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1、变性与复性,PCR原理,DNA的变性(denaturation)：,在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。,解链温度（融解温度，Tm）(melting temperature)：,使50%的DNA发生变性时的环境温度。DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。,增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。,DNA的复性（renaturation)：,在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealin
2、g)。,减色效应：变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。,1.常用的变性方法：,热变性,酸碱变性,化学试剂变性,2.影响复性的因素,序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快 DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 离子强度有利于复性 DNA浓度复性,Tm值的估算 20bp Tm=69.3+0.41(G+C)%Tm=81.5+16.6lgM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺%）,PCR技术总论,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。,聚合酶链式反应也可以当作一
3、项极其重要的酶促合成DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki（1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶，简称Taq DNA聚合酶。多次循环后的Taq
4、DNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。,PCR基本原理,PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理
5、，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。,PCR原理,Sample denaturatationPrimer annealingPrimer extension,PCR product,PCR反应曲线,标准的PCR反应体系,10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DN
6、A聚合酶 2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul,PCR反应五要素,引物（primer）酶（Taq DNA polymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）,引物,引物是PCR特异性反应的关键PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增,引物设计的原则（一）,引物长度：15-30bp，常用为20mer左右引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过Taq
7、DNA聚合酶的最适温度（74），不能保证PCR扩增产物的特异性引物扩增跨度：以500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段引物碱基：G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,引物设计的原则（二）,避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带引物 3端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好
8、处,引物设计的原则（三）,引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性引物量：每条引物的浓度0.1 1umol或10 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,引物设计的原则（四）,RT-PCR 引物设计特别注意：跨越两个外显子,酶及其浓度,目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100 ul时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,dNTP 的质量与浓度,dNTP的质量与浓度和 P
9、CR扩增效率有密切关系dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低,模板（靶基因，target gene）,模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一传统的DNA纯化方法通常采用
10、SDS和蛋白酶K 来消化处理标本SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸,模板（靶基因，target gene）,提取的核酸即可作为模板用于PCR反应一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA,Mg2+浓度,Mg2+对PCR扩增的特异性和产
11、量有显著的影响在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少,PCR反应条件的选择,PCR反应条件:温度时间循环次数,温度与时间的设置：,设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，
12、一般采用94变性，65左右退火与延伸,变性温度与时间：,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般9394lmin足以使模板DNA变性若低于93则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败,退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，5
13、5为选择最适退火温度的起点较为理想,引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：,Tm值（解链温度）=4（G+C）2（A+T）复性温度=Tm值-（510）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合,延伸温度与时间：,Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/S/酶分子 高于90时，DNA合成几乎不能进行,延伸温度与时间：,延伸温度：一般选择在7075之间常用温度为72过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
14、延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）34kb的靶序列需34min扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,循环次数,循环次数决定PCR扩增程度循环次数主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在3040次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,PCR反应特点,特异性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低,特异性强,关键：引物与模板的正确结合引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行
15、，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高,PCR反应的特异性决定因素,引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性,灵敏度高,PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平从 100 万个细胞中检出一个靶细胞在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个RFU(空斑形成单位)在细菌学中最小检出率为3个细菌,简便、快速,PCR反应用耐高温的 Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后
16、，即在DNA 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广,对标本的纯度要求低,不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测,热启动PCRTouch-down PCRRT-PCR兼并引物PCR巢氏PCR反向PCR不对称PCR原位PCR连接酶链反应RACE-PCRAFLP免疫-PCR(immuno-PCR)MSP甲基化特异PCR,1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不
17、同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组DNA结构功能的研究,PCR的类型,高浓度引物,低浓度引物,2)反向PCR(reverse PCR),用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,未知序列,未知序列,已知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,3）多重PCR（复合PCR）,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,4）LP-PCR（Labelled primers),
18、利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分,标记引物,观察,PCR产物,5）锚定PCR（anchored PCR,A-PCR）,锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,6）PCR固相分析法,检测探针信号,可用于基因芯片的制作,7）原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase
19、等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。,操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物,A.阳性对照,B.阴性对照,C.原位检测mRNA表达,8）,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,9)荧光定量 PCR（real-time PCR)通过荧光染料或荧
20、光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。,内掺式染料SYBR Green I序列特异性探针Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特异性探针 Amplifluor(Intergen),SYBR-Green I,实时荧光定量PCR仪,梯度PCR仪,普通PCR仪,什么是测序？,确定一条染色体片断上的碱基顺序。Sanger法：在PCR时加入荧光标记的复制终止剂，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相应于4种碱基）ddX的两个作用：可以当作正常碱基参与复制一旦链入
21、DNA中，其后就不能再继续连接电泳谁终止，碱基就是谁此方法获1974年的Nobel奖,Sanger第一步：加入复制终止剂,荧光检测探头,电泳，看谁跑得快,Sanger第二步：荧光检测,Shotgun测序,DNA的提取和纯化载体预备：DNA片断结合，从而能够在细菌中扩增。DNA片段的制备：将DNA用超声波切成能够测序的小片断转化培养：小片断和载体结合，植入细菌中进行扩增。提质粒：从细菌中提取出繁殖好的质粒电泳检测：检测质量的好坏测序：上测序仪测序,DNA整体,切成小段,小段和载体结合,结合后进行测序,Shotgun测序（2）,拼接错误：Repeat的存在,基因的概念,经典遗传学：遗传物质的传递规
22、律分子遗传学（1953，Watson&Crick）：基因的本质化学、结构 基因的功能基因表达、调控与性状表现 基因的变化基因突变等,经典遗传学中基因的概念 孟德尔称控制性状的因子为遗传因子 1909年约翰生提出了基因这个名词，取代孟德尔的遗传因子摩尔根等人对果蝇、玉米等的大量遗传研究，建立了以基因和染色体为主体的经典遗传学 经典遗传学认为：基因是遗传上最小的结构与功能单位，不能分割。是结构与功能的统一体,分子遗传学中基因的概念 基因的本质：（1）基因是特定长度和碱基序列的DNA片段（2）核苷酸序列中蕴藏着遗传信息：mRNA 多肽 DNA tRNA rRNA 调节基因,无翻译产物,翻 译,转 录
23、,无转录产物,结构基因,基因的功能类型,根据基因的原初功能可以将基因分为：(1)编码蛋白质的基因，即有翻译产物的基因。如结构蛋白、酶等结构基因和产生调节蛋白的调节基因。(2)没有翻译产物，不产生蛋白质的基因。转录产物RNA不翻译，如编码tRNA、rRNA。(3)不转录的DNA区段。如启动基因、操纵基因。启动基因是转录时RNA多聚酶与DNA结合的部位。操纵基因是阻遏蛋白、激活蛋白与DNA结合的部位。,基因的几种特殊形式,(1)重复基因：指在染色体组上存在多份拷贝的基因。重复基因往往是生命活动中最基本、最重要的功能相关的基因。最典型的重复基因是rRNA、tRNA和组蛋白基因等。(2)重叠基因：同一
24、段DNA序列，由于阅读框架(转录范围)不同，同时成为两个或两个以上基因的组成部分。因此基因在染色体上可能有重叠，甚至一个基因完全存在于另一个基因内部。,(3)断裂基因或隔裂基因,生物遗传和早期分子遗传认为基因是一个连续的、完整的结构。1977年Doel研究表明：卵清蛋白基因中间存在不表达的碱基序列，表明基因的DNA序列可能是不连续的。外显子：参加蛋白质编码的DNA片段；内含子：不参加蛋白质编码的DNA片段。真核生物基因可能是不同外显子的组合断裂基因。,(4)跳跃基因(jumping gene),又称为转座子(transposon)、转座因子、转位因子(transposable element)。生化遗传和早期分子遗传学还认为基因在染色体上的相对位置是固定的。后来发现某些DNA序列可以在染色体上转变位置。转座子转位的过程也是一个遗传重组过程；转座子在染色体上转位可能会引起插入位置基因功能丧失(突变)，再次转位离开插入点时便会发生基因功能的恢复。,
