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1、第二章细菌感染的实验诊断,感染的诊断有赖于从标本中检出病原体或检出病原体的可溶性抗原,或病原体的DNA病人血清中检出病原体的抗体 本章主要讨论检出病原体的问题,第一节,实验诊断的目的与要求,进行病原学诊断进行药敏试验,指导合理用药用作流行病学调查,追踪传染源研究病原生物与感染的关系,一.目的,鲍氏痢疾志贺菌13型暴发,时间：1992年9月发病：26名死亡：10名地点：某婴儿室传染源：慢性携带者产妇传播方式：通过污染操作台接触,鼠伤寒暴发,时间：1991年11月地点：某婴儿室发病：55名 死亡：23名 56件物品（被褥，尿布，奶瓶）中26件检出鼠伤寒沙门菌,二.诊断试验的选择,有价值的快速简便的
2、特异性和敏感性高的,可用的方法:,查病原体:直接涂片 分离,对纯培养物进行鉴定查可溶性抗原:用已知抗体查DNA:分子生物学方法查抗体:用已知抗原 IgM IgG:效价有4倍以上增高,三.细菌鉴定流程,双歧检索:以某一试验分表解:用多种试验整体分析数字编码:将多种试验分别编码,数字化后查表,革兰氏阴性杆菌葡萄糖发酵,+-,氧化酶,+-,弧菌,肠杆菌,非发酵菌,A B C D E,甲 乙 丙 丁,+-+,+-,-+-,-+-+,组别 试验 代码 结果 结果代码 总值,1 A 4-0 1 B 2-0 C 1+1,2 D 4+4 5 E 2-0 F 1+1,15,微量生化反应系统和自动化,各试验孔含不
3、同试验的脱水底物 加入纯化的被检菌 孵育4-24h观察结果 人工读取根据编码资料判定菌种或 电脑读取,第二节,临床标本的采集与处理,一.标本采集的原则,早期,用抗菌药物前根据病原体存在的部位采集相应标本无菌技术,避免正常菌群污染,防止病原体播散采用合适的方法,二.标本的处理,尽快接种到合适的培养基上根据抵抗力选择保存和运输条件 厌氧菌 奈瑟菌 病毒,第三节,细菌的形态学检查,一.不染色标本,用悬滴法或压片细菌是活的,可观察运动加入特异抗体可抑制其运动结合标本来源可作初步诊断,如霍乱,梅毒用相差或暗视野显微镜效果更好,压片,悬滴法,二.染色标本,革兰染色(Gram stain):紫色革兰阳性;红
4、色革兰阴性.注意细菌的大小,形状,排列以及着色的均一性抗酸染色(acid-fast stain):红色抗酸阳性,蓝色抗酸阴性荧光染色:更易观察,特殊染色可用于观察荚膜,鞭毛等细菌的特殊结构,第四节,细菌的分离培养,一.细菌生长的要求,培养基:营养物质,pH7.4 气体:需氧菌,厌氧菌,兼性厌氧 菌,微需氧菌 温度:一般37C 时间:一般1824h,二.培养基,1.对培养基的基本要求足够的营养物质合适的pH无菌澄清,2.培养基的种类,按培养基成分分:基础培养基:满足一般细菌要求 营养培养基:满足苛求细菌要求 鉴别培养基:加有被利用物和指示剂 选择培养基:加有抑制剂,能抑制非目的菌生长 特殊培养基
5、:满足特殊细菌要求,按培养基物理性状分:液体:增菌 固体:加2%琼脂,平板用于分离纯种,斜面用于传代或保存细菌 半固体:加0.5%琼脂,用于观察动力,保存菌种,三.主要的接种方法,分区划线法:用于分离纯种,多次烧灼减少菌数,以获取单个菌落连续划线:不要求单个菌落,用于保存或繁殖细菌涂布:使细菌长成菌苔,可观察细菌被抑制情况或用于繁殖细菌倾注平板:少量细菌混于琼脂中倒板,计数,分离纯种,四.细菌生长的表现,固体基:菌落形成,注意其 大小,形状 表面,边缘 质地,透明度 溶血情况液体基:浑浊,菌膜,沉淀,五.纯种的获得,纯种是细菌学工作的基础获得方法:划线分离法(倾注平板法)获得大的单个菌落 斜面
6、 纯培养物纯培养物的外观表现应是一致的,六.培养细菌的目的,确定有无细菌鉴定细菌药敏试验计数细菌利用细菌:制备菌苗,生产抗生素或基因工程产品,第五节,细菌代谢产物的检测,一.细菌毒素的检测,内毒素:致热作用:兔体温 鲎试验外毒素:体内:毒素与抗毒素的中和试验 体外:Elek平板法:沉淀反应 ELISA,毒素和抗毒素的中和试验 外毒素?外毒素?+已知抗体 小白鼠 小白鼠结果 发病 发病 有毒性,但不是相 应的 发病 不发病 是相应毒素 不发病 不发病 无毒性,抗毒素,待测细菌,沉淀线,Elek 试验,二.生化反应,欲检测细菌的生化反应,一般是在合适的培养基中加入被测物和检测其代谢产物的试剂,即在
7、鉴别培养基中进行培养,或直接加试剂于培养物中,观察呈色等现象判定结果,(一)碳水化合物的代谢试验,糖(醇)发酵试验:酸,气体氧化-发酵(O/F)试验:-半乳糖苷酶(ONPG)试验七叶苷水解试验甲基红试验V-P试验,(二)蛋白质和氨基酸的代谢试验,明胶液化试验Indol试验Ura试验H2S试验苯丙氨酸脱氨酶试验氨基酸脱羧酶试验,(三)碳源氮源利用,枸橼酸盐利用试验丙二酸盐利用试验,枸橼酸盐利用试验,(四)酶,氧化酶试验过氧化氢酶试验硝酸盐还原试验卵磷脂酶试验凝固酶试验CAMP试验胆汁溶菌试验,(五)抑菌试验,O/129试验杆菌肽试验Optochin试验,第六节,感染的血清学检测已知抗体检测细菌的
8、抗原用于鉴定细菌已知抗原检测病人血清中的抗体 用于诊断感染性疾病,一.血清学鉴定,了解微生物的抗原结构 用已知抗体检测细菌的抗原组合 特异性较高 多在鉴定的最后进行 可用多种血清学方法,细菌多用凝集反应,病毒多用中和试验,二.血清学诊断,查抗体:用已知抗原 IgM:感染的指标 IgG:效价有4倍以上增高或 高于当地人群水平多用于病程较长的全身性感染,第七节,感染的分子生物学检测检出病原体DNA证明病原体存在,一.核酸检测的用途,细菌分类临床诊断,快速鉴定耐药性检测毒素检测流行病学调查,二.核酸检测的方法,G+C mol%PCR 限制性内切酶片段长度 核酸杂交,限制性内切酶酶切分析,限制性内切酶
9、是能够在一定部位切开DNA的酶同样的内切酶可将相同的DNA切成同样数目的，同样大小分子量的片段电泳后对所得图谱进行分析可判断DNA是否相同,1989年国外某医院泌尿科3周内从病人血，尿中分出8株不动杆菌，具有相同的耐药性，经 Smal I 酶切后出现相同片段，但与环境中或其他科室分出的不动杆菌不同，表明泌尿科的病人是由同一克隆引起的爆发,某医院ICU病房，从水池和病人标本中分出多株铜绿假单胞菌，将其染色体DNA用X Bal 酶切，发现彼此之间没有共同的酶切片段图谱，病人之间图谱的也不相同，说明这不是一次爆发,第八节,动物实验,一.动物实验的用途,分离细菌,获取纯种 检测其致病性,观察发病或死亡
10、,可同时加抗体进行中和试验或保护试验 制备抗体 诱导变异 建立感染模型 检测生物制品的安全性,二.实验动物的选择,多用易感的小动物,如小白鼠,豚鼠按需要选择 纯系,突变系,杂种 无菌动物(GF),悉生动物(GB),无特殊病原体动物(SPF),最低限度疾病动物(MDA),普通动物可选用多种途径注射,如腹腔,静脉,皮下,颅内等,可供细菌鉴定的方法,形态:个体,菌落,液体基生长情况生长需要:氧,温度,营养物生化反应:观察其酶活性抗原性:用已知抗体致病性:动物实验核酸:PCR,酶切片段长度,杂交,界_门_纲_目_科_属_种种是具有相同生物学特性的生物聚合群型：生化型，血清型，噬菌体型株：不同来源双命名：金黄色葡萄球菌 staphylococcus aureous staphylococcus sp(spp),疾病病原体的确立,分离培养出病原体患者血清病原体抗体有四倍以上增高能复制出动物模型,
