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1、蔬菜抗寒生理,（高级蔬菜栽培生理、硕士生课程）沈阳农业大学 何莉莉,抗寒性（抗寒能力）,植物对低温寒冷环境的长期适应中，通过本身的遗传变异和自然选择获得的一种抗寒能力。从栽培的角度来讲是能够在低温下正常生长、结实，不仅仅是活着。,一、蔬菜的抗寒类型与低温危害类型,从植物的抗寒性来讲分为高度抗寒植物：抗寒的树木、果树等中度抗寒植物：有蔬菜中耐寒的多年生蔬菜和耐寒类蔬菜。低度抗寒植物：有半耐寒蔬菜。不耐寒植物：有不耐寒蔬菜。,1.蔬菜的抗寒类型,(1)耐寒的多年生蔬菜 如韭菜、金针菜、石刁柏、茭白、辣根等。它们的地上部分能耐高温，但到了冬季，地上部分枯死，而以地下的根系以宿根形式越冬，能耐零下10
2、15的低温，韭菜可耐零下30的低温。,(2)耐寒类蔬菜,如菠菜、大葱、大蒜以及白菜类中某些耐寒品种。能耐零下12的低温。短期内可耐零下510。同化作用适宜温度为1520，某些极抗寒菠菜品种可耐零下30低温。,(3)半耐寒蔬菜,如萝卜、胡萝卜、芹菜、白菜类、甘蓝类、莴苣、豌豆、蚕豆等。可抗霜但不耐长期的零下12低温。在长江以南均能露地越冬。同化作用在1720最佳，超过20，同化机能减弱，超过30时，同化作用所积累的物质几乎全为呼吸所消耗。,(4)不耐寒蔬菜,喜温性蔬菜如黄瓜、番茄、茄子、辣椒、菜豆等,最佳同化温度为2030。当温度超过40时，生长几乎停止。当温度在1015以下时,授粉不良,引起落
3、花。因此，在长江以南，可以春播或秋播，北方则以春播为主，使结果期安排在适宜的季节里。这类蔬菜不耐短期的零下12的低温,因此北方地区在定植时应安排在霜冻结束之后。,耐热性蔬菜,如冬瓜、南瓜、丝瓜、苦瓜、西瓜、甜瓜、豇豆、刀豆等，同化作用以30为最宜。其中西瓜、甜瓜及豇豆等在40的高温下仍能生长良好。耐热性蔬菜一般都不耐短时的轻霜冻。,2.低温危害类型,根据低温的程度，可分为两种类型：冷害 0以上低温所造成的伤害，并没达到组织内结冰程度冻害 0以下低温所造成的伤害，由于组织内出现冰晶而受害,(1)冷害,喜温性蔬菜和耐热性蔬菜易发生冷害。发生的季节主要是春季，育苗阶段和定植以后，不管是露地还是设施内
4、比较常见，冷害的临界温度 因蔬菜种类、品种不同，约在513之间。在冷害临界温度以下，环境温度越低，延续时间越长，蔬菜受害越重，若温度不很低，时间又较短，转入常温后可恢复正常的生理机能而不表现冷症状，如果温度虽不很低，但时间延长，或时间虽短而温度很低，植株将受到不可逆转的生理伤害。,根据低温对作物的危害特点，可分为：,延迟型冷害：多出现在营养生长阶段，如苗期使蔬菜生长发育推迟、延后，生长速度变慢，物候期出现的晚。障碍型冷害：多出现在生殖生长阶段，使生殖器官的生理机能受到破坏。如露地春番茄定植后遇到低温，会造成花粉发育不良、花粉管萌发不良，导致授粉受精不良，最后落花、落果。,混合型冷害,延迟型冷害
5、与障碍型冷害混合发生，危害严重。冷害的症状因蔬菜不同，冷害的结果会使幼苗衰弱，植株生长迟缓，萎焉、黄化、局部坏死、坐果率低、产量降低和品质下降等。最常见的是出现水浸状或凹陷斑点，长大的绿色果实不能成熟，组织坏死，机能衰退，易感染病害。冷害俗称倒春寒，素有哑吧灾之称。,(2)冻害,耐寒性蔬菜和半耐寒性蔬菜易发生冻害。初冬温度骤降型指初冬受强冷空气的影响，造成气温骤然下降，达到或超过植物所能承受的能力。如秋白菜采收期掌握不好的话，很容易遭霜冻，对其影响很大，一般不要超过霜降。,冬季长寒型,冬季持续低温，对露地越冬菜影响大(特别在南方)，设施越冬蔬菜最寒冷的时期。融冻型指冬末春初之际，天气回暖，植株
6、提前萌动，而后天气又转冷，这样冻融交替，骤暖骤冷所造成的危害。如越冬菠菜，这种冻害是造成越冬菠菜死亡的主要原因，特别是在积雪的年份，化冻后水量大、缺氧窒息，造成冻害与缺氧窒息同时发生，危害更大。,二、抗寒的生理基础(抗寒生理),1.抗寒植物的形态特征株型较矮、接近原始类型的品种一般都比较抗寒，如大白菜，散叶不结球的较包心结球的抗寒性强；茎粗、色泽深的植株抗寒性强，说明锻炼的好；根系发达、粗壮也是抗寒品种的特征。,叶面积小、叶片厚多为抗寒的品种，如菠菜，尖叶类型较圆叶类型抗寒；叶片颜色深的较颜色浅的抗寒，小白菜的抗寒性依次为:黑绿色深绿色浅绿色；在解剖学特征上，抗寒品种叶片的栅栏组织层数多，栅栏
7、层厚；叶片上表面气孔指数大。这些特征为选择抗寒性强的栽培品种提供了依据。,2.抗寒植物的生理特性,（1）细胞的某些特性与抗冻性的关系细胞越小抗冻性越强；细胞的水化程度（自由水含量的多少）越低抗性越强；原生质膜的透性大抗性越强；细胞质结构粘滞性低有利于抗冻；原生质亲水性强（即束缚水量多）和抗凝固性强，抗冻性强。,(2)生物膜维持正常的液晶相 不会发生相变,在温度降低时，必须维持植物体内生物膜（由类脂和蛋白质组成的流动镶嵌模型）正常的液晶相，不会发生相变。在抗寒锻炼中，能增加膜脂中不饱和脂肪酸的含量，是防止膜相变的重要因素。,(3)细胞骨架对膜结构的稳定性具有重要作用,细胞骨架是真核细胞普遍存在的
8、蛋白纤维网架体系，植物中主要指微管和微丝。由于微管通过微管连接蛋白与脂膜紧密相连形成脂膜-微管复合体，这种复合体的形成对稳定脂膜液晶结构动态稳定具有重要作用。低温锻炼和ABA、GA处理可以提高微管、微丝对低温的抗性，这种抗性的提高与微管、微丝自身结构稳定性以及微管-微丝的连接有关。,细胞骨架的这种结构稳定性与微管蛋白和60kD磷酸化蛋白/肌动蛋白的比率相关。植物激素可以促进微管蛋白翻译后修饰，并提高微管对低温的抗性。微管蛋白翻译后修饰主要包括微管蛋白酪氨酸化和去酪氨酸化、乙酰基化以及微管蛋白多聚谷氨酸化和多聚甘氨酸化。,（4）必须避免细胞内结冰 以防止冰晶对膜的破坏,办法是在抗寒锻炼的过程中，
9、增加细胞液中的溶质含量，可以降低冰点，甚至形成过冷却状态，即水在降温到略低于冰点时往往不立即冻结。如果植物组织内的水处于过冷状态而不结冰晶，它就能忍受更低的温度而不死。但是过冷状态并不稳定，他很少能保持几小时以上。另一方面是增加膜对水的透性，以便在温度降低时，使细胞内的水分能够迅速地流到细胞外去结冰。,(5)必须具备抗冰冻脱水的性能,细胞内的水分流到细胞外结冰，虽然能够避免细胞内结冰的严重冻害，在细胞外，结冰也会造成伤害。这一方面是因为冰冻脱水，会引起细胞干旱使蛋白质变性。另一方面，会使细胞发生收缩凹陷，使细胞膜遭到破坏。抗寒植物的适应办法是，在抗寒锻炼中，大量积累亲水性物质，如糖和糖醇等。另
10、外还可增加质膜的含量，使质膜成为弯曲的波浪状，以避免冰冻脱水引起细胞收缩中的损伤破坏。,3.生物膜系统与抗寒性,(1)膜脂组分与抗寒性高等植物膜脂中含有磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷酯酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)等磷脂和单半乳糖二甘油脂(MGDG)、双半乳糖二甘油脂(DGDG)、硫脂(SL)等糖脂。抗寒性品种膜脂中MGDG、DGDG、PC和PE的含量，都比不抗寒品种含量高，而PG、PI、SL的含量，都比不抗寒品种的含量低。,(2)膜脂中脂肪酸成分,膜脂不饱和脂肪酸含量高，膜脂相变温度会降低，植物的抗寒力对应提高。植物体内的膜脂中通常含有特定组成的脂肪酸，多聚不
11、饱和脂肪酸约占脂肪酸的60%。其中三烯脂肪酸的多少与植物的抗冷性关系密切，它还是信号分子茉莉酸（JA）的合成前体。,抗寒品种或经过低温锻炼品种叶片膜脂中含不饱合脂肪酸多。品种间不饱合脂肪酸含量的差异，在任何生长温度下都能表现出来，可作为一些作物鉴定抗寒性指标，例如MGDG的不饱合脂肪酸指数，抗寒品种较不抗寒品种高出35%以上，亚麻酸/亚油酸比值高一倍。由此可见，不饱合脂肪酸指数或不饱合脂肪酸间的比值，都与品种的抗寒性有关。但也有例外的，如在苹果、西蕃莲属植物中，细胞膜系统中不饱合脂肪酸与抗寒性并没有表现出正相关的关系。因此，不能当做抗寒之高低的唯一指标。,(3)膜结合酶的变化,Lyons等(1
12、970)研究指出，不抗冷的番茄、黄瓜果实的线粒体，琥珀酸氧化酶在912间，发生明显的活化能(Ea)变化，氧化酶活化能的转折温度，与它们的受害低温相似。抗冷的甜菜根、马铃薯块茎的线粒体琥珀酸氧化酶在912间，没有发生活化能的变化，也没有发生冷害。他们推测912是不抗冷植物线粒体膜的相变温度，因为不同植物的线粒体膜脂成分不同，膜脂的相变温度也就不同，因而膜结合酶的活力，受膜脂相变的影响而改变。,（4）膜脂脂肪酸去饱和酶增加植物抗寒性,脂肪酸去饱和是指以与载体结合的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸为底物，由脂肪酸去饱和酶催化在脂肪链上形成双键的反应。根据作用底物结合的载体不同可以分为三类：脂酰CoA去饱和酶
13、 脂酰ACP去饱和酶 脂酰-脂去饱和酶，-3脂肪酸去饱和酶是其中重要的一种膜脂脂肪酸去饱和酶,4.蛋白质变化与抗寒性,(1)可溶性蛋白的变化经过低温锻炼的大白菜、小白菜、菠菜等，可溶性蛋白质含量均表现增加，在喜温性蔬菜中也表现增加的趋势，这一变化说明在抗冷锻炼中，抗冷性的增加需要的蛋白质的重新合成。在多种其它植物上的实验也同样显示出有蛋白质合成增加的现象。,(2)酶类的变化,主要是保护酶系统(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、过氧化物酶)的变化。植物细胞中存在着可以伤害膜的活性氧，这些保护酶的作用主要是清除这些活性氧，以保护细胞膜。叶绿体和线粒体中的SOD同工酶对低温较敏感，而细胞质部分的
14、SOD同工酶，在不同低温下无明显的变化。,将常温下生长的甜椒幼苗经1低温锻炼，SOD活性有不同程度增强，耐寒品种酶活性较对照增加了57.5%，同一条件下不耐寒品种CAT活性也得到促进。这些酶活性的提高，意味着幼苗清除活性氧能力得到提高，从而也增加了抵御低温伤害能力。A.C.Kpymun和M.A.(1954)，采用白天1520，夜间05的锻炼温度，对辣椒、茄子的种子进行锻炼，结果培育出的植株对低温有较好的适应性，锻炼植株叶片中过氧化物酶活性、抗坏血酸含量都较对照高，,Shoji(1986)以菠菜为试材研究了脂肪酸合成酶系统与抗冻性的关系。将菠菜品种Atlas生长在温度为20，相对湿度为70%的控
15、温温室内，自然光照，6周后取其一部分在5、光照1万Lx下锻炼5周。然后测定脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰COA羧化酶(AC)、乙酰COA酰基载体蛋白转酰基酶(AT)、丙二酰COA酰基载体蛋白转酰基酶(MT)的活性，在锻炼初期下降很快，随后又明显上升，可见锻炼时这些关键酶与激活脂肪酸重新合成酶直接有关。,Shmer(1975)冷锻炼诱导白菜中1.52磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)发生变化，酶的两个亚基形成两个截然不同的峰。C4植物光合过程中一关键酶丙酮酸磷酸双激酶，在低温条件下由四聚体变成二聚体，在温度回复时又可以变化功能状态的四聚体。在有些植物中，还能观察到乳酸脱氢酶、ATP酶、蔗糖合成酶
16、、核酸酶类、NAD+一苹果酸脱氢酶等酶或同工酶的量变。,(3)逆境蛋白(抗冷蛋白或冷训化蛋白)的产生,Heber(1970)研究小组在抗冻的菠菜和白菜叶中分离出两套“冰冻保护性叶蛋白”，其分子量在1020KD，这些蛋白能十分有效地防止结冰时离体类囊体膜的光合磷酸化失活。Guy(1985)等以冷锻炼和未锻炼的菠菜叶为材料，标记分析体内蛋白质合成类型，结果表明，在冷锻炼组织内出现82KD的蛋白质，并与离体翻译产物一致。,kurkela(1988)等对芥菜的研究首次提出了植物低温锻炼中特异性表达的基因Kinl及多肽6.5KDa的形成。诱导形成的6.5KDa多肽有不同寻常的氨基酸组成：富含丙氨酸、甘氨
17、酸、赖氨酸，这与北极鱼类中发现的抗冻蛋白的组成十分类似；Northern Blot显示Kinl基因mRNA的转录水平在低温锻炼条件能扩增20倍以上，并且其扩增能被水分胁迫和ABA有效诱导。,在植物抗低温基因工程方面的工作已有明显的进展。如鱼类抗冻蛋白基因已被导入番茄和烟草中，产生的融合蛋白具有抑制冰晶形成的作用(Hightower1991)，人工化学合成的比目鱼抗冻蛋白基因成功导入玉米原生质体，并得到表达(Georges,1990)；最近日本科学家Murata(1994)通过向烟草导入拟南芥菜叶绿体的甘油一3一磷酸乙酰转移酶基因，以调节叶绿体膜脂的不饱和度。,(4)氨基酸的变化,植物处在逆境条
18、件下体内游离脯氨酸异常大量地积累。何若韫等(1986)测定了大白菜从秋至冬的生长和冷驯化期游离脯氨酸含量的变化，结果指出，球叶的耐冻性与游离脯氨酸(FPRO)含量呈一定的正相关。FPRO是一种胞质氨基酸(Leigh等,1981)，大白菜叶中含量如此高的FPRO如果主要是局限在占细胞容积很小比例的胞质中的话，可以设想，其在组织结冰时对原生质的保护作用要远比主要分布在液泡中的糖重要得多。因此，对于只能忍耐霜冻的抗寒性较低的大白菜而言，含有大量游离脯氨酸，作为渗透调节剂和冰冻保护剂对低温生长和贮藏期间的抗冻性是有一定作用的。,三、低温锻炼与抗寒性的提高,并不是所有的植物经过低温锻炼抗寒能力提高很多，
19、那些喜温蔬菜抗寒能力只能提高的0左右，耐寒蔬菜的耐寒能力能提高到零下10、20甚至30。而且从植物本身来说，生长和抗寒性是矛盾的，活跃生长的植物不抗寒。,（一）提高抗寒能力的方法,1.化学调控 脱落酸（ABA）、聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVA）丁酰肼（B9）、赤霉素（GA）、氯化钙（CaCI2）、矮壮素（CCC）、甜菜碱（CB）、水杨酸（SA）、乙硫铵酸（ETH）、半胱氨酸、BR、黄腐酸、脯氨酸、蔗糖、VC,2.日照长短,因为在抗寒锻炼中，需要能源来自光合作用，光照影响碳水化合物的积累多少，短日照反而减少植物的抗寒能力。另方面，光照可以通过形态建成影响锻炼过程，缩短日照和低温处理，导致植
20、物生长停顿，这与提高抗寒性是一致的。3.控制水分 缺水限制植物生长也能提高植物的抗寒性。,4.低温锻炼,(1)种子锻炼 蔬菜种子的低温处理(也叫冷冻处理)，把已经浸胀的种子进行一段时间催芽，胚芽将要萌发时，进行冷冻处理。冷冻处理一般用0左右的低温冻1-2天，有的放在零下25处进行25小时的处理，没有设备条件的可放入雪堆中，处理后放在凉水里缓冻，然后再进行催芽,低温处理可增强幼苗的抗低温能力，也就是利用萌动种子对环境适应性强的特点，使之产生适应低温的特性。如黄瓜发芽最低温度为12.7，低温处理后10就能发芽。再如变温处理番茄催芽的种子，每天在15的低温下12-18小时，接着提高到1822的温度下
21、6-12小时，反复进行几天，糖和维生素C的含量都有增加，氧化酶的活性也有增加，因此提高了抗寒性。,(2)幼苗锻炼,前期锻炼，在子叶展开真叶未出来之前是一个关键时期，特别是甘蓝，在温度管理上，一般较正常温度下降3管理；中期锻炼，在移植缓苗后需降温；后期锻炼，在定植前对秧苗进行的锻炼，使之适应露地环境条件,(3)田间锻炼,指越冬菜在越冬前的锻炼。例如越冬菠菜在越冬前的温度逐渐降低过程中，通过采取措施，使其体内的含糖量增加，提高越冬期间的抗寒能力。主要措施是控制播种期、控制水分、控制生长速度，保证上冻时达到6片叶，不能少也不能超过。如达不到6片叶，根系扎的浅，生长点暴露在外面，易被冻死；超过6片叶，
22、植株体过大，地上部分消耗过多的糖分，抗寒性降低。只有6片叶时，低温锻炼的效果最明显，越冬的死苗率最低。,2.低温范围、锻炼时间与抗寒效果,不同低温、锻炼时间的长短对植物抗寒性是有影响的。植物的抗寒锻炼是分阶段逐步进行的番 茄沈征言等（1983年）在研究低温锻炼对番茄幼苗抗寒性的影响时指出，15的温度即可开始影响番茄的耐寒性，在015范围内，耐寒力基本上随着锻炼温度的降低而呈阶梯式地增强，大致可分为三段(幼苗3-4片真叶时锻炼),第一段：1215，作用很小，经过1215温度锻炼的番茄幼苗其致死低温比对照仅下降0.5。第二段：512，在此温度范围内的低温锻炼能较好地增强番茄的耐冻力，致死低温稳定在
23、-2.5，比对照下降了1.2。第三段：02，能显著提高番茄的耐冻力，致死低温下降到-3.5-4.0。同时看到在2.0下锻炼的番茄叶片组织的细胞液外渗百分率还略低于0的，可以认为2.0是提高番茄耐冻力的最适锻炼温度，这一结果与Chen等（1980）在马铃薯上所获结果完全一致。,使番茄获得最大耐冻力所需的锻炼天数随锻炼温度而变，锻炼温度低，所需时间短；反之，时间要长。锻炼温度为5.0时，最少需锻炼6天才能表现其最大耐冻力；锻炼温度下降到2.0时，只需2天即能得到预期效果。延长锻炼天数，也不能再继续增强其耐冻性。,油 菜,Kacpersks-Palacz（1978）对油菜低温锻炼提高抗寒性的研究表明
24、，油菜抗寒锻炼的温度为5-2（0是油菜和甘蓝的结冰温度）分3阶段进行：第一阶段：由降至5或2的低温诱导，可使油菜的原有抗寒水平-5左右提高几度。第二阶段：由亚结冰温度0至-2或-3诱导，可引起组织最大抗寒性的发展完成。第三阶段：依赖于冰冻时间延长，引起细胞脱水而继续提高抗寒性。,黄 瓜,杨阿明等(1992)在研究低温锻炼提高黄瓜幼苗耐寒性效应时指出，以较低的夜温锻炼黄瓜幼苗可有效地提高其耐冷性，11以下的低温锻炼效果比较明显，以6锻炼效果最佳。在6温度条件下锻炼6天，幼苗可获得最大耐冷性，延长锻炼时间，幼苗耐冷性不再提高。,马铃薯,低温和短日照是诱导抗寒性的两个主要条件，马铃薯在足够的光照下，
25、不论光周期长短如何，低温能使其受到锻炼。马铃薯结冰的温度是12，如果遇到结冰的温度就会降低其抗寒能力。马铃薯在白天/夜间温度25/15，15/10，10/5，5/0，每天日照15小时，处理5天，10天，15天，20天，不抗寒品种抗寒能力没有多大提高，抗寒品种温度越低抗寒性提高越多，最高为-8.7，低温加短日照更加提高抗寒性，可达-11.7。,3.低温锻炼过程中的生理生化变化,(1)生理变化 含水量降低，束缚水比例增高；随锻炼进程叶片气孔阻力增加(关系到叶片萎焉、失水和光合作用)；叶绿素含量增加；可溶性糖、氨基酸含量增加；渗透压增加；ABA增加，ABA/GA值增大；,原生质的粘滞性增大，新陈代谢
26、活动减弱；原生质的弹性增加，抗寒性提高，受冻后容易恢复。膜脂成分中的磷脂，特别是磷脂酰胆碱与不饱和脂肪酸含量的增加，从而增加膜与束缚水结合能力，来提高对冰冻脱水的抗性；液泡膜的透水性能提高，当温度降低到冰点以下时，细胞内的水分就能迅速地转移到细胞外，以避免细胞内结冰发生冻害,在适宜低温的诱导下，引起植物体内与温度有关的基因功能活性的改组，启动(激活)某个基因位点，接受低温信号，诱导合成新的mRNA,然后合成新的蛋白质。,（2）生物化学变化(锻炼机制),四、蔬菜的抗寒性鉴定,（一）蔬菜抗寒性的鉴定手段实验室鉴定在实验室内利用冰箱、冰水浴、人工气候室模拟田间低温条件，测定植物的抗寒性指标，鉴定其抗
27、寒性。特点是可以比较精确的控制不同低温，可以短时间内低温处理较多的植物材料，但是冰箱、冰水浴、人工气候室的容积较小，只能处理较小的植物，一次处理较少数量的植物，且处理时间较短，不能观察和测定植物整个生育期的耐低温反应。,田间自然降温鉴定,对春提早、秋延晚的露地叶菜及设施果菜；对耐寒的越冬菜；对冬季栽培的设施内各类蔬菜；成株阶段的鉴定很重要。因为这个时期是对实际抗寒能力检验的关键时期(对低温的实际反映期)。,（二）抗寒性鉴定指标的筛选,1.生态指标(1)半致死温度（LT50）过去的含义是指一半试材临界死亡的温度。现在是指单个细胞或植物组织器官作试验材料，50%以上没有冻死的最低温度。Sukuma
28、ran等（1972）基于电解质渗出率的50%，正好与半致死温度一致，提出以电解质渗出率50%时的温度作为组织的半致死温度。,（2）致死温度,请参考植物生理实验或园艺学报1988,15(1):51-56(朱月林、曹寿椿),（3）过冷点,过冷是指水溶液冷却到冰点以下的温度时，也不会结冰的一种状态。过冷点是指过冷液，在形成冰冻前所达到最亚结冰温度。据研究纯水的过冷点最低为-41（-4.1），生物细胞的过冷点为-4.5。,2.形态指标,（1）生长发育指标 种子的发芽率、发芽势、发芽指数、种子活力。植株的叶片数、叶面积、株高、茎粗、根冠比（R/T）、根重、全株干重、花芽分化情况、花粉活力、坐果率、产量。
29、（冷害级数各级株数）（2）冷害指数=最高级数总株数,（冻害级数各级株数）（3）冻害指数=最高级数总株数 未恢复时冻指恢复后冻指（4）恢复能力=100 未恢复时冻指 冷害分级标准：（5）死株率,3.生理生化指标,（1）净光合速率（2）呼吸速率（3）酶活性 超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、ATP酶、吲哚乙酸氧化酶、-酮戊二酸氧化酶、核糖核酸酶、转化酶、二磷酸核酮糖羧化酶氧化酶等，及其同工酶。（4）叶绿素含量（5）可溶性糖含量（6）可溶性蛋白含量,（7）核酸（8）磷脂（9）不饱和脂肪酸 单半乳糖二甘油脂（MGDG）、双半乳糖二甘油脂（DGDG）、磷脂酰胆碱（PC
30、）、磷脂酰醇胺（PE）、亚麻酸/亚油酸比值等。（10）游离氨基酸（11）游离脯氨酸（12）抗坏血酸,（13）外渗电导率 由于冰冻引起膜的伤害和细胞中电解质外渗，因此可以测定组织浸泡液的电导率来确定细胞的冻害程度。受冻害严重的渗出离子多，浓度大，电导率高。还可以判断细胞的死活，确定半致死温度。（14）伤流液量及各种元素的含量,4.理化指标,（1）组织细胞的渗透压 原生质脱水和结冰是发生冻害的主要原因，所以抗冻性与细胞的渗透压有关。如果细胞的渗透压高，细胞不易脱水，冰点也会下降，不易结冰。植物细胞含糖量高，细胞液浓度大，渗透压高。,（2）TTC还原法 植物生活组织具有还原能力，有电子放出来，能使无
31、色的TTC（氯化三苯四氮唑）还原为红色。TTC的还原态可将小圆叶片放在2ml 0.02%TTC溶液（0.5M，用PH=7.4磷酸缓冲液配制）中浸泡，黑暗中过夜，用光电比色法 485nm波长处测定。当组织受冻害后，还原能力降低，与TTC的颜色反应能力减弱，红色较浅，因此可根据由红色无色的变色程度，鉴别植物的抗寒性，或受冻害的轻重。此法对草本植物叶片组织测定效果较好。,5.组织细胞解剖结构观察,观察上表皮细胞层内栅栏组织厚度，下表皮组织层内和海绵组织之间的下部紧密组织厚度。,五、低温的防御对策及主要技术措施,1.趋利避害、合理布局(1)充分利用气候资源合理布局适地种植 区域化栽培（2）利用地形气候
32、利用背风向阳地带和坡地逆温带据观测一般南坡030厘米日平均土温比东、西坡高3，比北坡高56，地面最高温度比东、西坡高10，比北坡高15；晴天1.5米高度的日平均气温南坡比东、西坡高0.60.7，比北坡高1.0。,水体由于其巨大的热容量使得水体周围的陆地温度变得相对稳定。白天由于陆面升温快空气上升，水面上方的空气补充；夜间则水面上方空气相对较暖抬升，陆面空气相对较冷流向水面进行补充，这样就形成了水体与陆面之间的局部大气环流，如海陆风、湖岸风等,也有助于减轻辐射降温强度。海洋、湖泊、大江、水库周围的陆地都要比其他陆地的温度稳定有利于防寒避冻。,利用水体保温效应,利用城市热岛效应,蔬菜生产在大城市郊
33、区最为集中。城市由于建筑物白天吸热较多，夜间则由于城市上方的烟尘和CO2气体较多，有抑制地面辐射降温的作用，加上城市消耗能源放热多，使得城市温度明显高于郊外，形成城市热岛效应。,2.改善菜田生态环境,(1)营造防护林(2)合理间套作(3)培肥和改良土壤 砂性土和板结土壤在冷空气入侵时保温性能都较差，再加上保水性能差，易形成旱冻交加而加重冻害。增施有机肥或客土法将菜田的砂土和粘土掺合，可形成具有良好结构的土壤，改善土壤的热性质和保水性能，从而减轻冻害或霜冻。(4)设施栽培,3.提高蔬菜作物抗寒性,(1)确定安排安全播种期、定植期及收获期 耐寒性蔬菜土温达5既可播种，喜温性蔬菜需达12以上。从抗寒
34、的角度，与播种期关系密切的，主要是越冬菜；与定植期关系密切的主要是喜温的果菜类；与收获期关系密切的主要是大白菜、萝卡、胡萝卜等。再就是冬季生产的保护地蔬菜，播种期、定植期、收获期均与温度关系密切。,(2)选用抗寒品种,在低温的季节应选择抗寒的蔬菜种类。例如，早春种一些菠菜、小白菜、小油菜、豌豆、甘蓝：晚秋也可以种菠菜、油菜；越冬菜主要有菠菜、韭菜、大葱和一些多年生蔬菜。在保护地冬季种一些油菜、莴苣,既可以提高土地利用率，又可以增加产值。在喜温性蔬菜中，抗寒的品种比较少，一般一代杂种比品种较抗寒。,(3)进行抗寒锻炼(4)合理施肥浇水(5)促进根系发育(6)运用植物生长调节剂,脱落酸(ABA),
35、是一种内源激素，对植物的生长起抑制作用，使植物进入抗寒锻炼，在作物低温锻炼过程中，用适当浓度(喷施100200ppm、灌施1020ppm)的ABA可增加锻炼效果。一般对抗寒性强的品种的效应比抗寒性弱的品种显著。,矮壮素(CCC),在十多种作物上应用效果是肯定的，特别是白菜、油菜上（1000ppm），可提高耐寒力。在春季果菜上喷用，可防止“倒春寒”的危害。B-9(SADH)在白菜上使用，可减轻冻害，B-9能改善细胞内的叶绿素及无机盐(Fe、Ca及Mn等)的含量，增加物质的同化和积累，提高细胞液浓度，从而提高抗寒力。一般使用浓度为2000ppm左右。,2,4-D,对防寒、防落花落果均有明显效果，春
36、番茄早期落花落果的主要原因是定植后的低温，低温可以造成花粉发育不良、花粉管萌发不良，导致落花落果，而用2,4-D处理后,可明显提高座果率。PCPA 作用同2,4-D，但使用方便，可喷施。2,4D只能蘸花，浓度大(重复蘸花)可产生药害。MH(马来酰肼)对提高耐寒性有一定效应,氯化钙（CaCl2）,是一种生物膜稳定剂。一般用0.10.3%浓度喷施，在冻害前喷可减轻冻害，在冻害后喷可加快恢复健康。多效唑（MET）具有延缓植物生长、抑制茎的伸长、提高植物抗逆性作用。主要是通过降低GA类物质和IAA的含量，来调节植物功能的。,(7)进行植株调整(8)嫁 接 选用抗寒性强的野生品种作为砧木与栽培品种嫁接，
37、不但可以提高抗寒性，还可提高抗病性。,4.应急措施,(1)烟雾法(2)加热法 成本高，国外试验田(3)鼓风法 成本高，国外试验田(4)抑制冰核活性细菌,冰核活性细菌,自从80年代初国外发现冰核活性细菌(INA)的存在以来，我国到1989年已分离出大量的冰核细菌，实验证明，在日平均气温10左右，INA的数量最多，如玉米幼苗带INA的，温度降到-3时开始结冰，-5受到严重伤害，而不带这种细菌的直到温度下降到-8才开始结冰。INA细菌的密度越大，作物发生冻害的温度越高。因此，如果能减少这些冰核活性细菌，就可以使植物体内的水在0以下保持过冷却状态不结冰，从而大大减轻冻害。,美国用竣化树脂聚合物喷洒叶面
38、形成保护膜，将叶片上的INA包围起来，抑制其繁殖。日本研制辛基苯渴酰二甲基铵，能有效破坏这类细菌的成冰活性；国外还有人施放噬菌体或对冰核活性细菌有拮抗作用的细菌。还有人在研究应用基因工程技术，切除冰核活性细菌染色体中产生冰核活性的基因，使之在成核活性上与普通细菌一样。,六、植物抗寒基因工程研究进展,1.植物低温诱导蛋白研究进展植物对低温的适应可能需要两个条件：特异基因的转录激活及在最大抗寒过程中新蛋白质的低温诱导合成。说明植物抗寒锻炼实质上是感受低温信号、调节基因的表达和代谢的环境适应过程，即低温驯化的过程，通常译为冷驯化。植物低温诱导蛋白是指那些受低温诱导而产生的蛋白质，有些还受ABA、干旱
39、、盐胁迫、热激等因素的诱导。,低温诱导蛋白（cold induced protein)又称冷诱导蛋白，是伴随着植物的低温驯化而出现的新蛋白质。其生理生化功能十分广泛，包括降低冰点、脂类转移、激酶调节、阻止脱水、抗光氧化等等冷调节蛋白（cold regulate protein,COR）是另一类低温诱导蛋白，不由低温专一性诱导，还可以被外源ABA和水胁迫诱导。,抗冻蛋白（antifreeze protrin，AFP）,最初是在极区鱼的血清中发现的一种能降低细胞间隙体液冰点的糖蛋白，可使鱼以避冻的方式抗冻在拟南芥中发现的冷调蛋白COR6.6蛋白、油菜中的BN28蛋白以及冬小麦、冬黑麦、燕麦、沙冬青
40、和胡萝卜中发现的一些低温诱导蛋白与极区鱼的AFP在氨基酸序列上有很大的同源性。,而且植物的AFP与某些抗病蛋白具有化学结构上的相似性。已经证实冬黑麦冷驯化过程中积累的抗冻基因与三种抗真菌蛋白（几丁质酶、-葡聚糖酶和甜味蛋白）的编码基因具有同源性，从而提示了植物抗冻与抗真菌之间可能存在共同的反应机制。在其转化植物基因表达产物对冰的形成产生影响。,Hincha等（2000）在大白菜的叶片中纯化的抗冻蛋白可以保护从没冷驯化的菠菜叶片中分离到的类囊体免受冰融化伤害。序列分析表明与脂运输蛋白Wax29有同源性，属非特化脂运输蛋白类，但只有抗冻活性没有脂运输活性。,热激蛋白（heat shock prot
41、ein，Hsp）,在沸点下稳定可溶。通常在机体受到高温刺激时增加，与保持酶在高温下的活性和维持机体的稳定有关。是一个很大的家族，根据其分子量而区分为HSP110、HSP90、HSP70等类群。如ER-HSP70就是在菠菜冷驯化过程中发现的一种热激蛋白，在蛋白质的转运、折叠、装配和拆卸过程中起作用。,胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein，LEA）,是一类在植物种子胚胎发育晚期富集合成的一系列蛋白，富含甘氨酸和其它亲水氨基酸，疏水氨基酸含量较少，具有高度的亲水性和热稳定性，在干旱、低温和盐渍胁迫下因失水而诱导产生，属冷调节蛋白。研究发现植物的
42、许多低温诱导蛋白是LEA。如小麦的Wesl20、COR39、Wcor410，大麦的HAV1，菠菜的CAP85，苜蓿的CASl7，拟南芥的COR47、LTl30、RABl8等。,植物脱水素（dehydrin）,是一类可被外源ABA、干旱、低温和盐胁迫所诱导的蛋白。是LEA蛋白家族的成员，具有高度的亲水性、在沸水中保持可溶的稳定性和可被ABA诱导表达等特性。主要功能是保护植物细胞中的大分子在脱水过程中不受伤害，可能的作用机理是维持细胞膜在脱水状态下的稳定性，另外在细胞内信号转导中其重要作用。,2.植物-3脂肪酸去饱和酶的研究进展,脂肪酸去饱和是指以载体结合的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸为底物，由脂肪酸
43、去饱和酶催化在脂肪链上形成双键的反应，分为三类。-3脂肪酸去饱和酶是脂酰-脂去饱和酶的一种。位于植物内质网膜、质体膜和兰藻类囊体膜上，其空间位置在sn-1或sn-2,作用位置在-3，以与载体结合的不饱和脂肪酸为底物，催化与甘油脂结合的二烯脂肪酸形成第三个双键。,根据电子供体不同可分为两类,一类定位于植物细胞的内质网，以细胞色素b5为电子供体，作用于磷脂酰甘油（PG）或其它磷脂。另一类定位于植物细胞质体，以铁氧还蛋白为电子供体，作用于磷脂酰甘油，硫脂和半乳糖脂。质体定位的与内质网定位的去饱和酶氨基酸序列有很高的同源性。,在模式植物拟南芥中存在的-3脂肪酸去饱和酶,FAD3基因编码内质网型-3脂肪
44、酸去饱和酶FAD7、FAD8基因编码的质体型同工酶。其中FAD3、FAD7在常温下表达，FAD8在低于20下表达。自1992年Arondel等克隆了拟南芥内质网-3脂肪酸去饱和酶基因以来，陆续克隆了拟南芥（质体）、油菜、大豆、豇豆、蓖麻、小白花、小麦等的微体和质体-3脂肪酸去饱和酶基因。,-3脂肪酸去饱和酶的生理功能,脂肪酸是细胞膜脂的主要成份，多聚不饱和脂肪酸约占总脂肪酸的60%。高含量的多聚不饱和脂肪酸，主要是三烯脂肪酸在高等植物抗寒中其重要作用。三烯脂肪酸还是信号分子茉莉酸（JA）的合成前体。,众多的-3脂肪酸去饱和酶是由来源于同一祖先基因的多基因家族成员编码的，定位于质体和内质网膜上。
45、它们催化十八碳三烯酸（18:3）和十六碳三烯酸（16:3）的生物合成，使脂肪酸形成第三个双键。是这一合成途径的关键酶。它们在改变植物膜脂脂肪酸的组成、提高其不饱和度、叶绿体的发育及叶片成熟过程中三烯脂肪酸含量的增加、抗冷性的增强、低温光抑制后光合能力的恢复等方面具有重要作用。,3.植物抗寒分子机理,植物细胞膜在感受外界低温信号时，细胞膜的流动性发生改变，同时伴随着细胞骨架的重排。他们通过流向胞质的钙流将体外的低温物理信号转化为体内的生化信号。将钙流与下游信号分子偶联起来的物质是钙调蛋白（CaM）和钙依赖性蛋白激酶（CDPK）、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）等蛋白激酶，它们可能通过将蛋白质磷酸
46、化和去磷酸化的方式传递信号。,转录因子CBF调控信号路径,低温信号下游路径非常复杂，但此路径是被广泛认可的。受这条路径调控的冷诱导基因其启动子区域都含有CRT/DRE顺式作用元件。与这些顺式元件作用的蛋白质为转录因子CBF1、CBF2、CBF3（亦称反式作用因子DREB1a、DREB1b、DREB1c）。CBFs作为转录因子通过与CRT/DRE结合对冷诱导基因表达起顺式调节作用，诱导基因表达。CBFs基因也有一个启动子假设的转录激活因子ICE，在受到低温刺后被激活，激活的ICE与CBFs转录因子上的ICE盒子结合诱导CBFs 表达。,负调节因子调控方式,SFR是从拟南芥中鉴定出的一组7个基因，
47、它们有降低冷驯化植株抗冻性的作用。其中SFR6对CBF调控因子的调节表达有作用，表现在CBF转录和调控子的诱导。ESKIM01是用化学突变法分离的冷驯化突变体基因。ESKIM01（eskl）的突变，导致了未冷驯化植株Pro、总糖含量升高，而且Rab18（拟南芥的LEA）的转录水平高出3倍。估计在植物体内有eskl信号途径和CBF调控子冷驯化途径，且平行独立存在。因为eskl的突变对CBF调控子的表达没有影响。其作用机理不清楚。,HOS1和HOS2也是一个负调节因子基因。通过位移克隆技术鉴定的HOS1基因编码一个带有指环序列单元的蛋白质。HOS1的精确功能尚不清楚，但是HOS1植物体内的CBF/
48、DREB1基因的转录被发现是被超诱导的，因此有理由相信HOS1是一个负调节因子，作用于CBF/DREB1的上游。,4.植物抗寒基因工程,至今已经克隆了约百余种冷诱导基因，如膜脂脂肪酸去饱和酶基因、与渗透调节有关的基因及抗冻蛋白基因。根据其被诱导的专一性可分为两类：低温专一诱导基因 专一受低温诱导表达冷调节基因 不仅受低温诱导，还能被ABA、短日照、水分胁迫等诱导,根据基因产物功能还可分为两类,保护基因 其产物直接起到抗寒保护作用。如膜稳定性相关的基因；抗渗透胁迫相关基因；抗冻蛋白基因；细胞活性相关基因。调控基因 其产物对信号的传递及保护基因的表达起到调控作用。可以是转录前的信号传递调控，转录调
49、控，转录后产物后修饰调控。,(1)转入与膜稳定性相关的基因,导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因膜是低温伤害的原初位点，导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因，通过降低膜脂脂肪酸的饱和度，可以降低膜的相变温度，提高植物抗寒性。Kodama将拟南芥叶绿体中-3脂肪酸脱氢酶基因fad7导入烟草中，所获得的转基因烟草抗寒性增强。Ishizaki-Nishizawa等将从兰细菌（Anacystis nidukans）中克隆的9-去氢酶的基因Des9转入到烟草后，发现转基因烟草中受到修饰的9-单饱和脂肪酸的含量与野生型相比增加16倍，半致死温度明显降低。,Yokio等通过根瘤农杆菌介导并以玉米Ubiquitin作为启
50、动子把拟南芥的3-磷酸甘油脂酰基转移酶基因（GPAT）导入水稻中，提高了叶片叶绿体不饱和脂肪酸（PG）的含量和叶片的耐低温性。,导入防御酶系基因,通过基因工程方法导入防御酶系基因，调控其过表达，可以清除过量的活性氧，产生良好的抗氧化能力。Mckersie等通过pEXSOD载体将拟南芥Fe-SOD基因转入紫花苜蓿中，两年试验发现转基因植株越冬存活率大大提高。Samis等将Mn-SOD基因导入紫花苜蓿，不仅提高了转基因植物的膜稳定性，同时使植株生物量得到增加。,（2）转入与抗渗透胁迫相关的基因,低温引起次生干旱造成的渗透胁迫不仅给生物膜造成严重的伤害，同时也使内源可溶性蛋白变性、胞内有序的空间结构
