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1、第七章 亲和层析,一般用于纯化蛋白质和核酸等大分子物质的方法的主要依据是各种大分子物质之间理化特性的差异性。缺点：由于这种差异性较小，因此要得到一种纯度稍高的物质，常常需要繁琐的操作，经历较长的时间，但最终收得率却甚低。,1967年Axen等 用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法，并成功地制备了固定化酶。这种利用大分子物质具有的特异的生物学性质进行纯化的方法，于20世纪70年代就有了惊人的发展，并逐步得到了广泛的应用。这使酶类等大分子物质的纯化过程变得较简单、迅速和高效(见表7-1)。,第一节 基本原理,M-L-S复合物 欲分离的大分子物质S 与相对应的专一物质L(配体)以次级键结合（亲和
2、力），能生成一种可解离的络合物L-S，其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M-L-S复合物。亲和吸附剂 配体L以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M上，制成亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体。,亲和层析法 根据L-S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层析方法，称为亲和层析法(affinity chromatography)。,亲和层析的原理(见图7-1)：,每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的底物(S)才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E-S)一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。,层析分离过程：样品
3、过柱时，样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上;无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰；然后，恰当地改变起始缓冲液的 pH值、或增加离子强度、或加入抑制剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第二个层析峰(见图7-2B)。,如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时，则采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。使用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。,上面介绍的亲和层析法亦称：特异性配体亲和层析法配体,一般为 复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等
4、)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力；另有一种亲和层析法叫：通用性配体亲和层析法配体,则一般为 简单的小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等)，它成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。,特点：亲和层析的分辨率比凝胶过滤层析高。用亲和层析法纯化样品时，操作步骤少，活力不易丧失。该法的缺点是：要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固相载体之后方可进行。,第二节 操 作,一、基质的选择 理想的基质应满足下面的要求：1极低的非特异吸附性；2高度的亲水性。亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物质接近。3较好的理化稳定性。当配体固化和各种因素(如pH、离子强度、
5、温度和变性剂等)变化时，基质很少甚至不受影响；,4大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合；5适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。具体要求须根据分离物的性质而定：当分离物与配体亲和力弱时，选用多孔性好的基质可提高结合容量；当分离物呈颗粒状或碎片状时，则选用多孔性差的基质对改善分离效果有利。一般亲和吸附剂采用的基质有：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻璃珠。,相比之下，实践中应用较多的基质是：聚丙烯酰胺凝胶(Bio-300)、多孔性玻璃珠、琼脂糖珠(Sepharose 4B)。三种基质中，目前应用最多的是：Sepharose 4B,Sepharose由D-
6、半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖；它基本上能符合理想基质的五点要求；同时Sepharose极易用溴化氰活化，并易于引入不同的基团；在温和的条件下，可以连接较多的配体，容易吸附大分子物质，且吸附容量也较大；此外，Sepharose 4B的结构比Sepharose 6B疏松，机械强度比Sepharose 2B好。因此，Sepharose 4B成了亲和层析中广泛使用的一种基质。,二、配体的选择可选择的配体有：抑制剂、效应物、酶的辅助因子、类似底物、抗体包括半抗原(碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)-蛋白质复合物抗体、其他物质(如外源凝集素、polyA、polyU、染料和金属离子)等。,优
7、良的配体须具备两个条件：1）与纯化的物质有较强亲和力 一般来说，配体对大分子物质的亲和力越高(即Ki（抑制常数）或Ka（解离常数）较小)，在亲和层析中应用的价值就越大。2）具有与基质共价结合的基团 该基团和基质结合后，对配体与互补蛋白的亲和力没有影响或影响不明显。就目前所知，可用作配体的种类很多，表7-2。,三、亲和吸附剂的制备把配体偶联到基质上的方法有两类：物理的（如包埋法和吸附法等）化学的（如偶联法和交联法等）交联法：是用双功能试剂(如戊二醛、碳化二亚胺等)交联基质和配体。偶联法：常用的化学试剂有：溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、双环氧乙烯、丁二烯砜和亚氨二乙酸等，用其活化的基质与配体偶联
8、，或者用其把基质与配体螯合起来,溴化氰偶联法 主要包括：1.活化2.偶联3.除去未结合的配体4.配体结合量的测定等步骤。,1活化基质在一定量的贮存基质Sepharose 4B(即用布氏漏斗抽干的胶)中，加入等量的蒸馏水和2molL Na2C03溶液(pHll12)，混匀。另将称量的固体CNBr(50300mgg贮存胶)溶于二甲基甲酰胺溶液中。随后迅速把此液加到搅拌的琼脂糖悬浮液内进行活化，其pH值始终维持在1112之间。接着把冷却的反应液转到布氏漏斗中，用1020倍凝胶体积的预冷水及0.07molL NaHC03溶液(pH8.5)洗涤。通过活化反应形成的化合物可能有两种：其一是具有反应能力的亚
9、氨碳酸盐衍生物；其二是无反应能力的氨基碳酸盐。,2偶联 配体和基质充分偶联而形成固相载体。经活化和洗涤过的基质与等体积的0.20.25molL碳酸盐缓冲液(含0.5molLNaCl和110pmol配体ml基质溶液)混合，缓慢搅拌(勿用磁力搅拌器)2h(室温)或过夜(4)，以便配体和基质充分偶联而形成固相载体。图7-4是植物血球凝集素(如ConA)-Sepharose4B亲和吸附剂的制备流程(供参考)。,3配体结合量的测定 配体结合量：一般是用每毫升或每克贮存胶束缚配体的量表示的。如用mgm1表示。测得的配体结合量，可作为决定亲和吸附剂实际用量的参数。具体测定方法有两种，即直接测定法和间接测定法
10、。,(1)直接测定法 2，4，6三硝基苯磺酸钠的颜色试验 根据配体的特性进行测定(2)间接测定法 推算法 一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤出来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有：一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm10cm)内，加入过量的欲分离大分子物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物质，然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子物质的量，计算出配体的结合量。二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止，根据上样量即可推算出配体的结合量。,
11、四、特异性吸附大分子物质在亲和层析柱中的吸附过程 如图7-5所示 当样品开始加到已知具有一定配体浓度的亲和层析柱(A)时，欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零；当样品开始进入柱中时，配体和欲分离的大分子物质间相互接触，并形成复合物，但也 有部分复合物分解；当样品不断地通过柱子时，欲分离的大分子物质与配体之间形成的复合物浓度越来越大。也就是说，随着样品不断地通过柱子，欲分离的大分子物质的浓度会恒定地增加(B)。由于配体的存在使欲分离大分子物质的移动受到阻碍，从而导致产生紧密的复合物带(C)。,样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，与它们之间的亲和力有密切关系，还与样品的pH值和离子强度有关系。,
12、五、分离大分子物质（洗脱）除去杂质 样品过柱后，可用大量的平衡液即起始缓冲液洗去无亲和力的杂蛋白，有时也可用不同的缓冲液洗涤去除之；最后留在柱上的只有专一吸附的大分子物质。洗脱有效成分 将柱上专一吸附的大分子物质洗脱下来。洗脱液要能使复合物完全分离，其具体作法可根据亲和力决定：,亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗脱，得到迟缓的大分子物质峰。亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质(如改变pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)，使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白质变性剂洗脱。A竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出
13、和配体特异结合的大分子物质。B剧烈的洗脱条件(蛋白质变性剂)如用盐酸胍、尿素等变性试剂配制的溶液洗脱下的蛋白质等生命大分子物质；需要经过适当的处理方可恢复活性。,六、亲和层析柱的再生当洗脱结束后，应连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗涤柱子，接着再用平衡缓冲液使层析柱重新平衡。经过这样处理的柱子可再次上样，进行第二次亲和层析。一般亲和层析柱都可以反复使用多次。,第三节 提高吸附剂的操作容量,亲和吸附剂的操作容量的影响因素：配体性质 配体在吸附剂中的含量 配体与吸附物结合时的位阻效应大小、基质的多孔性 操作条件 等因素,一、在配体和基质之间引入“手臂”,1原理在配体和基质之间，特别是在小分子
14、的配体和基质之间，引入适当长度的“手臂”(arm)，使配体离开基质的骨架，或许可以 减少基质的立体位阻效应，增加配体的活动度,伸入溶液的深度,从而提高吸附剂的操作容量。,例如,用对氨基苯-D-硫代吡喃半乳糖苷作为配体纯化-半乳糖苷酶时，如果把配体直接连于Sepharose 4B上所产生的衍生物A，则不能吸附-半乳糖苷酶。当Sepharose上引入氨乙基乙酰胺或引入 3，3-二氨基二丙胺琥珀酰胺再接配体时，所产生的衍生物B和C(图7-8 B、C)都能吸附-半乳糖苷酶。从衍生物A、B、C来看，随着手臂的增长，吸附能力也增加了。但是，并非越长越好，若过长，则有可能发生“手臂”折叠弯曲，从而导致吸附容
15、量降低。,图78 纯化-半乳糖苷酶的吸附剂,2吸附剂衍生物的制备 构成“手臂”最多的方法：首先，把适当长度的氨基化合物共价结合到用溴化氰活化的琼脂糖上，制成十分稳定的衍生物(即AH-Sepharose和CH-Sepharose)（常用的氨基化合物是1，6-己二胺和6-氨基己酸。）在水溶性的碳化二亚胺存在下，这种衍生物极易与含羟基或氨基的任何化合物结合成固相载体。将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物反应(见图7-9)后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基团的化合物反应，即可生成一系列具有长短不等“手臂”的亲和吸附剂，,二、增加配体取代的程度对一些解离常数较大的配体而言，增加配体在基质上的浓
16、度也是增加吸附剂结合量的有效手段。增加配体数的方法是：在配体量一定时，随着基质活性基团的增加(通过活化时pH值的提高和溴化氰量的增加)偶联配体的量也相应增加(见表7-5)。,三、配体与基质以最少的键连接 在以蛋白质和多肽作为配体时，以最少的共价键连接到载体上，有利于保持蛋白质的高级结构状态，有利于保持其生物学功能（抗体）。,四、基质多孔性的影响生物胶最大的特点是它与配体偶联后多孔性降低，从而使应用受到了影响。基质琼脂糖的多孔性的稳定性比生物胶好。,五、其他提高亲和力的途径除上述四点外，样品的浓度、pH值、离子强度以及上样的速度等因子对其影响也不可轻视。若选择得当，则可提高固相载体对欲分离物的亲
17、和力。一般地，样品的浓度低些、流速慢点，或者让样品在柱中反应一段时间，使欲分离的大分子物质与配体之间有充分的碰撞机会，最终固相载体对欲分离物的吸附率可大于95。,第四节 应用实例,亲和层析的主要应用：纯化大分子物质 研究酶的结构与功能等。,一、纯化大分子物质,1抗体、抗原及其结合物用于纯化抗体、抗原及其结合物的配体主要有：抗原(纯化抗体)抗体(纯化抗原)金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A，SPA)等物质。SPA能与免疫球蛋白G(IgG)结合，利用SPA-SepharoseCL-4B固相载体可以分离IgG、抗原和免疫复合物。,图7-10是用此吸附剂分离鼠血清中
18、免疫球蛋白的图谱。从图看出，SPA对IgG类物质有较大的束缚力，加之免疫球蛋白被束缚之后仍保留了IgG束缚抗原的特性。所以利用结合IgG的SPA-Sepharose CL-4B吸附剂还可分离特异性的抗原。此外，Bio-Rad报道，用DEAE-Affi-Gel Blue Gel可以纯化血清中的IgG。因为此吸附剂中的蓝色染料能与血清中的白蛋白、蛋白水解酶和有关互补蛋白质结合，而DEAE离子基团能与血清中的酸性蛋白质结合，所以在洗脱时，IgG首先被分离出来。,二、研究酶的结构与功能,在进行酶的结构与功能研究时，经常使用专一的化学试剂改变酶的功能团。这种操作往往会引起酶活力的不完全丧失，但是难以确定
19、具有的酶活力是代表残留的天然酶活力?还是化学试剂作用后酶的催化能力变小了?这就须将具有生物活性的和失去活性的蛋白质分开后，进行活力检测才能确定。它们之间的分离是比较困难的。然而，亲和层析法是可以解决这一问题的。原理：失去活性的蛋白质与配体无亲和力，有活性的则与配体有亲和力。以此分离。,例如实验现象：葡萄球菌核酸酶经亲和标记物标记后，发现：该标记物与酶活性中心的酪氨酸结合，可导致酶活力丧失83，剩余酶活力17。问题：该实验的现象，究竟是核酸酶的活性中心被结合后仍有17的酶活力?还是因为有少量的核酸未标记上而残存酶活力?研究思路：将标记和未标记的酶分离出来，进行活性检测。,如何分离？这是用一般分离
20、方法无法解决的。用高专一性的亲和层析法则是容易解决的。因为失去活性中心的核酸酶与亲和吸附剂是无亲和力的，可直接通过柱子流出。而天然酶却与亲和吸附剂有亲和力(即两者可形成一种复合物)，须用特殊洗脱剂才能洗出。,三、实例,1甲基化白蛋白-硅藻土层析分离核酸 基理：吸附剂牛血清白蛋白分子上的羧基与甲醇反应后，可生成甲基化白蛋白(methyl albu-min)，甲基化白蛋白和硅藻土作用可制成甲基化白蛋白硅藻土(methyl albumin kieselguhr，MAK)吸附剂。白蛋白+甲醇 甲基化白蛋白 甲基化白蛋白+硅藻土 甲基化白蛋白硅藻土,亲和吸附 此吸附剂置中性溶液时，可与核酸分子的磷酸基团
21、吸附；其吸附力与核酸的分子大小、碱基组成、变性程度以及单、双链结构等因子有关。一般来说，核酸分子小、GC含量大、呈双链(天然的)者，吸附力小。因此，这类核酸在MAK层析柱中，用较低浓度的盐溶液即可洗脱出来。,例如 大肠杆菌制备的含tRNA、DNA和rRNA的样品液在MAK层析柱中，是用0.41molL NaCl的梯度缓冲液洗脱分开的。同理，将单、双链DNA或天然的变性DNA样品液上MAK层析柱，用相应的梯度缓冲液洗脱也可以分开。除此之外，用MAK层析柱还可分离双链DNA和杂交链DNA、环状DNA(质粒DNA)和其他DNA等核酸物质。MAK是一种吸附阴离子基团的固相载体，优点是吸附核酸的性能强，分离效果好；缺点是操作容量较小，专一性较差。,
