《《RNA剪切加工》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《RNA剪切加工》PPT课件.ppt（139页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、第6章 RNA剪切加工,本次内容,1、转录后加工2、RNA剪切3、真核生物与原核生物mRNA比较,转录后加工,多数转录的初始产物无生物活性，在生物体内进行加工处理后才具有生物活性。转录后加工（post-transcriptional modification）（post-transcriptional processing）:是指将各种前体RNA分子加工转变成有功能的、成熟的各种RNA(mRNA、rRNA或tRNA等)的过程,加工的三种形式是：减少部分片段：如切除5端前导序列，3端尾巴和中部的内含子；增加部分片段：5加帽,3加ploy(A)和通过编辑加入一些碱基；修饰：对某些碱基进行甲基化等,
2、原核生物tRNA和rRNA加工真核生物tRNA和rRNA加工,1.1 tRNA 和 rRNA 的加工,1.1.1 tRNA加工 原核生物tRNA初始转录本有三种（1）多数为串连在一起的多顺反（polycistron）（2）少数为单顺反子（3）由tRNA和rRNA串连组成,原核生物tRNA和rRNA的加工,原核生物有两种类型的tRNA基因：1、具CCA序列 型tRNA CCA下游仍有一段序列，需在酶的作用下切除 2、无CCA序列 型tRNA 需在酶的作用下添加CCA序列,（1）RNaseP(由蛋白质和RNA组成的复合体)可切除E.coli前体tRNA 5的前导序列（41nt）。该酶不识别特殊的序
3、列，而是识别二级结构发夹所组成的tRNA。（2）去尾，形成3OH末端。由内切酶和外切酶共同参与。,（3）修饰。在前体的一些专一部位的碱基需要通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等的作用进行修饰成为特殊的碱基。,2.rRNA的加工 在E.coli中rRNA有7个转录单位,每个转录单位含有16S、23S、5S rRNA 及一个或几个tRNA。rRNA前体的加工由RNase 负责。,真核生物 tRNA 和 rRNA的加工,1.tRNA的加工 真核tRNA的基因与原核不同：1）真核的前体分子tRNA数目多、单顺反子、成簇排列、有基因间隔区。例如：爪蟾 tRNA基因数目200拷贝，酵母约有400个tR
4、NA基因，是一种重复序列；2）真核的前体分子 tRNA中含有内含子。其加工过程要剪接内含子，都要加CCA,酵母tRNA前体的体外剪接在未处理前电泳只出现一条带加入核酸内切酶出现两条带,tRNA半分子,tRNA半分子,真核tRNA内含子的切除和其他内含子的切除是不同的：1）没有交界序列，没有内部引导序列;2）切除是依赖于蛋白质的RNase;3）不是转酯反应；4）其剪切原则上是依赖于对tRNA共同的二级结构的识别。,2.真核rRNA的加工 真核生物的18S、5.8S和28S rRNA基因串联在一起形成一个转录本，初级转录本为45S前体，5S RNA与它们分开转录，这和原核的rRNA基因不同。1）真
5、核rRNA基因中没有内含子。2）在转录时或转录后有110个甲基化酶立即结合导转录本上：保持到rRNA加工成熟。18S RNA 结合39个甲基化酶（胞质中加上4个）28S RNA 结合74个甲基化酶 表明甲基化用于标明转录本的加工区域,1.2 前体mRNA的加工,1.2.1 原核前体mRNA的加工1.2.2 真核前体mRNA的加工,1.2.1 原核前体mRNA的加工 原核生物的mRNA一般不经过加工，由于转录和翻译偶联，中间没有加工的时间。少数情况：多顺反子mRNA先被内切酶切成较小的单位再作为翻译的模板。,1.2.2 真核mRNA的加工 真核mRNA的加工一般要经过四个步骤：1）mRNA的5端
6、加帽 2）mRNA的3端多聚腺苷酸化（加尾）3）切除内含子 4）修饰（对某些碱基进行甲基化）,mRNA的5加帽,成熟的真核生物并没有游离的5端，只有所谓的帽子结构，该结构是通过转录加工加上去的。mRNA的5加帽是一个多步加工过程，第一步是鸟苷转移酶（guanylyl transferase）将一个鸟苷酸加在5 RNA的前端，产生5-5对接的磷酸二酯键。第二步由鸟嘌呤甲基转移酶（quanine methyl transferase）将一个甲基基团加到嘌呤环的7位氮原子使5帽子鸟嘌呤转变为7-甲基鸟嘌呤。,1.2.2 真核mRNA的加工,存在于各类帽子中,存在于类帽子中,存在于类帽子中,真核生物的
7、帽子结构有三类Type 0 cap:m7GpppXTypecap:m7GpppXmTypecap:m7GpppXmYm,帽结构的形成与甲基化位点,CH3,CH3,mRNA 5加帽的功能主要表现在4个方面：1）保护mRNA5端不被降解 细胞内存在许多RNA酶（RNase），它们可攻击游离的RNA分子。RNA酶的降解从5端起始，当在mRNA的5端加上m7GpppG帽子后，带有3个连接磷酸的5帽可阻止RNase切割。2）为核糖体识别mRNA提供信号，提高翻译效率 真核生物mRNA必须通过5帽结合蛋白才能接触核糖体，起始翻译。缺少加帽的mRNA由于不能被5帽结合蛋白识别，其翻译效率比加帽的mRNA低二
8、十倍。,3）作为进出细胞核的识别标记。凡由Pol II转录的RNA均在5端加帽，包括snRNA，这是RNA分子进出细胞核的识别标记。大多数snRNA转录后在细胞核中接收5端单甲基m7G加帽，然后转移到细胞质与snRNP蛋白结合。在细胞质中snRNA 5帽需再修饰成为三甲基带帽结构m2，2，7G，随后重新返回细胞核参与mRNA的剪接加工。U6 snRNA由PolIII转录，在其5端保留的三磷酸基团无帽子结构，因而不能输出细胞核。某些突变型中被输送到细胞质中的snRNA由于不能合成三甲基带帽结构，不能返回细胞核。4）提高mRNA的剪接效率。5帽结合蛋白涉及第一个内含子剪接复合物的形成，直接影响mR
9、NA的剪接效率。,mRNA的加尾（3端多聚腺苷酸化）,几乎所有真核生物成熟的mRNA末端都有一串约250个腺嘌呤核苷酸尾巴。它们并非模板DNA编码，而是在转录完成后由poly(A)多聚酶合成。加尾位置不在转录物的最末端，而是在接近末端的内部位点。在切除mRNA 3末端的一段序列后，再加上多聚腺苷酸。真核生物mRNA poly(A)长度并非固定不变。细胞核中的poly(A)长度平均为21020 nt，细胞质poly(A)长度19020 nt。输送到细胞质中的mRNA其poly(A)可由RNase切短，但又能经细胞质poly（A）酶重新加长，保持有限的长度。细胞质中mRNA的poly(A)长度总的
10、趋势是逐渐变短，直到丢失大部分或全部poly（A），此时mRNA的寿命亦接近终点。,1.2.2 真核mRNA的加工,加尾信号新合成的mRNA的3-端含两个明显的加尾信号。第一个加尾信号位于poly(A)上游约1020个核苷酸处。其一致顺序为5AAUAAA3。该加尾信号中最多的变异发生在第二个碱基，其它位置的碱基代换将使Poly(A)加尾效率急剧下降。第二个加尾信号位于5AAUAAA3顺序下游约15-24 bp位置处，有一段富GU序列，紧随其后通常有一串富T的顺序：5-AAUAAA-24 bp-GTGTGTTGGAATTTTTTGTGT-3,CPSF:cleavage and polyadeny
11、lation specifity factor,CstF:cleavage stimulation factor,如果改变5AAUAAA3位置，加尾位点改变。缺失5AAUAAA3顺序，则不发生加尾。富GU序列和紧随其后的富T序列对正常的加尾不可缺一，如保留富GU顺序，除去富T顺序，加尾效率仅及对照的30%。如保留富T顺序，除去富GU顺序，加尾效率降至10%。同时缺失GU序列和富T序列，即使保留5AAUAAA3顺序也不能进行加尾。此外，GU/T序列与5AAUAAA3顺序的相对位置也很重要，如在5AAUAAA3顺序的下游插入16 bp，加尾效率只有正常的10%。如在GU序列和富T序列之间插入5 b
12、p，加尾效率丧失70%。,mRNA的多聚腺苷酸化mRNA的多聚腺苷酸化涉及两个步骤，首先必须在加尾的核苷酸位置切断RNA，然后在游离的3末端进行多聚腺苷酸化。有许多蛋白质参与poly(A)的加尾事件。1）参与Poly(A)加尾的蛋白质称为切割与多聚腺苷酸化专性因子（cleavage and polyadenylation specificity factor,CPSF），CPSF专一性与加尾信号5AAUAAA3结合。2）另一个蛋白即切割激发因子CstF（cleavage stimulation factor,CstF）特异附着在富GU区。因此CPSF和CstF实际结合的位置处于切割与多聚腺苷酸
13、化位点两侧。CPSF或CstF单个因子与信号顺序结合都是不稳定的，只有两者同时附着在两个信号位置才保持稳定状态。3）此外还有另两个蛋白对RNA的切割必不可少，它们分别是切割因子I和II（cleavage factors I and II，CFI和CFII），可与RNA结合。poly（A）多聚酶，CFI和CFII与RNA结合的位置处于两个加尾信号之间。虽然切割与加尾是两个性质不同的事件，但实际进行时几乎同时发生，实验设计很难将其分开。,严格说来切割信号和加尾信号是不相同的。前体mRNA切割的位置处于5AAUAAA3下游15-25 nt之间，由切割酶专一性识别。poly（A）多聚酶只是利用已产生的
14、3游离末端将腺苷酸逐个连接，加尾信号实际上是5AAUAAA3以及下游一段不能少于8 nt的顺序。一旦mRNA前体被切断之后，多聚腺苷酸化立即开始。多聚腺苷酸化可细分为两个阶段，首先依赖5AAUAAA3信号和与之结合的CPSF缓慢合成约10个核苷酸，然后依赖已合成的寡聚腺苷酸迅速在其末端加上200或更多个腺苷酸。,Cleavage of the 3 end of histone mRNA may require a small RNA Histone mRNAs are not polyadenylated;their 3 ends are generated by a cleavage rea
15、ction that depends on the structure of the mRNA.The cleavage reaction requires the SLBP to bind to a stem-loop structure,and the U7 snRNA to pair with an adjacent single-stranded region.,poly（A）的功能,增加mRNA的稳定性 将携带或缺少poly（A）的球蛋白mRNA注入到蛙卵中，结果发现，在6小时后缺少poly（A）的球蛋白mRNA不再进行翻译，而携带poly（A）的处理仍然正常合成球蛋白。最简单的解释
16、是，poly（A）有助于增加mRNA的稳定性提高mRNA翻译效率 mRNA的翻译需要PAB I（poly（A）binding protein I，poly（A）结合蛋白I）的蛋白参与，它们与poly（A）的结合可提高mRNA的翻译效率。如果在mRNA样品中加入过量的poly（A），可急剧降低蛋白质合成的数量。原因在于大量poly（A）与PAB I因子竟争性结合，使mRNA缺少必需的PAB I，因而不能有效翻译。此外适当延长poly（A）核苷酸数目可控制mRNA的翻译。活细胞中很少mRNA的poly（A）长度少于30 nt，低于这一长度mRNA不能翻译。poly（A）可影响mRNA前体最后一个内
17、含子的剪切，缺少poly（A）使剪接效率降低5-10倍。,播放动画:1、mRNA Splicing 2、Life Cycle of an mRNA,本次内容,1、转录后加工2、RNA剪切3、真核生物与原核生物mRNA比较,1、核酶2、RNA中的内含子3、RNA的剪切4、RNA的编辑和修饰,RNA的剪接,转录后加工是产生各种成熟RNA分子的重要过程 在真核生物的mRNA前体中，将内含子（intron）去除，而把外显子（exon）连接起来形成成熟RNA分子的过程，称为RNA剪接（RNA splicing）。,RNA加工过程及其生理功能,1.核酶(ribozyme),核酶(ribozyme)有的译为
18、核糖拟酶，核酶等。核酶是TCech和SAltman(1981年)在研究四膜虫rRNA时发现的，1982年TCech由核糖核酸(ribonucleic acid)和酶(enzyme)这两个词“重组”成一个新的词：“ribozyme”。它是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的、具有催化功能的一类物质。,一、核酶,核酶和酶的区别，主要在：一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的RNA；核酶既是催化剂又是底物，随着反应的进行，本身也消失了。而酶却不同，仅催化反应，反应前后其本身的质和量都不发生改变。,核酶催化的反应分为两类：自体催化包括：第一组内含子的自我剪接；第二组内含子的自我剪切；
19、植物类病毒和拟病毒的自我剪切。半自体催化包括：核mRNA内含子的剪切；锥虫SLRNA的反式拼接；tRNA 5加工（不属于转酯反应内含子的剪接，但也是核酶的活性之一）除核酶之外，核酸酶和由内含子本身编码的成熟酶也参与某些内含子的剪切，如真核tRNA内含子和酵母cob基因的内含子的2的剪接。,2.RNA中的内含子,部分人类基因中，内含子序列所占比重的分析,内含子去除、RNA的剪接基本方式：在高等真核生物，核RNA内含子的去除由剪接装置(splicing apparatus)完成，在外显子和内含子交界处和内含子内部有可供识别的特异序列，剪接装置由多种蛋白质和核蛋白组成；有两类内含子的去除属自剪接，具
20、有中部核心结构，形成特定的二级结构，RNA具有催化剪接的作用；酵母tRNA的剪接需要蛋白质酶的参与，该酶与tRNA后加工过程中的酶有相似之处。除tRNA的剪接之外，其他RNA的剪接尽管参与反应的要素不同，但都属于转酯反应。,2.1 内含子的边界顺序及类型,内含子的边界顺序由保守的基序组成,比较大量的真核生物mRNA内含子发现，它们的两侧边界均有一对保守顺序，即5-端为GU，3-端为AG，这类称为GUAG的内含子均以相同方式剪切。,在不同的真核生物中，内含子的一致顺序有不少变化，动物中典型的剪接位置一致顺序组成为：5AGGUAAGU-YNYURAY-Y10-20-YAG3 其中Y为U或C，N为任
21、何核苷酸，箭头所指为外显子与内含子的交界。5端剪接位称供体位（donor site），3端剪接位称受体位（acceptor site）。仅仅GUAG边界顺序并不能保证内含子的正确剪切，因为在内含子中有不少相同的GUAG顺序。内含子中还有另一段识别剪接边界必不可少的序列称为分枝点，位于3-端剪接位的上游，具有特征性组成：-YNCURAY-，Y表示嘧啶（U或C），R表示嘌呤（A或G），A是剪接时参与形成分枝的特别位点。紧接在分枝点的下游有一段多嘧啶序列，也是参与剪接事件蛋白接合的位置。酵母中分枝点序列为5UACUAAC3，位于3剪接位上游18到140 bp之间，其作用不同于高等真核生物。,2.2
22、内含子的类型,3、RNA的剪切,3.1 mRNA前体的剪切 3.1.1 核内小RNA 3.1.2 RNA的剪切过程3.2 类内含子剪切3.3 类内含子剪切3.4 顺式剪切与反式剪切,3.1.1 核内小RNA 3.1.2 RNA的剪切过程,3.1 mRNA前体的剪切,3.1.1 剪接要求snRNAs的参与,在高等生物中都含有很多不连接的小分子RNA片段，限制在核内的称为小分子核内RNA(small nuclear RNAs，snRNAs)。在细胞质的称为小分子胞质内RNA（small cytoplasmic RNAs，scRNA)在自然状态下，它们以核糖核蛋白（RNP）的形式存在。剪接装置中的s
23、nRNPs和大量的附加蛋白，常称为剪接因子。,在剪接过程中有5种snRNAs(small nuclear RNAs)参加，它们是U1、U2、U5、U4、和U6。5种 snRNAs+proteinsThe snRNPs splicesome,U1 snRNA 碱基互补配对方式识别mRNA前体5剪切点,U2辅助因子 与3剪切点上游的富嘧啶区结合识别mRNA前体3剪切点,U2 snRNP 与分支点结合,U2 snRNA,剪切前体,60S剪切体spliceosome,U4、U5、U6 snRNP三聚体,U1 snRNA自我配对形成了多个茎环结构，从而构成了不同的功能区。Sm结合位点是和其他snRNP相
24、互作用的区域。其5端有一保守序列：3-CAUUCAU-5 这一序列可与核mRNA内含子5端的边界序列互补结合，这对于剪接反应是很重要的。,U2与分枝点配对；U6与mRNA 5端配对U5 使两个外显子靠拢,U6 snRNA既能与U4配对也能与U2配对,3.1.2 核mRNA的剪接,核mRNA的剪接过程和类内含子十分相似，根本区别是：核mRNA前体本身不能形成二级结构，必需依赖于snRNP(U1,U2,U4,U5和U6)的帮助才能形成剪接体，进行自我剪接。结构特点：边界顺序 完全符合GU-AG法则 含分枝点序列 内含子5端保守序列（5GUAAGUA3）和U1snRNA的5端保守序列 3CAUUCA
25、U5互补,剪接机制,在剪接体的作用下通过转酯反应而完成形成一个套索（lariat）结构和剪接了的外显子snRNP的剪接功能和反应步骤是：U1结合形成E complex（下页图）A complex(U2结合)B1 complex B2 complexC1complex C2 complex,The first complex formed during splicing is the E(early presplicing)complex,which contains U1 snRNP,the splicing factor U2AF,and members of a family called
26、 SR proteins,which comprise an important group of splicing factors and regulators.,E complex+U2 A complex(U2与分枝位结合)B1 complex(U5/U4/U6三聚体结合，U5结合在外显子5端，U6与U2结合)B2 complex(释放出U1,U5从外显子向内含子移动，U6结合在5剪接位点)C1 complex(释放出U4,U6/U4催化转酯反应，U5结合在外显子3剪接位点.5位点被切开，形成套索)C2 complex(U2/U5/U6仍结合在套索上。3位点被切开，外显子被连接)释放出剪
27、接了的RNA,套索脱分枝成线状。,播放动画mRNA splicing.mov,3.2 类内含子及其剪接,1.发现 Cech et al.1981 研究四膜虫（Tetrahymena thermophila）35S的前体 rRNA（含有413nt 的内含子）在体外能够进行自我剪接,2.分布 类内含子常分布于低等真核生物的细胞器中，如四膜虫的rRNA；大部分真菌如酵母的mtDNA；植物叶绿体基因的内含子；T4噬菌体的3个基因中也存在类内含子3.结构特点 边界序列为5UG3 内含子中有中部核心结构(central core stucture)内部引导序列（internal guide sequene
28、ce,IGS）,类内含子有一个共同的二级结构，共9个配对区（P1P9），其中P4和P7是类内含子中共有的保守序列。P4由P和Q序列形成，长10nt，配对碱基67对。P7由R和S序列构成，长12nt，5对碱基配对。P3,P4,P6和P7是核心结构，是可以执行催化的最小区域。其他的配对区在不同的内含子中是不同的。,IGS,内部引导序列（internal guide sequenece,IGS）：1982年由Davies提出，由6个nt组成，GGAGGG（四膜虫）。内含子中可与外显子配对的序列称为内部引导区。最初认为IGS的作用是通过和两个外显子近侧区配对，使外显子并在一起，现在认为其作用是决定剪接
29、的专一性。,类内含子的剪接机制 自剪接（self-splicing）反应，通过3次连续的转酯反应完成。只是磷酸酯键的直接转移，没有水解，不需能量。,特点：由于内含子自身形成特定的二级三级结构，从而产生适于剪接反应的空间构象和活性位点，相当于传统酶的激活位点，即G苷酸结合位点和底物结合位点，后者依赖于IGS的配对来确定。G的参与完成剪接反应。即剪接反应完全由内含子自身完成。,3.3 类内含子的剪接,类内含子的剪接和类内含子不同，而和核mRNA内含子的剪切有些相似。分布：在酵母mtRNA,细胞色素氧化酶的a亚基、b亚基，玉米mtRNA、tRNA以及真核mRNA前体中。边界序列为5GUGCG-YnA
30、G,符合GTAG法则,类内含子的二级结构,二级结构：形成6个茎环结构，使两个并列的功能区靠近。功能区5和功能区6被两个碱基隔开。功能区6含有1个不配对A残基，其上带有2OH,发动第一次转酯反应。,与前所叙的核基因mRNA的剪接过程相比，类内含子的最大特定是不需要其他成分的参与，RNA分子本身能形成剪接所需的空间结构和催化活性区域。在核基因mRNA的剪接过程中，需要多种成分特别是snRNA与RNA前体共同作用才能形成剪接所需的空间结构，产生具催化功能的区域。,类内含子的剪接机制,DNA(promoter)RNA(splicing)Proteins,3.4 顺式剪切与反式剪接,3.4.1 顺式剪接
31、（cis-splicing）内含子的剪接一般都是发生在同一个基因内，切除内含子，相邻的外显子彼此连接，称为顺式剪接。对很多基因而言，RNA剪接是一个不变的加工过程。基因转录时所有细胞中产生同样的成熟转录本及单种产物。这称为组成型剪接(constructive splicing)。其他一些基因，RNA剪接可以作为基因调节的机制，也就是说在两种组织中同一基因表达不同，尽管它以相同的方式和速度转录。这样的调节以两种方式发生。,第一种情况:加工或去除调节(processing ordiscard regulation)，初始转录本在一些组织中加工，在其他组织中不剪接。在有些低等真核生物中(如海胆)，这
32、是主要调节机制。大部分基因在大部分组织中转录，由RNA加工调节来决定那些基因被翻译。在果蝇中，一个类似的机制用来控制P因子转座酶(参阅)的合成，在这种情况下虽然只有一个内含子未被剪接，但却限制了P因子转座只发生在生殖细胞中。转座酶基因包含三个内含子，在生殖细胞中产生成熟的编码转座酶的转录本，然而在其他组织中，第三个含终止密码子的内含子被保留，使转座酶蛋白截短，从而阻止体细胞中P因子的转座。内源性基因也用同样的策略，如哺乳动物GABAA受体E亚基的mRNA前体除了脑以外其他组织都不剪接。,第二种情况:差别或选择性剪接(differential alternative splicing)基本转录体
33、通过选择使用外显子以不同方式加工 相关成熟转录体家族产生不同基因产物，称为剪接变异体(splicevariants)或剪接异构体(spliceisoforms)。,可变剪接产生多种RNA,选择性剪接以多种方式进行：1）利用不同的外显子 由于不同细胞类型有着不同修饰的反式因子，导致利用不同的外显子。例如动物细胞的原肌球蛋白(atropomyosin)基因有13个外显子。,2)两个相互排斥的外显子的剪接 有两类外显子对，每对之中只有一个成员能剪接到成熟的mRNA中，看来像是相互排斥似的。降钙素(calcitonin)和降钙素基因相关肽(calcitoningenerelatedpeptide，CG
34、RP)分别利用相邻的两个外显子，得到的两种产物分别为甲状腺和神经元细胞中所特有。,(3)半个起始位点，多个加poly(A)位点 一些真核病毒转录物存在多至5个这样的位点(Tsurshital988)。对于一个有两个加poly(A)位点的转录物，大多数细胞类型通过利用内侧的位点产生分泌型的蛋白，一些分化的细胞类型犀其产物是膜蛋白的转录物，则利用外侧的位点产生具有膜锚序列的膜结合蛋白。还是用降钙素和CGRP的例子，前者利用内侧的加poly(A)位点，后者则利用外侧的。可能存在某种细胞类型特异的反式激活因子提高外侧位点的利用效率。,(4)多个5剪接位点竞争同一3剪接位点 有一些基因含有多个5剪接位点
35、，它们的选择依赖于5剪接位点的强度(高度适配者强)、与3剪接位点的接近程度、空间限制等因素之间的平衡。在大多数细胞类型中将选择上游的5剪接位点，而使处于下游的5剪接位点无效，主要是因为后者与分叉点的距离一般太近而不利于建立剪接体之故(Noble l988)。也有的分别利用不同的5剪接位点，得到不同的产物。,(5)内含子保留和框式外显子 有的情况下，一个内含子不被剪接而保留下来，如果维持可读框架，便是一个多肽片段的插入；如果移格，便会产生功能不同的产物或者关掉基因的表达。所谓盒式外显子是指那些与其他邻近的外显子的剪接无关而独立剪接的外显子。当几个盒式外显子存在于同一个转录物中，其产物会产生高度的
36、趋异，如一个基因含有5个盒式外显子，再加上一对相互排斥的外显子，在理论上可以生64种同工型多肽。真核基因存在5个以上的外显子是常有的，甚至多达37个外显子，由此产生蛋白质的多样性是十分丰富的。,肌钙蛋白T有13个外显子，编码259个氨基酸残基，然而此蛋白的长度在体内不同部位的肌肉中是不同的。有11个外显子(黑框)是所有mRNA都有的；外显子48(白框)则可自由组合(4、6、8，4、7、8，7、8等等)，共有32种可能性；外显子16和17(灰框)是相互排斥的，两者只能有一个出现在成熟的蛋白质中。这样，总共就有64种可能的mRNA。,(6)非剪接位点的序列参与调节 一些真核生物的病毒RNA其初级转
37、录物即使有正确的功能剪接位点，有时也会有一部分甚至大部分不发生剪接(ArrigoandBeemon1988)。这是由于其内含子中存在一种负调节元件使剪接无效，也有的基因在外显子中存在一些促进和抑制剪接的序列。,返回,返回,返回,顺式剪接机理：,U群snRNA+多肽snRNPU群snRNA是一群丰富的小分子RNA,其序列进化上相对保守，但通过转录后碱基修饰会导致其二级结构的改变，因而构成不同功能的snRNP,使之识别和竞争不同的剪接位点。,剪接体/拼接体的装配：1、U1 snRNP与5剪接位点结合2、U2 snRNP与分枝点结合3、U4/U6和U5snRNP结合上4、最后形成剪接体，U5既与5剪
38、接位点也与3剪接位点结合。,参加剪接反应的蛋白质因子有两种类型：一类结合在UsnRNA上形成snRNP复合物，例如Sm蛋白，共同地与U1、U2、U5 snRNA紧密结合；U1 snRNP中有3种而U5snRNP有7种蛋白紧密地与之特异结合。另外，还有一些蛋白暂时地与snRNP组分相互作用并起着特殊的作用，它们是一些RNA依赖的ATPase和螺旋酶，如酵母的PRP24促进U4U6复合物的形成，PRP4通过蛋白蛋白相互作用结合U4U6snRNP和U5snRNP形成上述的三元snRNP复合物；PRP8与U5snRNP结合并和3剪接位点相互作用。这些蛋白的一部分基序结合到RNA上，另一部分结合到蛋白质
39、上形成蛋白“桥”，介导RNA-RNA相互作用，以及剪接体构象改变，通过决定构象改变的计时来影响剪接。,另一类是一些结构相关进化上保守的蛋白质因子，称之为SR(SRP)家族。已发现此家族的成员有SRP20、SRP30a、(SF2ASF)、SRP30b(PR264SC35)、SRP40、SRP55、SRP7075(数字表示分子质量，kDa)，这些蛋白的N端有一个共同的基序(RRM或RBD)识别和结合RNA；其C端长度变化，由交替的丝氨酸和精氨酸残基组成的结构域可能和结合特异性有关。这些蛋白在剪接过程早期起着帮助前mRNA投入剪接，后期护送snRNP加入剪接体，在剪接的两步反应中一直与剪接体缔合。由
40、于这些蛋白因子的表达量是组织特异的，而它们存在的量和剪接位点的选择又相关，因而不同的SRP蛋白对不同的剪接位点的优先利用表现为一种组织特异性。SRP蛋白在离体剪接中都表现出活性的互补，但不同的SRP蛋白有其保守性，又说明每种SRP蛋白应有其不同的功能。,3.4.2 反式剪接(transsplicing)前面讨论的剪接过程都是发生在一个RNA分子内部，即通过剪接将一个RNA分子内的内含子剪掉，使外显子连接在一起顺式剪接(cis-splicing)。但也有另外一种情况，即不同基因的外显子剪接后相互连接，此称为反式剪接（trans-splicing）已发现，在锥虫、线虫以及植物的叶绿体中发生两个RN
41、A分子之间的剪接，即反式剪接。,反式剪接是以两种不同来源的RNA前体分子作为底物。反式剪接的5端外显子称为剪接前导RNA(spliced leader RNA，SL RNA)。经过剪接在成熟的mRNA非翻译部分5端剪接上一小段称为“剪接前导序列(spliced leader，SL)”或“小外显子(mini-exon)”的RNA片段。这些片段本来并不存在于相应的编码基因前面，而是由其他DNA链转录而来。已发现的各种SL RNA有一些共同的特点：都折叠成一种相同的二级结构，此结构有3个茎环(stem-loop)和一个单链区，此单链区类似于U1的Sm结合位点。因此，SL RNAs存在和snRNPs相
42、似的形式。,4 RNA的编辑和修饰,4.1 RNA编辑（RNA editing）某些RNA，特别是mRNA的一种加工方式，它导致了DNA所编码的遗传信息的改变，因为经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。单碱基突变 尿苷酸的缺失和添加,载脂蛋白B基因有29个外显子,第2153位密码子 CAA 编码谷氨酰胺,CAA,UAA,肝中剪切的mRNA编码4563个氨基酸残基的蛋白质,肠mRNA因UAA密码子在2153位密码子终止合成,4.2 RNA修饰 某些RNA，特别是前体rRNA和tRNA还可能有异性化学修饰。,本次内容,1、转录后加工2、RNA剪切3、真核生物与原核生物mRNA比较,1
43、.半衰期短。原核生物中，mRNA的转录和翻译是在同一个细胞空间里同步进行的，蛋白质合成往往在mRNA刚开始转录时就被引发了。也即转录和翻译相偶联。,3.1 原核生物mRNA的特征,2.原核细胞的mRNA（包括病毒）有时可以编码几个多肽，而真核细胞的mRNA最多只能编码一个多肽。我们把只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA（monocistronic mRNA），把编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）。,几乎所有mRNA都可以被分成3部分：编码区和位于AUG之前的5端上游非编码区以及位于终止密码子之后不翻译的3端下游非编码区。,mRNA的次
44、级结构可能控制翻译的起始,一个顺反子的翻译有时完全取决于它前面顺反子的翻译，因为只有第一个翻译起始位点是暴露的，在这个顺反子翻译产生多肽的过程中，核糖体的运动破坏了后续顺反子的二级结构，使起始位点较容易与核糖体相结合形成起复合物,3.原核生物mRNA的5端无帽子结构，3端没有或只有较短的多聚（A）结构。原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SD序列（Shine Dalgarno sequence）的保守区，因为该序列与16S-rRNA 3端反向互补，所以被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用。,4.原核生物常以AUG（有时GUG，甚至UUG）作为起始密码子，而真核生物几乎
45、永远以AUG作为起始密码子。,3.2 真核生物mRNA的特征,编码功能蛋白的真核基因都通过RNA聚合酶II进行转录，几乎都是单顺反子，其长度在几百到几千个核苷酸之间。一个完整的基因，不但包括编码区（coding region），还包括5 和3 端长度不等的特异性序列，它们虽然不编码氨基酸，却在基因表达的过程中起着重要作用。,“基因”的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列！A gene can be defined as following:The entire nucleic acid sequence that is necessary for the synt
46、hesis of a functional polypeptide or RNA molecule.,1.真核生物mRNA的5端存在“帽子”结构。真核生物基因转录一般从嘌呤（主要是A，也可能是G）起始，其5端大都经过修饰，第一个核苷酸保留了5端的三磷酸基团。,2.绝大多数真核生物mRNA具有多聚(A)尾巴。除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3末端都有多聚（A）序列，其长度因mRNA种类不同而变化，一般为40-200个左右。,真核基因的3 末端转录终止位点上游1530bp处的保守序列AAUAAA对于初级转录产物的准确切割及加多聚（A）是必需的。,多聚(A)是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式，它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。mRNA刚从细胞核进入细胞质时，其多聚(A)尾巴一般比较长，随着mRNA在细胞质内逗留时间延长，多聚(A)逐渐变短消失，mRNA进入降解过程。,播放动画:1、transcription prokaryotic&eukaryotic,课后复习题一、名词解释 核酶 RNA剪接 顺式剪接 反式剪接 组成型剪接 可变剪接 RNA编辑二、简答题 真核生物和原核生物mRNA之间的异同。简述真核hnRNA、mRNA的加工成熟过程.,谢谢大家。,
