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1、2023/7/10,1,第三章,农业基因工程,2023/7/10,2,第一节 基因工程的物质基础 第二节 基因工程操作程序第三节 转基因植物与植物改良第四节 转基因动物及应用,2023/7/10,3,第一节 基因工程的物质基础,一、基因工程的诞生二、基因工程的含义三、基因工程工具酶 四、基因工程载体,2023/7/10,4,一、基因工程的诞生,理论基础：三大发现20C40S，基因载体是DNA 遗传物质基础问题；20C50S，DNA双螺旋结构和半保留复制 基因的自我复制和传递问题；20C50-60S，中心法则和操纵子学说 遗传信息的流向和表达问题。,2023/7/10,5,技术基础：三大发明,工
2、具酶载体反转录酶,2023/7/10,6,二、基因工程的含义,基因工程（gene engineering）指将某种生物的基因经过体外修饰或直接导入另一种生物细胞或个体，从而改变生物的遗传性状或创造新的生物类型。这种人为在遗传物质的分子水平上改造和设计生物的结构和功能的生物技术，就是所谓的基因工程，也称DNA重组技术。,2023/7/10,7,基因工程的优势,生物技术的核心技术基因交换不受生物物种亲缘关系的限制。生物基因可在人、动物、植物和微生物四大系统间进行交换，人类可以构思并创造出世界上前所未有的生物新类型。,2023/7/10,8,三、基因工程工具酶,基因工程操作需要在分子水平上对DNA分
3、子进行剪接、重组和转运，需要借助一些工具。1、限制性内切酶 2、DNA连接酶 3、DNA聚合酶 4、反转录酶,2023/7/10,9,1、限制性内切酶,限制性内切酶就是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶。1970，Smith和Wilcox，Hind 1972，Boyer，EcoR300种微生物500种限制性内切酶基因体外分析研究人工重组。,2023/7/10,10,2、DNA连接酶,作用：能把不同DNA片段结合到一起。1967，首次发现，但活性不高1970，Khorana，T4 DNA连接酶，高活性,2023/7/10,11,3、DNA聚合酶,DNA聚
4、合酶能以单链DNA为模板合成互补的DNA链。TaqDNA聚合酶：耐高温，70以上合成DNA。这为体外人工大量复制目标DNA片段提供了极大的方便。,2023/7/10,12,4、反转录酶,反转录酶也是一种DNA聚合酶，但它不是以DNA为模板，而是以mRNA为模板进行DNA的合成。由于这一过程正好与mRNA的转录过程相反，故而称为反转录酶。反转录酶使得基因工程学家们能通过细胞质中的mRNA来认识和分离目标基因。1970，Baltimore和Temin，各自发现。,2023/7/10,13,四、基因工程载体,载体：将外源DNA携带进入宿主细胞的运载工具。基因载体的实质：一类小型的DNA分子。其作用：
5、将目的基因转移到受体细胞，并使其在受体细胞中得到转录和表达。1946，Lederberg，细菌F因子1973，Cohen，首次将质粒作为基因载体。,2023/7/10,14,理想载体的特点,自我复制能力；大小要适度，能从外部进入细胞；稳定安全可靠，不易降解；要有遗传标记和选择性的识别标记。,2023/7/10,15,载体的分类,（1）根据克隆外源DNA的方式：插入型载体：指在载体的克隆位点上用限制性内切酶酶切后，将外源DNA插入，再用连接酶连接。绝大多数的载体都属于此类。置换型载体：指载体的某一片段用限制性内切酶切除，代之以外源DNA片段。噬菌体属于此类。（2）根据载体的用途：克隆载体：指克隆
6、了外源DNA后，转入宿主细胞中进行增殖，使克隆的DNA片段在数量上大大扩增。表达载体：将外源DNA在宿主细胞中表达产生蛋白质。,2023/7/10,16,常用基因载体,质粒噬菌体病毒转座子人工载体,2023/7/10,17,质粒,质粒是独立与染色体之外的能自主复制的双链环状DNA分子，也叫“核外遗传体或核外染色体”。质粒所携带外源DNA片段比较小（10Kb）。Ti质粒：高等植物基因工程常用。,2023/7/10,18,噬菌体,噬菌体所能负载的DNA片段较大。噬菌体：双链线性DNA。原核生物常用。,2023/7/10,19,病毒,SV40（猿猴病毒），双链环状DNA广泛应用：微生物和哺乳动物体细
7、胞基因工程。,2023/7/10,20,转座子,能在基因组中频繁转移，主要成分也都是不同的DNA。,2023/7/10,21,人工载体,YAC（酵母人工染色体）Yeast artificial chromosomeBAC（细菌人工染色体）Bacterial artificial chromosomeMAC（哺乳动物人工染色体）Mammalian artificial chromosome,2023/7/10,22,第二节 基因工程操作程序,一般包括5个步骤：一、目的基因的获得；二、目的基因与基因载体的体外重组；三、重组DNA分子的转化；四、转化细胞的筛选；五、目的基因表达的检测。,2023/7
8、/10,23,基因转化操作过程,2023/7/10,24,一、目的基因的获得,目的基因：在基因工程操作中所需要的某些DNA分子的片段。它含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。目的基因获得方法：人工合成法、cDNA法、PCR法、基因文库筛选法等。,2023/7/10,25,1、人工合成法,核苷酸 酶 目的基因注：该法合成目的基因较小。,2023/7/10,26,2、cDNA法,特定基因 分离mRNA反转录酶 G、C、T、A单链cDNA目的基因,2023/7/10,27,3、PCR法,前提：已知序列方法：多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）程序：通过DNA模
9、板高温变性、模板与引物的低温退火及引物的中温延伸3个阶段的多次循环，就可以扩增得到目的DNA序列。,2023/7/10,28,4、基因文库筛选法,基因文库就是保存某个物种完整基因组遗传信息的不同DNA片段的总称。前提：核酸序列未知程序：蛋白质纯化测定部分氨基酸的顺序合成DNA探针从基因文库中筛选目的基因。原理：中心法则,2023/7/10,29,二、体外重组,载体+目的基因 重组DNA（基因工程最重要的环节）1、选择适合的基因载体2、载体酶切（限制内切酶）3、目的基因与载体DNA 连接（DNA连接酶）4、重组DNA分子获得,2023/7/10,30,三、重组DNA分子的转化,将重组的DNA杂合
10、分子，向选定的生物受体细胞（或叫宿主细胞、寄主细胞）中转移，让重组的DNA杂合子在受体细胞中自主复制、转录、翻译得以表达。常用大肠杆菌作为宿主细胞。,2023/7/10,31,常用转化方法,（1）Ti质粒介导法（2）电击法（3）微注射法（4）基因枪法,2023/7/10,32,（1）Ti质粒介导法,基因载体：农杆菌Ti质粒。优点：转化再生率高最常用的方法。,2023/7/10,33,（2）电击法,瞬间电脉冲刺激细胞膜小孔 重组DNA分子进入细胞的通道。电脉冲强度孔径大小和数量 DNA进入细胞的速度和难易。,2023/7/10,34,（3）微注射法,毛细管针显微操作注射外源基因细胞。优点：准确性
11、高缺点：技术性高，处理效率低,2023/7/10,35,（4）基因枪法,特制“基因枪”外源基因+金属微粒=“微型弹”射入受体细胞。优点：批量处理，效率高；缺点：装置昂贵。,2023/7/10,36,提高转化率的方法,（1）多聚氨基酸法（2）磷酸钙DNA共沉淀法（3）脂质体法,2023/7/10,37,（1）多聚氨基酸法,多聚氨基酸+重组DNA分子DNA多聚氨基酸复合分子 常用：多聚-L-鸟氨酸 多聚-L-赖氨酸该结构：保护外源基因免受核酸酶的降解。刺激宿主细胞提高其摄入能力。,2023/7/10,38,（2）磷酸钙DNA共沉淀法,D重组NA分子+磷酸钙磷酸钙-DNA复合体（沉淀状）作用：同上法
12、。,2023/7/10,39,（3）脂质体法,重组DNA悬浮液+10%矿物油或橄榄油 剧烈振荡 包膜脂质体（内裹DNA分子）稳定性好，对核酸酶具有较好的抗性。,2023/7/10,40,四、转化细胞的筛选,转化处理受体细胞培养基（抗菌素）转化细胞（抗性基因）未转化细胞 培养重组DNA,2023/7/10,41,五、目的基因表达的检测,合成外源基因 蛋白质检测,2023/7/10,42,六、基因工程操作实例,抗除草剂和多价抗虫基因导入水稻光温敏核不育系的研究1.Epsps基因为筛选标记的多价抗虫表达载体构建,2023/7/10,43,1.1 多基因表达载体构建的流程和图谱,2023/7/10,4
13、4,pC1300pCTSM1300pCT-pinII-1pCT-Bt-2pCTSKC3,2023/7/10,45,1.2.载体构建的部分电泳鉴定图谱,图1-6 GNA基因的PCR鉴定Lane1,2:pCTSKC3（460bp）Lane3:pKC-3（460bp）,220bp,1.3 Kb,图1-7 TSP和aroAM12基因的PCR鉴定Lane1:15kb DNA markerLane2,3:TSP sequence(200bp)Lane4,5:Epsps gene(1.3kb),图1-8 Bt 和 PinII 基因的PCR鉴定Lane1:pCTSKC3/Bt gene（300bp）Lane2
14、:pCTSKC3/PinII gene（566bp）Lane3:pKC-3/PinII gene（566bp）,2023/7/10,46,2023/7/10,47,愈伤组织诱导生长过程图,接种7d的愈伤组织,刚接种的愈伤组织,2023/7/10,48,2.2 愈伤组织的转化基因枪法和农杆菌法,2.2.1 材料生长旺盛，结构致密，颜色淡黄的胚性愈伤组织多基因表达载体pCTSKC3，pCAMBIA1300农杆菌株EHA1052.2.2 基因枪转化法转化前，将愈伤组织按每皿25-30块，放置在平皿 中心 2.5cm范围内，然后置于高渗培养基上暗培养 4h。,2023/7/10,49,质粒DNA用量约
15、 25ug/6枪，可裂膜的压力为 7.58MPa，靶材料至可裂膜距离为 6cm,真空度0.08 Mpa，每皿材料 轰击2次。2.2.3 农杆菌转化法质粒DNA转化农杆菌EHA105。菌液OD6000.6，稀释度为 2倍,侵染时间为 30 Min,共培养时间为3d。,2023/7/10,50,2.3 结果与分析,原因,2023/7/10,51,2023/7/10,52,3.1 材料和方法,3.1.1 材料转基因植株基因组DNA；负对照的基因组DNA；正对照的基因组DNA。3.1.2 方法(1)PCRPCR反应条件：94 5 Min，94 45 s，59 1 Min，72 1.5 Min，30个循
16、环后，72延伸10 Min。(2)Southern blot操作流程:基因组DNA酶切 琼脂糖凝胶电泳 转膜 探针制备 杂交 洗膜 显影,2023/7/10,53,3.2.1 部分转基因植株的PCR 检测,M：100bp marker;P：阳性对照（pCTSKC3）;CK：阴性对照；111：转基因植株,2.Bt基因PCR检测（300bp）,4.PinII 基因PCR检测(566bp),3.2 结果与分析,2023/7/10,54,Bt基因的PCR-southern杂交检测M：DNA分子量标记；泳道1：质粒DNA；泳道2：阴性对照CK；泳道3：空白对照；泳道47：转基因水稻植株,Bt基因的Sou
17、thern blot分析泳道1：DNA分子量标记；泳道2：阳性对照pCTSKC3；泳道3：非转基因阴性对照；泳道48：转基因水稻植株,基因组DNA的酶切M1,M2：DNA 分子量标记；泳道1：质粒pCTSKC3/Hind+XhoI；泳道2：非转基因阴性对照/Hind；泳道37：转基因水稻植株/Hind.,3.2.2 部分基因的Southern blot 检测,2023/7/10,55,4.1 盆栽植株离体叶片草甘膦抗性试验,4.3 盆栽植株整株喷洒草甘膦抗性试验,4.2 盆栽植株叶片涂抹草甘膦抗性试验,2023/7/10,56,图4-1 含1.0 mg/L 6-BA的草甘膦处理实验,图4-2
18、不含1.0 mg/L 6-BA的草甘膦处理实验,CK,0 10 20 40 60,80 100 120 140,4.1 植株离体叶片草甘膦抗性试验,4.1.1 草甘膦适宜浓度的选择,材料选取：剪取 1cm长的新鲜绿色叶片片段，放入含一定检测溶液的平皿中，12h光照/12h黑暗，26条件下培养。对照设置：为使叶片在离体环境下保持新鲜的绿色，参考刘巧泉等的方法，在检测液中附加 1.0 mg/L 6-BA，并设置对照组。草甘膦浓度(mg/L)设置：0，10，20，40，60，80，100，120，140草甘膦适宜浓度(mg/L)的确定：0，5，10，20，70，140,2023/7/10,57,图4
19、-3 转基因植株离体叶片草甘膦抗性检测结果（7d后）A:转基因植株叶片；B：非转基因植株对照叶片,140 mg/L草甘膦处理植株 72株，其中 41株叶片受伤非常轻，23株黄斑面积低于1/3；8株黄斑面积占1/2以上。结果说明转基因植株不同程度的表达了草甘膦抗性功能。,4.1.2 转基因植株离体叶片草甘膦抗性检测,2023/7/10,58,4.2 植株叶片涂抹草甘膦抗性试验,取转基因植株叶端部分3 cm左右的部位，用记号笔标记出来，然后涂抹浓度为1218 g/L的草甘膦溶液。,转基因植株叶片草甘膦涂抹抗性检测（7d后）CK：非转基因对照；15：转基因植株,2023/7/10,59,4.3 植株
20、整株喷洒草甘膦抗性试验,用1.8 g/L的Roundup按照17L/100m2喷洒水稻植株30株，每7d喷洒 1次，共喷洒3次。3次后，有 9株转基因植株还正常生长，7株死亡，12株叶片变黄，生长发育缓慢，恢复培养2周后，又有 7株恢复正常生长。,转基因植株喷洒草甘膦28天内叶片变化分析,转基因植株整株喷洒草甘膦抗性检测（28天后）,2023/7/10,60,第三节 转基因植物与植物改良,现代农业生物技术：最有现实意义的技术之一。改革传统植物育种，独创植物新物种、新品种。新的“绿色革命”。,2023/7/10,61,1983，转基因烟草，首次报道。目前，35科，120多个植物种。主要包括农作物
21、、蔬菜、园艺植物、药用植物、果树和树木等。,2023/7/10,62,主要目标：抗病虫害和除草剂，改良农作物和经济作物的重要经济性状，改善品质，创造全新植物种等。迄今为止，40多个种，3000多个转化植物品种的田间试验，在30个国家中进行或已经完成。,2023/7/10,63,转基因植物发展,2023/7/10,64,转基因植物发展水平,阶段1，主要集中于具有重要经济价值的基因的分离与改造；阶段2，培育具有改良的重要经济性状的工程植株；阶段3，培育具有生物反应器功能的工程植株。,2023/7/10,65,一、抗除草剂植物,（一）抗除草剂植物研究现状（二）抗除草剂作物的创制（三）抗除草剂作物的推
22、广应用（四）抗除草剂作物的安全性,2023/7/10,66,（一）研究现状,常用除草剂：草甘膦、草铵膦、磺酰脲类、咪唑啉酮类、溴苯腈等。作用：机械化耕作；减少劳力支出；提高产量问题：选择性差，限制其适用范围。杂草易对除草剂产生抗性。,2023/7/10,67,解决途径,其一，研制新型除草剂。研发费用高；需时较长。8-10年，近1亿美元。其二，培育转基因抗除草剂植物。将抗性基因导入到作物中，培育抗除草剂作物新品种。快速经济，费用为除草剂的1-5%。扩大除草剂的应用范围 延迟抗性形成,2023/7/10,68,1983，第一个抗除草剂烟草问世。1998，美国孟山都，耐草甘膦玉米。2000，美国与加
23、拿大，耐咪唑琳酮类小麦。1997，全球种植面积为690万hm2，1998年1980万hm2，1999年2820万hm2。目前，近300种植物抗除草剂品种，大规模商业化释放的作物有大豆、油菜、玉米、棉花、水稻等。,2023/7/10,69,（二）抗除草剂作物的创制,创制方法多样：基因导入；组织培养；细胞融合；植株差异选择；种子诱变选择；花粉突变选择；传统单株选择。利用转基因技术创制抗除草剂作物是植物生物技术中第1项最广泛采用的技术。转基因抗除草剂作物要求：具有高度抗性；具有优质高产潜力。,2023/7/10,70,1、草甘膦（glyphosate）,销售量最大，使用面积最广，非选择性除草剂。杀草
24、机理：抑制氨基酸生物合成。最早成功作物：大豆，1992。应用作物：大豆、油菜、棉花、甜菜等。,2023/7/10,71,2、草铵磷（glufosinate）,触杀性，非选择性除草剂。杀草机理：抑制谷氨酰胺合成酶最早成功作物：油菜，1989应用植物：油菜、甜菜、甘兰、胡萝卜、马铃薯、番茄、烟草、小麦、玉米、水稻、大麦、高粱、黑麦、燕麦、苜蓿、杨树等。,2023/7/10,72,3、磺酰脲（sulfonylurea）,最早使用，低毒高效，选择性除草剂。残留期长，易产生抗性。杀草机理：抑制蛋白质合成最早成功作物：烟草，1989应用植物：烟草、油菜、棉花、亚麻、玉米、水稻、甜菜、番茄等。,2023/7
25、/10,73,4、咪唑啉酮（imidazolinone),吸收性，选择性除草剂。残留期长。杀草机理：抑制蛋白质合成最早成功作物：玉米，1996应用植物：玉米、小麦、油菜、水稻、烟草、甜菜等。,2023/7/10,74,5、2,4D,生长激素类，有机选择性除草剂。杀草机理：影响激素结合蛋白最早成功作物：大豆，1987应用植物：大豆、棉花、烟草等。,2023/7/10,75,6、喜禾啶（sethoxydim）,禾本科杂草除草剂。杀草机理：抑制脂肪酸合成最早成功作物：玉米，1989应用植物：玉米,2023/7/10,76,7、均三氮苯类（s-triazine）,广谱选择性除草剂。杀草机理：抑制光合作
26、用最早成功作物：油菜，1986应用植物：油菜、烟草、玉米、大豆、水稻、谷子、甜菜、马铃薯等。,2023/7/10,77,小测验,试述植物脱毒的原理及其操作程序。,2023/7/10,78,（三）抗除草剂作物的推广应用,1、主要成功作物2、抗除草剂作物的推广3、抗除草剂作物的优势,2023/7/10,79,1、主要成功作物,大豆、玉米、小麦、水稻、棉花、油菜、亚麻和甜菜。,2023/7/10,80,2、抗除草剂作物的推广,世界抗除草剂作物种植面积3270万公顷，占转基因谷物的74%。美国阿根廷加拿大北美洲：面积最大，应用最早 美国和加拿大为主，大豆玉米油菜棉花拉丁美洲：阿根廷、墨西哥、巴西、乌拉
27、圭欧洲：对转基因作物持否定态度，少量种植。罗马尼亚（大豆）、保加利亚（玉米）、西班牙（玉米）、德国（玉米）、法国（玉米）大洋洲：澳大利亚大面积种植棉花。亚洲：中国、日本,2023/7/10,81,3、抗除草剂作物的优势,巨大的市场和经济效益扩大杀草谱，减少除草剂用量除草剂使用时期灵活、方便对作物和环境安全解决抗性杂草利于耕作改制提高产量、增加收益,2023/7/10,82,4、存在问题,杂草抗性和群落改变前茬作物成为后茬作物田间杂草对生物多样性的影响抗性基因转移，形成超级杂草人们的认识与接受程度,2023/7/10,83,（四）抗除草剂作物的安全性,杂草抗性和群落改变前茬作物成为后茬作物田间杂
28、草对生物多样性的影响抗性基因转移，形成超级杂草人们的认识与接受程度焦点：转基因抗除草剂作物食品的安全性,2023/7/10,84,二、抗虫植物,虫害导致损失数千亿美元，化学杀虫剂使用为主要措施。化学杀虫剂危害：成本200亿美元 第一，害虫产生抗性。第二，对其他生物的危害。第三，对环境的影响。世界要求控制化学杀虫剂的使用。,2023/7/10,85,控制使用化学杀虫剂的途径,一是用生物杀虫剂替代化学杀虫剂；二是培育抗虫植物新品种。培育抗虫植物的优点：长远效果，成本较低。抗虫效果好。专杀 安全性高。基因难扩散 保护作用范围广。全株抗性,2023/7/10,86,转基因抗虫植物概况,目前，实现转化的
29、物种有农作物、园艺和林果类植物，如：水稻、棉花、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、马铃薯、西红柿、大白菜、甘蓝、茄子、甘蔗、苜蓿、咖啡、香蕉、苹果和杨树等。其中转Bt、胰蛋白酶基因的棉花、大豆、玉米、西红柿和马铃薯已经大规模商业化释放；转基因杨树已获得中国政府的释放许可，目前正在生产中推广。,2023/7/10,87,1、Bt毒蛋白基因,苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）产生的毒蛋白可专一性毒杀鳞翅目、鞘翅目或双翅目昆虫，而对人、畜和其他生物无害。20世纪80年代以来，获得转Bt基因抗虫植物。烟草、棉花、玉米、水稻、马铃薯、杨树等。1998，我国抗虫棉，10万亩。Bt
30、毒蛋白基因是目前世界范围内使用最广泛、最有潜力的一个抗虫基因。,2023/7/10,88,Bt毒蛋白基因应用缺陷,一、抗虫谱窄二、昆虫易产生抗性。,2023/7/10,89,相应措施,抗虫基因本身的利用 措施转基因抗虫植物的种植,2023/7/10,90,Bt毒蛋白基因的利用,分离新的Bt毒蛋白基因。对其分子改造，提高其表达量。多基因转化。使其特异表达。用不同表达水平来控制。高表达量杀死昆虫；低致死量抑制昆虫，利于天敌捕食。,2023/7/10,91,转基因抗虫植物的种植,轮换法：抗虫基因植物与化学杀虫剂交替使用，使毒素基因表达产物对昆虫的选择压力间断：避护法：转基因植物与非转基因植物混播，使
31、抗虫昆虫品系难以发展；淘汰法：在昆虫抗性产生以前，淘汰此种抗虫植物。,2023/7/10,92,2、蛋白酶抑制剂基因,proteinase inhibitor gene，PI 基因多存在植物的种子和块茎中。作用机制：PI抑制剂+昆虫的蛋白消化酶 酶抑制剂复合体 阻断或减弱蛋白水解作用昆虫对食物的消化吸收昆虫非正常发育和死亡。,2023/7/10,93,常用蛋白酶抑制剂基因,豇豆胰蛋白酶抑制剂（cowpea trypsin inhibiter，CpTI）广谱抗虫，抗鳞翅目、鞘翅目害虫等，几乎对所有害虫有效，但对人畜无害。害虫难产生耐受性。烟草、甘薯,2023/7/10,94,马铃薯蛋白酶抑制剂（
32、potato proteinase inhibitor，PPI）一类损伤诱导性表达的基因产物，可抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性。烟草。水稻巯基蛋白酶抑制剂（oryzacystatin inhibitor）主要抑制鞘翅目和半翅目昆虫消化管内的半胱氨酸类蛋白水解酶。研究最活跃，已获得抗棉铃虫和黄粉虫转基因植物。,2023/7/10,95,3、-淀粉酶抑制剂基因,广泛存在禾谷类作物和豆科作物种子中，能阻断哺乳动物和昆虫对淀粉成分的消化。转菜豆-淀粉酶抑制剂基因烟草，表现对烟草黄粉虫抗性。该基因不能用于由于生食的农作物中。,2023/7/10,96,4、其他抗虫基因,植物凝集素基因（lectin）豆
33、科种子蛋白粒，肠道细胞糖蛋白结合，影响营养吸收并破坏结合细胞。转基因玉米，玉米螟抗性强。毒副作用不清。,2023/7/10,97,几丁酶 消化甲壳虫的甲壳而杀虫。对人物毒害。转基因马铃薯。特殊茸毛 特殊马铃薯茸毛，黏附昆虫。,2023/7/10,98,三、抗病植物基因工程,1.抗植物病毒：病毒病损失极大。但无有效药物防治。有效途径：通过转基因技术，培育抗病毒植物。防治机理：在转基因植物体内，病毒浸染后繁殖速度大大下降，或推迟发病时间，从而减轻危害。,2023/7/10,99,植物病毒分类,依据其基因组成分5大类：单链DNA病毒、双链DNA病毒、正链RNA病毒、负链RNA、双链RNA病毒。正链R
34、NA病毒最多，占全部的75%，如烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯Y病毒（PVY）等。,2023/7/10,100,迄今，大量转基因抗病毒植物获得成功，如抗病毒的烟草、水稻、小麦、黄瓜、马铃薯、番茄、胡瓜、木薯、香蕉和苜蓿等。商业性释放：烟草、番茄、马铃薯和胡瓜。我国：烟草、马铃薯、黄瓜、番茄等,2023/7/10,101,（1）、外壳蛋白介导的抗性,利用转病毒外壳蛋白基因使转基因植物获得抗性，其原理源于植物交叉保护学说。所谓交叉保护，指预先感染过弱毒性病毒株系的植物可以在一定程度上对同类强毒性病毒株系的浸染产生抗性。,2023/7/10,102,1986，美国Beach，TMV外壳蛋白基因转入烟
35、草，降低TMV浸染，并延迟发病1230天。目前，烟草、番茄、苜蓿、马铃薯、黄瓜等。,2023/7/10,103,存在问题,主要表现推迟发病，难以保证全生育期抗性。病毒随种子传播的可能性。可能包装编码序列，形成新病毒。,2023/7/10,104,（2）、反义RNA介导的抗性,在真核和原核生物中，与翻译蛋白质的mRNA序列互补的RNA分子称为反义RNA，而用来翻译蛋白质的mRNA分子称为正义RNA。反义RNA+正义RNA双链分子 阻碍翻译，导致基因产物的减少；,2023/7/10,105,该双链RNA分子容易降解，造成特定mRNA数量减少。转化烟草，但抗性较低。,2023/7/10,106,（3
36、）、卫星RNA介导的抗性,卫星RNA是指一种在复制和包装时需要依赖其他病毒的小分子RNA。卫星RNA可以干扰和抑制辅助病毒的复制，还能改变由辅助病毒所引起的寄主植物的病状。因此，可以把卫星RNA转入植物从而获得抗病毒的转基因植物。,2023/7/10,107,2.抗细菌病,（1）利用抗菌肽B基因。Ju.J、黄大年、简玉瑜等均将该基因转移到水稻，其后代表现抗水稻白叶枯病。（2）利用反义RNA。阔叶树种如杨树、樱桃等极易感染冠瘿病，该病是农杆菌感染所致。将激素基因和细胞分裂素基因的反义RNA转移到杨树，获得抗冠瘿病的转基因树。,2023/7/10,108,3.抗真菌病,（1）利用几丁质基因和1.3
37、-葡聚糖酶基因。Lin.W等人将该基因转移到水稻，转基因水稻抗纹枯病。.等人转移到榆树和栗树，其后代表现抗枯萎病。将其转移到高粱，其后代表现抗茎腐病，转移到小麦，其后代抗纹枯病。,2023/7/10,109,（2）天蚕素基因。Tasik.W将天蚕素基因转移到马铃薯，其后代抗青枯病和软腐病。,2023/7/10,110,四、改良品质,油菜、向日葵、甘蓝和亚麻：不饱和脂肪酸番茄、西瓜和草莓：口味；保存时间水稻和小麦：蛋白质水果：糖分咖啡：口味；产量；咖啡因农作物和牧草：放绿时间,2023/7/10,111,1、改良营养品质,（1）提高大米的维生素含量（2）提高食物的含铁量（3）提高油酸的含量（4）
38、改变氨基酸的成分,2023/7/10,112,（1）提高大米的维生素含量Ye.x,AL-babilis等人把维生素A合成所需的psy、Cntl和Lcy基因转移到水稻中，水稻胚乳中合成了维生素A，解决了因水稻不能合成维生素A而导致长期以大米为生人群易患缺素症的难题。,2023/7/10,113,（2）提高食物的含铁量,Goto等人将大豆铁蛋白合成基因转移到水稻，使水稻胚乳中的有效铁的含量大大提高。日本科学家将大豆铁蛋白基因转移到生菜中，使转基因生菜中铁含量是一般生菜的2倍。,2023/7/10,114,（3）提高油酸的含量,Kutzon将硬脂酸去饱和酶反义基因转入油菜，使油菜硬脂酸含量提高了十多
39、倍。Mazur等人将该反义基因转移到大豆，获得油酸含量85%的大豆新品种，油酸含量较原来提高了3.4倍。,2023/7/10,115,（4）改变氨基酸的成分,美国科学家人工合成富含人类必需赖氨酸的贮藏蛋白基因转移到地瓜中，得到的转基因地瓜中的蛋白质含量较对照增加2.5倍，人类必需氨基酸提高5倍。,2023/7/10,116,转基因油菜种类,2023/7/10,117,2.提高牧草的营养品质,（1）提高饲料的营养品质。Tabe等人将富含硫的向日葵清蛋白基因（SSA）转移到苜蓿中并得到表达。清蛋白在叶片中占可溶性蛋白的0.01%。Khan等人将SSA基因转移到白三叶草中，白三叶草新叶含清蛋白量占蛋
40、白总量的0.1%，老叶中高达1.3%。,2023/7/10,118,（2）提高饲料的消化率。肉桂酸脱氢酶（CAD）是催化木质素单糖合成的关键酶，将其反义基因转移到苜蓿中，降低了苜蓿中的木质素含量，提高了其纤维素的含量，促进了苜蓿的消化和利用。,2023/7/10,119,3.改良植物的储藏和加工品质,（1）改良番茄的贮藏品质。番茄放的时间长会出现变软米兰的现象，其原因是多聚半乳糖醛酸酶酶解果皮细胞壁所致。美国科学家将多聚半乳糖醛酸酶的反义基因转移到番茄，抑制了该酶的活性，获到耐贮藏的番茄。,2023/7/10,120,果蔬贮运损失达40%60%。延迟成熟、防止软化的目的，利于保鲜和贮运。最佳例
41、证：转基因番茄。1994，美国，转基因番茄，货架期长达152天。每年达35亿美元。华中农业大学，转基因番茄已审定。,2023/7/10,121,（2）改变树木的木质素成分,针叶树木质素结构致密，属邻甲氧苯基木质素（G-木质素），木纤维好，是造纸的好原料。但酸解成本高，易造成环境污染。阔叶树木质素是G-木质素与S-木质素（丁香醇基木质素）聚合而成。这种G/S木质素松软，易制浆。Tillman等人将S木质素基因转移到针叶林树木，获得了G/S木质素的针叶树。,2023/7/10,122,（3）抑制木质素基因的表达,肉桂醇脱氢酶和5-羟阿魏酸-O-甲基转移酶基因对木质素合成基因漆酶基因（聚合成多聚体，
42、形成木质素）。等人将其反义基因转移到杨树、桉树和云杉,获得低木质素高纤维素的转基因树。,2023/7/10,123,4、改良棉花纤维品质,我国：兔角蛋白基因转化棉花兔毛棉 纤维质量很好，具有兔毛般的光泽。转基因五彩棉花具有天然艳丽色彩。,2023/7/10,124,五、抗逆植物,培育抗盐碱、抗干旱、抗水涝、抗冻、抗紫外线和重金属盐的优良植物，扩展生存空间，改善地球生态环境。,2023/7/10,125,1、抗旱抗盐植物,干旱、高盐碱使植物细胞脱水，减产或死亡。沙漠 盐碱地目前，已分离克隆出许多与抗旱耐盐有关的基因：如脯氨酸合成酶基因、1-磷酸甘露醇脱氢酶基因、甜菜碱基因、果聚糖-蔗糖酶基因等。
43、转基因烟草、草莓、水稻等表现一定的抗旱抗盐能力。,2023/7/10,126,Overbaugh等人将谷胱甘肽还原酶基因转移到杨树，获得抗干旱的转基因树。郭岩等人将（甜菜碱醛脱氢酶）基因转移到水稻，获得在含盐量0.5%的条件下生长的转基因水稻。,2023/7/10,127,2、抗寒植物,低温、冻害造成极大损失。传统抗冻害方法：熏烟、覆盖、灌水、保护地种植及喷洒生长调节剂等根本途径：培育抗寒植物。目前，已获得的转甘油-3-磷脂酰转移酶基因植物包括烟草、水稻、甜椒、玫瑰等，都表现出一定的抗寒特性。高寒水域的鱼类抗冻蛋白烟草和番茄,2023/7/10,128,Georges把来自比目鱼的抗冻基因AF
44、Ps(antifreeze proteins)转到番茄，并得到表达，这种转基因番茄果实冷冻后不坏死。Wallis将该基因转移到马铃薯也获得同样结果。黄永芬等将该基因转到番茄，获得在低温条件下生长旺的转基因番茄，致死温度较对照降低了2度。,2023/7/10,129,六、观赏植物,生物技术被广泛运用于控制观赏植物的叶花色、花数、花形、香味、花期等性状，这是植物产业中的一个重要领域。荷兰，基因工程观赏植物年销售额1.5亿美元。玫瑰、矮牵牛、康乃馨、郁金香、菊花等；基因工程奇花异草。,2023/7/10,130,七、植物生物反应器,利用转基因植物来替代微生物发酵来生产出人类所需要的各种原料已成为现实
45、。具体内容详见第五章。,2023/7/10,131,八、基因工程与常规育种技术,植物基因工程技术实行DNA水平上的操作，可打破物种间有性杂交的障碍，创造出更具丰富和更优越的新性状植物。但这只是育种程序中创造变异的一个环节革新，对其变异后代必须根据育种目标进行严格的选择，使其稳定。基因工程创造的变异后代尝试一些具有特定性状的种质材料，需常规杂交育种技术进行改良。因此，植物基因工程不能替代常规育种技术，只能与常规育种技术紧密结合，相互补充，长期共存，共同发展。,2023/7/10,132,第四节 转基因动物及应用,转基因动物工程目标：基因研究的需要。提高动物的生产性能。动物生物反应器。,2023/
46、7/10,133,动物基因工程的应用范围,1、控制动物传染病 专一性生物技术疫苗：猪Scours、羊蹄溃烂、绵羊麻疹和鸡Bursal病等。2、增加产量牛生长激素（BGH）：奶牛、绵羊、猪、鱼贝类奶25%；净重15%；瘦肉率10%。3、改良品质高瘦肉率猪；高产毛率绵羊。4、药物生产反应器 转基因动物：药品、器官移植,2023/7/10,134,一、转基因鼠,转基因鼠被称为哺乳动物的“大肠杆菌”和“酵母”，是动物研究的模式生物。常规模式生物 微生物：大肠杆菌、酵母 植物：拟南芥、玉米 动物：小鼠,2023/7/10,135,转基因鼠的应用,1、构建疾病动物模型有效的测试疾病治疗方案系统。老年性痴呆
47、症、关节炎、肌肉营养缺乏症、肿瘤发生、高血压、神经衰变症、内分泌功能障碍、动脉硬化症等等。2、克隆基因3、研究细胞的功能4、作为外源基因的表达系统,2023/7/10,136,二、转基因鱼,研究目标：培育生长快、个体大、抗性强、品质好的新型鱼类养殖品种。1985，朱作言，人生长激素基因，金鱼。国际，大马哈鱼生长激素基因，36倍特大型鲑鱼。目前，转基因鱼：金鱼、鲫鱼、鲤鱼、鲶鱼、鲑鱼、蹲鱼、大马哈鱼、鳅鱼、罗非鱼、泥鳅、鲂鱼等。,2023/7/10,137,三、转基因家畜,转基因家畜应用范畴：提高生产性能 增强抗病性 器官移植 药物生产 特殊疾病模型构建现阶段主要目的：作为生物反应器，高效生产人
48、类所需要的产品。,2023/7/10,138,1、转基因牛,1）乳腺生物反应器 奶牛年产1,000升，35克蛋白质/kg。转人干扰素基因、乳铁蛋白基因奶牛，生产医用蛋白，成本降低1万倍。2）改变牛奶的成分。转k酪蛋白基因奶牛；转乳糖酶基因奶牛，牛奶不含乳糖。3）提高产奶量 转牛生长激素基因奶牛，产奶量提高14%。,2023/7/10,139,转基因牛存在问题,母牛每胎产仔数少，一般一头；产仔周期长，约2年；转基因相对操作困难。因此，制备转基因奶牛的技术有待进一步改进。,2023/7/10,140,2、转基因羊,目前，转基因羊研究主要集中：乳腺生物反应器生产药用蛋白。与牛相比，羊的特点：产奶量稍
49、低；繁殖快、饲养方便；转基因操作更容易；成本低。1991，white，抗胰蛋白酶基因，4雌1雄绵羊。含量1-35gL。肺气肿 抗胰蛋白酶、凝血酶原激活酶、凝血因子IX、纤溶酶原激活酶、生长激素、白细胞介素2、尿激酶等转基因绵羊和山羊。,2023/7/10,141,3、转基因猪,1）血液生物反应器转人血红蛋白基因猪，与天然的人血红蛋白性质完全相同，辅助输血。2）器官移植猪器官大小与人类的比较一致。转基因猪生产人类医疗移植的器官。（狼心狗肺，猪脑子，狗腿子）,2023/7/10,142,四、转基因家禽,转基因家禽研究很困难。转基因鸡鸟类繁殖系统特殊：受精卵为多细胞（6,000）1）转基因鸡改进现有
50、品种的遗传特性 提高抗病性和改良生产性状。2）利用转基因鸡生产药用蛋白 卵清蛋白，分离到所需的外源蛋白。转禽类白血病病毒的外壳蛋白基因的转基因鸡，,2023/7/10,143,五、转基因动物的应用前景,首先，生物安全性检测。其次，公众的接受能力。转基因技术正给养殖业带来一场新的革命。生产彩色羊毛的高产转基因羊。,2023/7/10,144,思考题,名词 基因工程、载体、目的基因转化、交叉保护、转基因生物、反义RNA、卫星RNA基因工程诞生的理论和技术基础？基因工程常用的工具酶有哪几类？#基因载体的实质是什么？基因载体如何分类？理想的基因载体具有哪些特点？#基因操作中常用的基因载体有哪些？#基因
