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1、转录后调控 microRNA的研究进展,分子遗传毒理实验室,Outlines,引言miRNA简介miRNA功能miRNA的研究方法miRNA and SNPs,基因组 转录组 蛋白组,The study of proteins expressed by genomesCompletion of the sequencing of the 1st draft of human genome indicates there are approximately 250,000 proteins in the human genomeOnly 2-5%of proteins in human geno
2、me have been identified,转 录 transcriptions,转录是指DNA指导的RNA合成。反应是以DNA为模板，在RNA聚合酶催化 下，以四种三磷酸核苷（NTP）即ATP、GTP、CTP及UTP为原 料，各种核苷酸之间的3、5磷酸二酯键相连进行的聚合反应。合成反应的方向为53。转录作用过程可以分为三个阶段：起始、延长及终止。,转录后的调控 regulations,转录作用产生出的 mRNA、tRNA、rRNA及小分子RNA的初级转录本全是前体RNA，而不是成熟的RNA，它们没有生物学活性，还要在酶的作用下，进行加工才能变为成熟的，有活性的RNA。调控方式：1.5末端
3、帽子的生成 2.3末端多聚A尾的生成 3.剪接作用 4.RNA编辑 5.甲基化修饰 6.microRNA,真核生物mRNA的一般结构 structures,一些基因组中蛋白编码部分与非编码部分的比例 生物 基因组长度 蛋白编码部分 非编码部分 基因数（kbp）（）（）真细菌 U.urelyticum 751 88 12 577 E.coli 4,639 84 16 4,000 M.leprae 3,268 73 27 2,584 古细菌 P.horikoshii 1,739 87 13 1,636 M.jannaschii 1,665 83 17 1,599 S.solfataricus 2,
4、992 77 23 2,610 真核生物 E.cuniculi 2,900 90 10 2,000 S.cerevisae 12,000 71 29 5,651 S.pombe 12,463 57 43 4,824 A.thaliana 115,410 29 71 25,500 C.elegans 97,000 27 73 18,424 D.melanogaster 180,000 13 87 13,600 H.sapiens 3,000,000 2 98 24,500,Coding RNA mRNA中的编码区（ORF),Non-coding RNA(ncRNA)除ORF以外的所有RNA品种和
5、片段,RNA的分类,ncRNA的数量,反转座子基因占基因组的45可变剪接占多外显子基因的4160 反向转录的占基因总数的1020最新估计的蛋白质基因数为24500个，占基因组的约1.5%,1998年109次香山会议中国科学家提出了RNA组计划,PNAS,December 19,2000 vol 97 no.26 14035-14037,RNomics的内涵,研究所有以RNA为终产物基因的时空表达谱和其生物学含义,欧美已启动以非编码RNA为主要目标的科学计划,欧盟的“RNA调控网络与健康和疾病”计划（RNA in health and disease“Ribonet”)美国国家人类基因研究所提出
6、“DNA 百科全书”计划(Encyclopedia of DNA elements)。中国的“调控RNA与人类疾病”973计划（屈良鹄）中国的“表观遗传学”973计划（裴钢）,(I)MicroRNA 简介,(1)长度为21nt左右核苷酸的内源性单链小分子RNA；(2)存在65nt左右的发夹结构前体；(3)基因座位在蛋白质基因间隔区；(4)其DNA序列在近源物种间高度保守。miRNA具有十分重要的调控功能，它们主要参与基因转录后水平的调控。能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解（植物中较为常见）或者抑制其翻译（动物中较为常见），从而影响了靶mRNA的表达。目前发现miRNA是一
7、个庞大的小分子调控RNA家族，广泛存在于各种动植物中，参与细胞增殖和分化、细胞凋亡、胚胎发育、形态建成以及疾病发生等一系列重要的生命过程。最近发现一系列与肿瘤发生相关的和人类病毒编码的miRNA，揭示miRNA在哺乳动物基因表达调控中具有重要作用。,microRNA的发现与发展,1993年，Dr.Victor R.Ambros 在线虫中发现了第一个miRNA lin4，与线虫的发育相关。Cell 75:843(1993)2001年，在线虫、果蝇和人cDNA文库中鉴定出96种与lin-4和let-7相似的长度约为2122nt的非编码小分子RNA。Science 294:853-864(2001)
8、microRNA首先在线虫中发现，9年后发现在多种生物中发挥基因调控作用，引起科学界广泛关注。Nature 420:732(2002)2002年，MicroRNA赢得Science杂志评选的十大科技突破第一名。Science 298:2296(2002)至2005年9月，在动物、植物、病毒中已鉴定出 miRNA 共 2909 个 http:/,计算机预测各种生物中miRNA基因的数目,计算机预测各种生物中miRNA靶基因的数目,miRNAs的重要特点:时序特异性与组织特异性,斑马鱼胚胎发育过程中90种miRNAs的表达谱(microarray)。miRNAs在受精后早期一直到卵裂开始(12hp
9、f)并不表达，受精后一天陆续表达，直到器官发生基本完成（96hpf)，大多数miRNAs 的表达达到最高峰。Science 309(5732):310-311,2005.,哺乳动物miRNAs的组织特异性Nat.Rev.Genet.5(7):522-31,2004.,(II)miRNA的表达及作用机制,Lin-4和let-7，由前体加工而来；成熟分子通过与各自靶基因lin-14和lin-41 mRNA 3UTR不完全反义互补,抑制lin-14和lin-41 mRNA的翻译。2001年，发现RNAi中siRNA的成熟酶Dicer也是lin-4和let-7形成所必需，提示RNAi和miRNA途径存
10、在交叉。2002年，发现拟南芥的miRNA-39与靶基因mRNAs完全互补，并导致mRNAs在互补区中间切断。提示miRNA功能只取决于它与靶mRNA 3UTR之间的互补程度。2003年，发现pre-rRNA(核糖体RNA)的形成过程中的一类RNase III类核酸酶Drosha负责 pri-miRNAs的加工。2003年，发现pre-miRNA的出核运输依赖于Exportin-5。2004年，发现pri-miRNAs末端有poly(A)尾；注入alpha amanitin(蝇蕈素)使人类细胞的pri-miRNAs水平剧减。提示miRNAs基因由RNA polymerase II转录。,1.m
11、iRNA基因在染色体上的分布,Molecular Cell 16(6),2004,Nat.Rev.Genet.5(7):522-31,2004.,2.miRNAs的发生和作用机制模型,2.miRNAs的发生和作用机制模型,(1)核内由RNA polymerase II转录pri-miRNAs，由Drosha加工为 pre-miRNAs；(2)pre-miRNAs由Exportin-5在Ran-GTP存在下转运出核；(3)细胞质中由Dicer剪切加工,后解链成熟为 miRNAs；(4)miRNAs与多种蛋白结合，形成RNA介导的沉默复合体(RISC)，作用于靶基mRNA的3UTR，如果miRNA
12、与3UTR存在完全互补，则导致mRNA切断降解，如果互补程度不高,则引起靶mRNA翻译抑制。,Nat.Rev.Genet.5(7):522-31,2004.,Cell 118(1),2004,3.RNase III的作用特点,第一种以线虫lin-4为代表，作用时与靶基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这种miRNA是目前发现最多的种类。第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA，这说明某些miRNA和siRNA一样参与了机体内一些特异性mRNA的剪切过程。第三种以let-7为代表，它具有以上两种
13、作用模式，当与靶基因完全互补结合时，直接靶向切割mRNA，如果蝇和Hela细胞中let-7直接介导RISC分裂切割靶mRNA；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA3端非翻译区不完全配对结合后，阻遏调节基因的翻译。第四种作用时与靶基因3非翻译区结合，进而影响mRNA的稳定性。,4.miRNA对靶基因的作用模式,(III)miRNA 的功能,随着越来越多miRNA的发现，除了lin-4和let-7在线虫的发育过程中的时序控制作用外，人们发现其它生物的多种多样的生物学现象和生理过程与之息息相关。特别是在胚胎发育、细胞分化，以及肿瘤发生方面尤为突出。,N
14、ature 426(6968):845-849,2003.Nature 430(7001):785-789,2004.,1.miRNAs在线虫嗅觉神经细胞分化过程中的作用,线虫嗅觉感受器(ASE)功能上都是不对称的，左侧和右侧分别感受不同的化学信号。功能的不对称是由于gcy-7只在左侧表达，而gcy-5只在右侧的表达.(gcy:guanylyl 环化酶受体)gcy不对称表达是由mir-273，lsy-6的不对称表达决定,Cell 121(7):1097-1108,2005.,miR-1Hand2 proteinHand2 mRNAProliferation/growth,time,Nature
15、 436(7048):214-220,2005.,2.miRNAs在小鼠心脏发育中的作用,miR-1在心脏形态建成中的作用示意图,发育晚期的小鼠心脏剖面图示过表达miR-1抑制正常的细胞增殖，使心肌壁薄而松,Neuron 46(3):363-367,2005.,3.1 miRNAs在胚胎干细胞发育分化中的作用模式图,proliferation,stem cell maintenance,differentiation,cell-type specific,miRNA在特异的时间表达，通过关闭特异蛋白质基因的表达，促进胚胎发育过程中一些事件的适时启动或关闭，保证正常的发育的进行。,3.2 miR
16、NA调控造血干细胞的分化,3种miRNA控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程,Science 303(5654):83-86,2004.,Northern杂交确定了miR-375在INS-1细胞的表达,miR-375在部分糖尿病模型NOD小鼠的异常高表达（阳性率60%）,反义2-O-甲基化寡核苷酸技术，特异性抑制 miR-375,不同浓度葡萄糖刺激经2-O-me-eGFP(375)处理后INS-1细胞胰岛素的分泌,Mtpn在 INS-1细胞、正常小鼠和NOD小鼠的差异表达,4.miRNA基因异常与肿瘤发生相关,人类52的miRNAs定位在染色体的脆性位点(FRAs),61个miRs和FRAs定位
17、在同一染色体带(红色星表示),红色箭头表示癌症病例中观察到的频率较高的FRAs.,PNAS 101(9):2999-3004,2004.,人核型图显示113个FRAs和186 miRs的位置关系,某些定位在染色体的脆性位点(FRAs)的miRNAs与肿瘤的发生有关,PNAS 101(9):2999-3004,2004.,Nature 435(7043):834-838,2005.,microarray显示肿瘤和正常组织中129种miRNA的表达水平,众多肿瘤miRNA整体表达水平下降,let-7与肺癌的关系,正常肺组织中let-7非常丰富；但肺癌中let-7表达水平普遍下降,人RAS是let-
18、7的靶基因。体外证实let-7抑制肺癌细胞系的增殖。肺癌组织中let-7表达不足，RAS过度表达，癌细胞增殖迅速.,Cell 120(5):635-647,2005.N.Engl.J.Med.352(23):2446-2448,2005.,Nature 435(7043):828-833,2005.,淋巴癌中miR-17-92簇的表达水平,转miR-17-92簇小鼠迅速诱发全身癌变，小鼠死亡加快,miR-17-92簇可能是一种新的癌基因,Nature Med 11(7):713-714,2005.,a：miRNA过度表达，抑制了抑癌基因的正常表达；b：miRNA表达过少或缺失，不能有效抑制癌基
19、因。,microRNAs通过对抑癌基因和/或癌基因的调控与肿瘤的发生相关,动物中miRNA的功能,(IV)miRNA的研究方法,miRNA的寻找技术 miRNA的检测技术 miRNA功能的研究技术,1.miRNA基因的寻找,克隆构建small RNA库，进行筛选 电脑模拟进行同源性搜索,MicroRNA基因确认的基本原则,A.能够通过与特定大小的总RNA样品杂交得到22nt的产物（即需要Northern杂交或引物延伸反应验证表达）B.所得的序列是从特定大小的（22nt）的小分子RNA库中克隆到的，并且必需与克隆的来源物种的基因组序列完全匹配 C.经过前体的二级结构预测，有发夹状的二级结构，并且
20、成熟的miRNA序列在发夹的一条臂上D.成熟的miRNA序列与预测的二级结构在不同物种间有保守性E.在Dicer突变的系统中，前体的积累增多 理想的：A+D+E 充分的：A+D 必要的：A+C or B+D,RNA 9:277-279,2003,克隆建库寻找新的miRNA基因,克隆到的miRNAs经过杂交验证其表达,Science 299，2003,电脑进行同源性比对寻找新的miRNA基因,2.miRNA的检测技术,芯片技术 Microarray 原位杂交 其它方法,应用芯片技术高通量的检测不同样品中多种miRNA的表达量的差异,NAR 33(2)，2005,NAR 33(2)，2005,Sc
21、ience 309(5732):310-311,2005.,原位杂交技术可以方便的检测miRNA的时空表达的差异,3.miRNA的功能的研究方法,高表达miRNA（转基因）在体内抑制miRNAs的表达,PLoS BIOLOGY 2(4):E98,2004,通过对miRNA的合成及功能行使过程所必需的蛋白复合物进行抑制从而降低miRNA的表达,在体内使miRNA的表达量下调,2-O-甲基修饰的与let7互补的寡核苷酸的导入可以使let7丧失功能，是由于这种带修饰的寡核苷酸的结合封闭了RISK复合体,Nature 423,2003,针对miRNA的前体的发夹结构设计siRNA降低miRNA的表达量
22、,.7(4):516-523,2003.,1.染色体重塑 2.DNA甲基化 3.转录 4.RNA 加工 5.RNA 稳定性 6.RNA 转运 7.RNA定位 8.翻译 9.蛋白质活性10.miRNA 稳定性,miRNAs可能参与各种基因表达过程的调控,(V)miRNA and SNPs,Functional analysis of SNPs,Promoter,Intron,Exon2,Exon1,5UTR,3UTR,Functions of different elements above:Promoter:Transcription5UTR:Transcription and transla
23、tionCoding region:Function and activity of enzymes;Translation efficiencyIntron:Alternative splicing 3UTR:mRNA Stability,mRNA location and translation,Association study of MDM2,234 bladder cancer cases,253 controls.5 out of 18 tagSNPs are positive(PC(P=0.01).,mRNA:,5UTR,Coding region,3UTR,microRNA t
24、arget prediction,microRNA prediction:Based on“seed sequence”Pic Tar（http:/)Targetscan（http:/),SNP TC,Putative microRNAsHas-mir-25/32/92/323/367,Targetscan（http:/),SNP modulate miR-25 binding on structure and stability,Predicted by Mfold,SNP modulate miR-32 binding on structure and stability,There ar
25、e also predicted microRNAs,which are not likely to be real regulators.Taking miR-92 for Example:Inadequate basepairing Low thermodynamic stability,Luciferase Assay to Confirm Our Predictions,Luciferase,REV3L,Poly A,T Allele,C Allele,3UTR,11bp Deletion of putative microRNA target,1,2,3,Bladder derive
26、d T24 cell:,*,*p0.05*P0.0001,11bp Deletion:Deletion of putative microRNA targets,Similar results from two another lines H1299 and SPC-A1,11bp Deletion:Deletion of putative microRNA targets,*p0.05*P0.001,Results:,C allele exhibited higher expression due to higher mRNA stability or translation efficiency.About 2-fold expression surge strongly suggested the existence of microRNA mediated interplay.,Thanks a lot!,
