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1、用Image-Pro Plus(IPP)分析免疫组化图片,1.免疫组化图片分析原理,根据染色染料颜色的深浅及分布面积大小来确定目标蛋白的量。染色区域分布面积与目标蛋白量成正比。染色的颜色深浅与目标蛋白量的定量关系符合朗伯-比尔定律，是对数关系。,1.1光密度与灰度迷惑人的不同概念,光密度：吸收光的物质的光学密度。（optical density,就是常说的OD值）光密度值是直接与染色物质的量相关的。灰度：灰是不够黑，是反射亮度的单位。电子照片上像素的亮度称为灰度。,Gray:between white and black,Example:1.The bright value on displa
2、y screen is gray value.2.The dark value on a white paper is also the gray value.,255,Optical Density:吸光物质的光学密度.,被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑。OD值与物质的量直接相关，数字图象上点的灰度值与对应物质OD值成对数关系，符合朗伯-比尔定律。理论上OD值是从零到无穷大。实际应用中，OD值的范围常用0-2.0或者0-3.0。,用OD值是正确的,分光光度计与酶标仪的测定值是OD值透射的显微镜图象上的光强度要用OD值蛋白电泳条带的测量也是OD值。萤光
3、显微镜及萤光分光光度计的测量值是萤光强度(Fluorescence intensity)用EB染色的DNA凝胶电泳条带也是萤光强度，但处理方法与光密度相同，故也用OD值。这个OD与前面的OD又有不同的意义。它就是荧光的光密度。反映着荧光物质的多少。,处理照片时用的却是灰度,各种图象被拍摄成照片进行数字图象处理时，计算机是对照片的灰度进行测量和计算的。为了定量物质含量，最后还是需要转换为OD值来表示。所以对免疫组化照片的分析结果应该是一个OD值，光密度。不应该是灰度。准确地说，是对免疫组化照片的特定染色区域的灰度进行分析从而测量出组织切片的光密度值。,用标准样品才能把OD值与样品量关联到一起,O
4、D值是一个没有单位的相对值。使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线。对电泳条带进行定量分析时一样要作标准曲线。电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指数函数。在把灰度值转换成OD值时，用一个标准点进行定量分析是不准确的。多个标准点的标准曲线亦有很大误差，因此只能说是半定量分析。,1.2定量分析的指标：IOD(Integrated option density)与Mean Density,将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。此值与目标物质的总量成正比。IOD值除以有效目标分布区域的面积，得到Mean density，此值反映了目标物质的单位面积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时，就是比较
5、它们之间的平均光密度值的大小。,1.3比较两张照片的染色物质量的差别,两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大,比较两张照片的染色物质量的差别,两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大,这回该怎么看？,A的颜色深，面积小。B的颜色浅，面积大。,比较体积！,尺寸,光密度,1.4 实际图片的情况很复杂的。,阳性样品染色深，阴性样品染色浅。,直接比较整张图片的IOD等于在比较整张图片的mean density,哪一个染色物更多？,染色区域颜色深度接近，染色面积有差异。,使用不同的area会得到不同的结论要结合切片情况来判断。,IOD对整张图片的面积作平均。IOD对特定组织区域的面积作平均。IOD对显
6、色的组织区域作平均。,对整张图片区域进行平均的情况比较少，这张图片中黄色的IOD值主要来自于中间一块区域内。,右上角的空白区面积应该扣除。,也许应是这个特定的组织区域,这个区域是特定染色的区域。在计算IOD时能同时计算出来，但以此为平均面积往往并不正确。,对单个细胞的分析比较,单个细胞的IOD单个细胞的mean density照片上各细胞IOD或mean density的平均值,边界不清晰的贴壁细胞,整张图片IOD/细胞个数（照片中细胞数目不多，数起来不费事）,细胞簇的分析,测量整张图片黄色区域IOD。再测量细胞分布的区域面积 area。对染成蓝色的细胞核计数，作为细胞数N。以 IOD/（N）
7、作为统计指标。或IOD/area,2.从图片上分析光密度方法 的技术进步,简单测量整张照片的光密度值。在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。计算其平均值作为整张照片的光密度值。在照片上准确选择被染上染料的特定颜色的区域，计算这些区域的累积光密度值（IOD），进而计算统计区域的平均光密度值。,2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪,其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片的整体光密度。可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。,2.2 抽样测量光密度,在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测量这些小区域的灰度值，取其
8、平均值作为比较染色深浅的指标。,随机选取几个区域但是能作到“随机”吗？,2.3 ImagePro plus的独特优势。,准确地按照一个颜色标准来选取一个AOI(area of interesting)。测量这个区域的光密度参数。,使用IPP比前两种方法更好。,在查到文献中使用的图象分析方法是前两种的时候，完全可以用IPP的分析测量来代替。结果更加准确。不必照搬文献上所述的方法。随着计算机技术的发展，以后也许还会有更好的图象分析方法及图象分析程序的。,3.用IPP分析免疫组化图片的过程,拍摄样品照片。选取图片上具有染料色调的区域（AOI，area of interesting）。测量该区域的IO
9、D。选择并测量有效统计区域的面积计算光密度平均值IOD/area（mean density）计算同一实验组切片各照片的平均及标准差。用统计学方法分析各实验组的平均mean density之间是否有显著性差异。,3.1用于免疫组化半定量分析的照片拍摄,与普通显微镜照片不同，用于免疫组化分析的显微镜照片有其特殊的拍摄要求。,显微镜光源,正确调整显微镜光源为日光色温的白色光。此时是加蓝色滤光片，灯丝电压为9V左右。一般的显微镜上都会有指示的。此时的镜下视野会感觉明亮得有点刺眼。不能通过调整聚光镜光圈的方法减低亮度，这会影响到光学系统分辨率及图象的清晰度。不能加过大的灰度镜减低亮度。用25%的ND滤光
10、片还行。6%的ND滤光片常导致色彩失真。如果照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片色彩，从而使得测量结果不准确。,固定显微镜的工作条件,不仅是光源亮度，除了更换样品时调节载物台位置，其他部件一律固定下来。特别是不要来回切换使用不同放大倍数的物镜。使用一个物镜拍摄所有的照片后，再切换到另一个物镜上拍摄照片。为保证显微镜光源的稳定一致，所有照片应该一次拍摄完成。不能分数次拍摄。若能给显微镜加上稳压电源就更好了。这能保证显微镜光源亮度的稳定。,必须使用手动控制曝光的相机,对每张照片要使用相同曝光时间，而不是由相机自动控制曝光。染色深的阳性样品就应该拍摄得较暗。染色浅的阴性对照样品则应该拍摄得较明亮。
11、各种拍摄条件确定后，就必须使用这个条件一次拍摄完所有的照片。以保证它们的曝光一致。,控制相机曝光时间,要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方呈现纯亮的白色。拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰度值应达到230左右。可以使用图象分析软件测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图像分析数值的偏差。同时背景灰度值也不宜过高。把空白灰度值调到230以上相当于在分光光度计上调节100%透射。,背景的影响,左图：暗且偏蓝的背景严重影响到了阳性区域的色调。而且降低了黄色象素点的IOD值。这会严重影响分析结果。有的CCD具有手动较正色温的功能，可以较正一下背景色调
12、，但暗背景既使不偏色也是影响分析结果的。,较暗的背景值对分析结果的影响,显著性差异,无显著性差异,扣背景后依然没有显著性差异,注意误差线增大了，依然没有显著性差异,不能使用相机的自动白平衡,自动白平衡功能是相机根据照片总体色彩情况自动对每张照片进行白平衡校正。这会严重影响分析测量的准确性。显微镜照片用一两种染料染色，照片的色彩就应该是不平衡的，不能校正。,最好使用专业CCD拍摄,民用数码相机适用于拍摄日常生活中的照片，其自动曝光、自动白平衡功能会有效改善照片的直观效果。但对于显微镜照片，这些功能却会改变照片的原始面貌，而且它对每一张照片都使用了不同的拍摄条件。严重影响照片的分析测量结果。要想关
13、闭这些功能，往往要进行很复杂的设置。不能使用自动白平衡校正，但在拍摄前使用手动的白平衡校正背景色彩却是必须的。在拍摄照片时要对相机进行背景色彩校正，使得拍摄出的照片中空白的背景呈白色。这种较正将应用于所有拍摄的照片上，与自动白平衡较正不同。自动白平衡较正是对每一张照片都进行各自不同的色彩较正。,应当把照片存为无损压缩格式TIFF,特别是对于染色较浅的图片，保存为jpeg格式后会损失亮度细节，导致测量误差增大。,注意那些马赛克,总结拍摄注意事项：,调整显微镜光源亮度（电压9伏），足够白，足够亮。调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值最好能达到230以上。确认相机未使用自动白平衡功能。但要使用手
14、动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件（曝光及白平衡设置）一次拍摄完所有照片。保存照片为TIFF格式。相素不必太大。,3.2用Image-pro plus分析免疫组化图片,与photoshop不同，image-pro plus是一个图片分析和定量测量软件。IPP的功能不是用来美化图片，如果照片效果不好或分析结果不理想，要从切片处理与拍摄过程上找原因，而不应试图通过对图片的修饰与处理来解决问题。通过IPP的分析测量只应当准确地反映图片本身的真实测量数据。,开始使用IPP,IPP的程序界面是典型的windows风格。它包含了最常用的一些windows程序的一些
15、通用工具。进入IPP后的第一件事就是打开一幅待分析的图片。,将分析图片信息保存到数据库中,在程序中保存分析图片过程信息是保存实验原始数据的基本原则，必须遵守。将图片信息及图片分析过程及分析的信息存入IPP程序数据库是一种保存实验原始数据的操作。要注意对同一张图片进行同样的操作，由于一些手动的操作无法准确地重复，所以会出现两次同样的测量得到有差异的结果的情况。这也是保存测量结果的理由之一。,进行光密度值较正。,光密度值校正,前面曾经说过，电子照片上象素点的强度是以灰度值来定义的，对8bit的数字图象，最亮的白色其灰度值为255。最暗的黑色其灰度值为0。这正好与免疫组化染色的光密度值（OD）相反，
16、所以必须进行校正。定义灰度值大的白色为光密度值=0；定义灰度值最小的黑色光密度值为无穷大。为方便计算，常常把纯黑点的光密度值定为2.0或3.0。光密度值与灰度值的转换关系符合朗伯-比尔定律，因此是对数关系。光密度较正的另一个作用是扣除背景。照片的白色背景处的灰度值（光密度值）往往小于255，定义这个小于255的值为光密度零点实际上就是在扣背景。,正规的光密度值较正,理论上，应该制作已知量的标准样品（空白样、标准样系列、全黑样品）来进行光密度值较正。能得到更精确的分析结果。在实际操作中，标准样的制作十分麻烦，而且难于精确制作。实用性并不大。由于切片染色过程的影响因素太多，很难精确控制。所以最后的
17、分析测量结果依然属于半定量分析。,选择测量参数及分析指标,在分析免疫组化图象时,一般是测量选定的具有特定颜色的区域的面积与累积光密度(IOD)对免疫组化的显微照片,一般应分析它的平均光密度.即时IOD/area.根据图象的特点,要分别测量选择区域的IOD及area.对不同的组织照片，要使用不同的测量指标来进行比较。IPP可以测量多种几何尺寸及光密度指标，可以根据需要选择。在这个过程中，还可以设置数据过滤限制来去除干扰性的无效测量数据。,选取特定的待测对象(Objects),一般免疫组化样品中黄色的区域为阳性染色区域。在测量时应当测量这些黄色（棕黄色）区域的光密度值。不测量其他颜色部分的。因此首
18、要的任务就是把这些黄色的区域挑选出来。IPP可以根据图片上象素点的颜色来自动选取待测区域的。使用segmentation工具。对于色差小的图象，还可以使用手动的AOI工具定义待测区域。,用IPP选取特定颜色区域,选择特定颜色的区域是IPP最有特色的功能，按照特定的颜色特征选取图象中的特定区域，并计算这些区域的面积等几何尺寸与光密度数据，就是IPP分析图像工作的中心任务。Segmentation：适用于选取整张图片中具有特定颜色的所有区域。Irregular AOI:手动选择待测区域的工具。,Irregular AOI工具是手动工具。A:trace方式,手动或自动寻找区域边界,B：Magic w
19、and方式,定义一片特定灰度范围的区域。,Segmentation工具：完全按照颜色标准来选取多个相同颜色的区域,测量并导出统计结果数据,测量指标：,1.整张图片所有对象的IOD累加值（IOD SUM）2.分析区域的面积（area SUM）。这个区域可以是整张图片的面积，也可以是图片中某个特定区域的面积（与测量IOD所用的区域可能不同）。以Mean density(IOD/area)作为分析指标。每张照片得到一个准确的测量值。,记录宏操作,当一组照片的分析方法确定之后，下面的事情就是按照一个统一的程序一下一下地点鼠标进行死板的操作测量。很费时间。把这些死板的操作过程记录到一个宏操作中，以后只要
20、运行这个宏操作就可以一下子完成前面的所有操作。既省力又省时，还不会出错。当你有上面张照片需要进行测量的时候，使用宏操作是非常需要的。,3.3免疫组化照片测量结果的统计分析,一张免疫组化照片一般能得到一个IOD或Mean density值。一张组织切片一般应选择几个视野，拍摄三-十张照片。这样就有了数个IOD或Mean density值。一个实验对象要作数个组织切片。一组实验数据应包括数个实验切片。这个实验组就有了上百张照片，它们的IOD或Mean density值就构成了这个实验组的测量数据。可以用来进行统计分析。计算平均值与标准差，并与其他实验组或对照组进行t-检验等统计处理。可见在进行免疫组化照片的数字化分析时，一般是要拍摄很多张照片的。,结语,免疫组化图片的数字分析只是免疫组化实验的一部分，从处理切片到拍摄照片到最后进行数字分析，每一步都能影响最后的分析结果。本讲座的主题是介绍使用IPP软件来分析免疫组化图片的原理与方法。但对软件的具体操作步骤并未涉及，这是因为软件的操作比较繁琐，不亲自练习是不可能学会的。请参阅另外的指导教材及软件操作说明书。谢谢大家！,
