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1、GFP蛋白的表达、分离与纯化,王媛媛,试验流程,课堂提问每人2-3个问题;权重:30%总结报告PPT,5人一组,10分钟;权重:30%实验报告权重:40%要求:标准的论文格式:中、英文标题和摘要;前言;材料与方法;结果;讨论;参考文献。,考核形式,PPT:照片、视频展示个性,潮!,Day 0:准备实验材料Day 1:GFP表达质粒的提取;Top 10感受态细胞的制备;GFP表达质粒转化Top 10。Day 2:GFP表达菌株扩大培养;GFP的诱导表达。,时间安排,Day 3:表达菌株的收集、破碎;硫酸铵沉淀所用浓度的确定;硫酸铵沉淀GFP;疏水层析。Day 4:离子交换层析;透析;凝胶过滤层析
2、。Day 5:SDS-PAGE;染色;脱色,观察结果。记得带照相机!,鸣谢:生命学院生物科学104班邹兵 周嘉 赵琅李运彰 汪源,无菌操作,原核:E.coli真核:Yeast Insect mammals,蛋白质表达,Vector:pET series,pGEX series,gateway series,pMAL,pTWIN I,pETDuet,et.al.,原核表达系统,BL21(DE3),BL21(DE3,pLysS),Origami,Rosetta,Rosetta-gamiTop10,HB101,C41/C43,E.Coli host,能否用BL21(DE3)表达pGLO?能否用Top10表达pET32a?,思考:,,加入诱导剂;,收获菌体;诱导剂用量 IPTG:0.2mM;0.5mM;1mM诱导温度 20;25/28;37,Culture conditions,如何留样能在一张SDS-PAGE胶图中(10-12 wells)体现诱导的效果、(NH4)2SO4粗分离效果、疏水层析纯化效果、离子交换层析纯化效果、凝胶过滤层析纯化效果?,留样set control,HIC,IEC,GFC,样品体积对分辨率的影响,