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1、一、原生质体分离二、原生质体分离及纯化操作三、原生质体培养四、体细胞杂交（原生质体融合）,五、原生质体的遗传饰变,第三节、植物原生质体技术及应用,（一）体细胞杂交的含义及研究历程概念：不同亲本（种间或属间等）的原生质体，在人工诱导下，相互接触，从而发生膜融合、胞质融合、核融合并形成杂种细胞，经过培养进一步发育成杂种植株。这一过程称为原生质体融合或细胞杂交。,使植物无性杂交成为可能使有性杂交根本无法获得的种间、属间、科间远缘杂种成为现实打破了物种间的界限,原生质体融合的意义,植物体细胞杂交的几个重要进展,1960年 Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；1971年 Takebe首
2、次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；1972年 Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物体细胞杂种；1974年 Kao将聚乙二醇（PEG）诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；1978年 Melchers获得第一个属间体细胞杂种（番茄马铃薯）；1981年 Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；1987年 Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。,（二）植物细胞融合的程序：,原生质体分离的分离、纯化,融合方法选择,杂种细胞的筛选,愈伤组织形成、分化植株再生,杂种植物的鉴定,原生质体融合的方法,聚乙二醇 PEG）,化学
3、方法,仙台病毒(Sendai virus),NaNO3处理,高pH-高浓度Ga2+,飞秒激光诱导融合,电融合,空间细胞融合,（1）电融合法：指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。,电融合特点：效率高 对原生质体伤害性小 对融合细胞数易于控制,方法：微电极法和双向电泳法,双向电泳法：通过电泳，两细胞膜紧密接触，且膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白的类脂区。,电融合仪,Fusion phases of oat（燕麦）protoplasts(Avena sativa),微电极法：指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬
4、间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。,实际操作：先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置于100V/cm的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成项链状排列；,完整烟草原生质体（40）原生质体成串（40）,微电极法：,再用15V/cm直流电脉冲/微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的形成。,1、原生质体在诱融剂或正弦电场作用下凝集，彼此靠近；2、两个相邻原生质体之间的质膜相互融合，随后两个亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等成分也在融合后的质膜上重新分布；3、细胞质发生融合；4、细胞核发生
5、融合，形成单核融合细胞。,融合过程：,（2）聚二乙醇 诱导融合法,PEG融合的机理：PEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键。当PEG分子链足够长时，它在相邻原生质体表面之间有分子桥、改变膜表面物理化学性质和增加类脂膜流动性作用，引发原生质体的粘连。当PEG分子被洗脱后，膜上的电荷便重新分布，从而导致原生质体融合。,PEG的选用：一般选择相对分子质量为4000获6000,PEG 对细胞有毒害作用，用离子交换树脂纯化可消除其对细胞的毒害作用。,优点：成本低、不需要特殊的设备；融合子产生的异核率高；融合过程不受物种限制,缺点：融合过程繁琐、PEG可能对细胞造成
6、毒害,PEG融合所需试剂,融合液：pH 5.6 CaCl2 2H2O 810mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.51.0mol诱导液：融合液PEG 2045稀释液：A液（g/100ml）pH6.0 B液(g/100ml)pH10.5 葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169,PEG法的流程,P1,P2,P1 P2,融 合,融合液,稀 释,洗 涤,培 养,选 择,盐类融合剂种类硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2氯化物类：NaCl、CaCl2、MgCl2、BaCl2葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠盐类
7、融合的优缺点优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合,（3）盐类融合法,（4）高Ca2+和高pH值融合,Ca2+浓度 0.05 mol/L,取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的比例混合;加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇;再用甘氨酸钠缓冲调节pH值到10.5，成为融合液，同时在37下保温0.5h;用0.4mol/L甘露醇洗净高CaCl2和高pH值；两种原生质体的融合率达到10%。,（5）生物诱导融合法仙台病毒法,仙台病毒是一类被膜病毒，属于附黏液病毒族，它是多形性颗粒，直径为5060 nm，由两层磷脂组成
8、的外膜包裹着RNA和蛋白质复合体，外膜上有两种糖蛋白，一种是HANA蛋白质，一种是F蛋白质，前者具有神经氨酸酶和血凝活性（分子量较大），后者具有融合和溶血作用（分子量较小）。诱导细胞融合的机理：病毒被膜上的两种糖蛋白可和细胞膜表面的糖蛋白发生相互作用，从而使两个细胞可以互相接触，在电镜下观察到在相接触的相邻细胞表面之间将产生一些微小的细胞质桥。随着时间的推移，细胞质桥数量和桥的体积也在增加，最后相邻细胞的细胞质就结合在一起了，形成细胞凝集块再通过膜上蛋白质分子的重新排列，使膜中脂类分子重排而打开质膜，最后导致细胞融合。,利用仙台病毒诱导细胞融合的步骤：（1）先将亲本细胞（待融合的细胞）分别制成
9、悬浮液、混合离心；（2）将沉积细胞悬于灭活的仙台病毒悬液里，在4oC低温下摇动20分钟，使细胞形成凝集块；（3）再将温度升至37oC，间歇摇动30分钟，使其融合；（4）洗去病毒，将融合细胞浮于选择性培养基进行培养。由于4oC低温利于细胞聚集，在融合时需要提高温度，否则融合不会发生。,2.细胞融合的类型,根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合分为两大类：对称融合和非对称融合,对称融合：两个完整的细胞原生质体的融合非对称融合：利用物理或化学的方法使某一亲本的核或细胞质失活后再进行融合。融合的结果是获得非对称杂种，即两融合亲本对杂种细胞的遗传组成的贡献是不对等的。,3 杂种细胞的选择,互补选择：,双
10、荧光标记选择法：,机械选择法：,互补选择：利用两个亲本具有不同遗传和生理特性，在特定培养条件下，只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。,互补选择方法：A、白化互补选择法 B、营养缺陷型互补选择 C、抗性互补选择 D、代谢互补抑制选择,A、白化互补选择法,以矮牵牛为例：,白化苗原生质体1,白化苗原生质体2,杂种细胞,限定培养基,绿色愈伤组织或幼苗杂种,融合,B、营养缺陷型互补选择,Gly-型细胞,Pro-型细胞,融合,Gly-、Pro-培养基,杂种细胞,培养,C、抗性互补选择,抗A不抗B型细胞,抗B不抗A型细胞,融合,含A、B培养基,杂种细胞,D、温度敏感型选择,耐高温不耐低温型细胞,耐
11、低温不耐高温型细胞,融合,高温下培养,低温下培养,杂种细胞,机械选择法：利用天然存在或是人为造成的两个亲本在物理特性上的差异即可见标记，进行筛选。利用或人为的造成细胞生长或分化能力上的差异进行筛选。做法：在倒置显微镜下，用微管将融合细胞吸取出来进行培养的方法。,双荧光标记选择法：使用两种不同的荧光染料给双亲原生质体染上不同的颜色，然后借助不同的荧光标记，在显微镜下进行筛选。,无叶绿体的原生质体,含叶绿体的原生质体,FITC标记,苹果绿荧光,红色荧光,荧光显微镜,杂种细胞,异硫氰酸荧光素（FITC）异硫氰酸罗丹明（RITC）,（三）杂种植株的再生和鉴定,植物原生质体融合及再生植株过程,杂种植株的
12、鉴定方法：,（1）杂种植物形态特征、特性鉴定（2）杂种植物的核型分析（3）同工酶分析（4)分子标记鉴定：RFLP、AFLP、SSR、ISSR、RAPD标记鉴定,形态学鉴定,形态标记即植物的外部特征，如花的形状及颜色、果实(种子)的形状及颜色、叶型、表皮毛、株型、穗型、千粒重、耐逆性以及对疾病的抗性等。形态标记简单直观，但是标记少、多态性差、易受环境条件和其它修饰基因的影响，并且许多性状为数量性状，由几个位点控制，表现为一个范围，而不是简单的性状差异。,杂种植物的核型分析,细胞标记主要包括染色体核型(染色体数目、大小、随体、着丝点位置等)和带型(C带、N带、G带等)。细胞学标记位点较少，而且对于
13、亲缘关系较近的物种，由于细胞学标记差别不明显，所以很难根据细胞学特征来区分。,18条染色体,36条染色体,同工酶标记,同工酶为共显性，父本和母本的基因可以同时在后代中表达，不受环境因素影响，中仅有相对稳定;分析操作简便，所需材料较少;不足之处是位点数较少，植物1020种同工酶表现出位点的多态性，覆盖的基因组范围有限。,染色体原位杂交,染色体原位杂交（Genomic in situ hybridization，GISH）是一项利用标记的DNA探针与染色体上的DNA杂交，在染色体上直接进行检测的分子标记技术。通常用同位素或生物素、地高辛标记的DNA探针与染色体DNA杂交，通过放射自显影或通过抗原抗
14、体反应，在荧光显微镜下观察DNA探针与其互补的DNA序列结合的位置。最大优点是可以显示在体细胞杂种中哪条染色体来源于这个亲本，哪条染色体来源于另一个亲本，因而更准确、直观。,分子生物学标记,植物的分子标记主要有RAPD、RELP、AFLP、SSR、ISSR等。,（四）原生质体融合的应用,白菜,甘蓝,白菜甘蓝,植物体细胞杂交克服了植物远源杂交不亲和的障碍，在培育新品种方面具有广阔的应用前景。,目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，获得了有价值的新品系或育种上有用的新材料。,番茄+马铃薯,1978年德国科学家梅歇尔斯等人把马铃
15、薯(potato)和番茄(tomato)的原生质体融合获得了体细胞杂种“泡马豆”（pomato)杂交株同时具有马铃薯和番茄的一些形态特征，但没有产生可结实的花、果实和真正意义上的块茎，不能产生经济效益。主要原因：生物的基因表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，杂交株具有两个物种的遗传物质，但表达互相干扰。,泡马豆（pomato）,动物细胞和植物细胞之间能不能杂交？,五、原生质体的遗传饰变,1.原生质体的遗传转化指以原生质体为受体，通过一定途径或技术奖外源基因导入植物原生质体，获得能使外源基因稳定表达的转基因植株的技术。,常用方法：PEG介导转化法 电击穿孔转化法 农杆菌共培养转化法,细胞核移植原生质体摄取分离的细胞核是转移和基因组的一条可行的途径。,细胞核的分离：匀浆法,核移植的方法：夹层离心法、PEG法、脂质体包裹融合移植法、显微注射法,3.叶绿体移植,意义：有助于更精确地研究细胞器遗传学和种间细胞器互作。有助于进一步弄清叶绿体的发育生物学及核和叶绿体DNA如何控制叶绿体的发生。在应用研究方面，有可能用于植物光合效率的改良,方法：用机械法或原生质体分离法获得叶绿体；以白化突变体或无叶绿素的细胞作为受体，进行移植，经培养获得叶绿体移植的再生植株。,
