰面积（或峰高），作出峰面积（或峰高）与浓度的标准曲线，然后同条件下，注入样品，测量其峰面积（或峰高），根据标准曲线，计算样品中该成分的浓度。方法简单，但要求准确的进样量，适用气样分析。（2）归一法：测量每一个峰的面积，单个峰面积除以峰的总面积，就得到组分的百分数：这是一种简便定量方法，但要求样品中所有组分都必须出峰。,47,（3）内标法：准确称取试样，加入一定量纯物质作为内标

20、物，然后进行GC分析，根据试样和内标物的重量比和相应的峰面积比，求出某组分含量。此法要求选择一个适宜的内标物，此内标物在样品中不存在，与样品各组分需完全分离；其峰与被测组分的峰靠近，而且内标物的量与被测组分的量接近。(4)追加法：样品及加入待测组分纯品的样品各做色谱图，测量峰面积，两次峰面积之差即为纯品峰面积，再按内标法同样计算。,48,第四节 气相色谱分析技术的新进展,一顶空气相色谱它是一种对液体或固体样品中所含挥发性成分进行气相色谱分析的间接测定方法。将被分析样品放在一个密闭容器中（通常为密封的小玻璃瓶），在恒定的温度下达到热力学平衡，以样品容器上部空间的蒸汽作为样品进行色谱分析。严格讲它

21、并不是指气相色谱分析本身，而仅是一种色谱分析样品的预处理方法。但随着气相色谱联用技术的发展，顶空分析迅速取代了经典方法，成为不容忽视的技术。,49,50,51,二裂解-毛细管气相色谱和闪蒸-毛细管气相色谱,1原理与操作步骤 闪蒸-气相色谱法（flash distillation gas chromatography）原来是用于分析高分子材料中挥发性成分及添加剂；裂解-气相色谱法（pyrolysis gas chromatography）已广泛用于高分子材料分析。采用闪蒸-毛细管气相色谱-质谱法和裂解-毛细管气相色谱-质谱法分析中草药，尤其是挥发性成分，取得了较好的成果。用闪蒸、裂解毛细管气相色

22、谱法则可直接选择分析，且有分析速度快、操作简便、样品用量少，不需任何化学试剂及化学处理、重现性好等优点。,52,具体方法是将中草药粉末样品作两次冲撞分析,在较低炉温下，停留较短时间，此时样品本身没有发生分解，样品中的易挥发组分则瞬间气化，被载气带入色谱柱分析，称为闪蒸,将闪蒸后的样品剩余物在较高炉温下停留一段时间，此时样品组分大部分分解，样品组分及其裂片混合物进入色谱柱分析，称为裂解,54,三气相色谱-质谱联用技术,气相色谱仪可以看作是质谱仪的进样系统，相反也可以把质谱仪看作是色谱仪的检测器，供试样品经GC分离为单一组分，按其不同的停留时间，与载气同时流出色谱柱，经接口除去载气，保留组分进入M

23、S仪离子源，由于此时载气和组分的量甚微，不致于严重破坏MS的真空度。各组分分子进入离子源后被离子化，对于有机物，在多数情况下，由于在离子化过程中接受了过多的能量，生成的分子离子会进一步裂解成各种碎片离子，经检测记录为MS图谱，用计算机自动检索核对，即可得出结果。,55,56,（二）质谱单元,1离子源:使样品分子成为离子状态（1）电子轰击源（EI）（2）化学电离源（CI）（3）其他类型的离子源 2质量分析器：把离子按质核比分开（1）四极杆质量分析器（2）磁式质量分析器,57,（三）接口技术,MS离子源的真空度一般在l0-3Pa，而GC出口压为105Pa，所以接口技术是联用系统的关键，其作用：一是

24、使色谱柱出口压力与MS离子源的压力相匹配；二是排除大量载气，使待测的组分经浓缩后适量地进入离子源。常见的接口技术：（1）直接偶合法（2）浓缩型接口（3）开口分流型接口,58,（四）色谱单元,用于联用系统的色谱仪除应满足高效分离的要求外，还必须兼顾质谱仪的某些要求。1色谱柱 熔融二氧化硅空心柱（FSOT），本身具有弹性，可拉直，易与质谱离子源连接，目前采用较多，如果样品不太复杂，对分离效果要求不太高时，可采用内径2mm的填充柱。若样品比较复杂，可供使用的样品量又很少，则应使用毛细管柱。目前广泛使用的是交联固定相和键合相填充柱使用寿命较长。,59,2载气 所用的载气应是化学惰性，对MS检测无干扰。

25、常用氦气，最好不用氮气。为了减少载气总量，常采用较低的载气流量和较高的柱温或程序升温。3样品量 正常的样品量应以不超载为限，但有时为了对小组分检测，也可过量进样。4接口温度 一般略低于柱温，且使接口整体任何部位均不应出现“冷区”。,60,（五）分析应用,1GC-MS联机分析的信号参数 2.分析方法（1）未知物的MS图解析（2）定量分析,61,3分析实例-肉桂挥发油的GC-MS分析,（1）实验条件：HP-5（5苯取代甲基硅酮）；毛细管柱（0.25mm30m）；载气：氦气；分流比40：1；流量1.0ml/min；柱温：起始120，保持5min后以5/min升温至150，保持7min；检测m/z范围

26、l0425；离子源温度300；倍增电压1500eV。（2）实验方法与结果：取肉桂中提取的精油0.2l，按上述条件进样，结果得总离子流图，从中分得41个成分，其中鉴定出39个,62,四气相色谱-红外光谱联用技术,GC-FTIR联用方法简便、快速，特别是在没有标准品而需要定性未知物时，可以谱库检索中得到特征官能团的有价值的信息，以色谱保留数据也能得到化合物的有关信息，在中药制剂，特别是含挥发性成分分析时有较广阔的前景。GC-FTIR系统由色谱单元、接口和傅里叶变换红外光谱仪三部分组成。,63,64,（二）GC-FTIR联用系统组成,GC-FTIR联用系统由以下几个单元组成：（1）气相色谱单元，对试

27、样进行气相色谱分离；（2）联机接口，GC馏分在此检测；（3）傅里叶变换红外光谱仪，同步跟踪扫描、检测GC各馏分；（4）计算机数据系统，控制联机运行及采集、处理数据。,65,联机检测基本过程为：试样经色谱分离后各馏分按保留时间顺序进入接口，与此同时经干涉仪调制的干涉光汇聚到接口，与各组分作用后干涉信号补汞镉碲（MCT）液氮低温光电检测器检测。计算机数据系统存储采集到的干涉图信息，经快速傅里叶变换得到组分的气态红外谱图，进而可通过谱库检索得到各组分的分子结构信息。,66,（三）接口技术,1流通池（光导管）接口 2冷阱接口,67,（四）色谱单元,1色谱柱 填充柱是GC-FTIR最先采用的柱型，虽分辨

28、率较差，但柱容量大，可在痕量分析时弥补红外检测灵敏度不高之不足，故常被采用。为了提高分辨率，目前还广泛采用粗内径、厚涂膜的弹性石英毛细管柱。2进样 为了克服红外检测灵敏度较低，大量溶剂可能带来干扰等因素的影响，进样时往往采用一些辅助技术，以保证混合物中每种组分进人色谱柱的绝对量在0.0l lg范围。,68,（1）双冷阱进样：冷阱的功能是低温捕获样品组分，使痕量组分得到浓缩，在进入色谱柱之前，常温挥去溶剂，以使进样量大大增加，满足光谱检测要求。（2）预柱进样：这种技术是通过预柱采集感兴趣的痕量组分，以满足光谱检测的要求。3载气 氦气无红外吸收，是GC-FTIR的理想气体，对填充柱来说，适宜的流速

29、为3050ml/min；毛细管柱，粗内径为25ml/min，细内径为0.52ml/min。4柱温 在联机系统中，色谱柱温度一般应略低于混合物中各组分沸点温度或采用程序升温。,69,（五）分析应用,1GC-FTIR数据采集与处理 2分析实例-救心油中薄荷脑、樟脑的测定,70,仪器为 5SXC 型 FTIR 光谱仪及 GC/FTIR 接口；GC-9A气相色谱仪，色谱柱为熔融石英毛细管双柱系统，I0柱50m0.32mm，0 柱30m0.25mm,FID 检测。定性分析时采用GC/FTIR脱机，用I0柱，固定相SE-30，柱前压1.6kg/cm2，载气He，流速2.28ml/min，尾吹气高纯氮，流速

30、0.2ml/min，FID 检测器温度250，进样方式为柱上冷进样。定量分析时 GC/FTIR 脱机，用0柱，固定相同上，柱前压1.2kg/cm2，载气He，流速2.0ml/min，无分流进样，进样后0.3min开始分流，分流比8：1，程序升温。将样品用乙醇稀释成10%稀释液，柱上进样0.2l，得色谱图，经重建色谱图。,71,将组分1，2，3，4进行标准谱库检索，得分别为樟脑、异龙脑、龙脑、薄荷脑。定量分析中的标准曲线制作是精密吸取樟脑对照品液（2.006mg/ml）0.52.5l，分别置5ml量瓶中，制成不同浓度的对照品液，各吸0.5l进样，得回归方程A1=-0.0216104+1.8116104C1，r=0.9998；取薄荷脑对照品液（3.610mg/ml），依法操作，得回归方程A2=-0.0554104+2.2106104C2，r=0.9980。取10%救心油进样0.2l，根据回归方程，测定救心油中薄荷脑与樟脑的含量。,72,本章小结,1.色谱法两大理论2.固定液的选择3.检测器的种类4.程序升温5.定性分析指标6.峰面积的测量及定量方法,中国药典中 关于气相色谱法 的规定,1.对仪器的一般要求,（1）载气源：除另有规定外，常用载气为氮气,第五章完 谢谢！,